专利名称：抗原特异性lgG的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测定体液中G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起温孵所述的样品(其中的两种受体都能特异性地结合到抗体上，R1被结合或者可以被结合到固相上，而R2携带一个标记)，从液相中分离出固体以及测量所述的标记(其中由待测定的抗体特异性识别的呈单体形式的结合配偶体和标记的缀合物被用作R2)来实现。
具体地说，本发明涉及一种在有IgM类免疫球蛋白存在下，特异性地检测IgG类免疫球蛋白的方法。
为了对外源物质的引入产生响应，哺乳动物生物体的免疫系统产生了亦被称为免疫球蛋白的抗体。它们防御亦被称作抗原的外源物质。可以把免疫球蛋白划分为五个不同的种类。人们在M，G，A，E和D类的免疫球蛋白之间进行划分。这五类免疫球蛋白的每一种都在重链的组成上有所不同，被称作μ、γ、α、ε和δ链。
每一类免疫球蛋白在生物体中都具有不同的功能。随着与抗原的第一次接触、即所谓的第一次免疫接种，出现了M类免疫球蛋白。但是，随着感染的进行，这些免疫球蛋白的浓度迅速降低。G类免疫球蛋白在第一次免疫接种之后首先缓慢地形成，并且当用同一抗原进行第二次感染时大量地出现。A类免疫球蛋白是在生物体的粘膜表面上发现的，并且它决定着该处的防御过程。E类免疫球蛋白主要导致过敏反应。D类免疫球蛋白的确切功能迄今仍是未知的。
在血液中，各个种类的免疫球蛋白存在的浓度差别非常大。因此，G类免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中的主要种类，其份额约为75％，这对应于8至18mg/ml的血清含量。第二种最频繁出现的免疫球蛋白为IgA，它的平均血清浓度为0.9至4.5mg/ml。M类免疫球蛋白存在的浓度为0.6至2.8mg/ml，D类免疫球蛋白存在的浓度为0.003至0.4mg/ml。IgE抗体的比例是最低的，它在血清中仅以0.02至0.05μg/ml的浓度存在。
为了有区别地诊断许多的疾病，重要的是检测对具体的抗原具有特异性的一类或几类非常具体的免疫球蛋白的抗体。仅仅可以通过种类-特异性抗体测试或者通过排除某些种类的免疫球蛋白的存在(例如，检测IgG和IgA抗体、而不检测IgM抗体)来保证对病毒、细菌和寄生虫感染的令人满意的诊断。这对于区分新近的或者急性的感染和更早些时候已经发生的感染以及对于临床监测感染的过程来说是特别重要的。抗体的种类-特异性检测对HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、弓形体病病毒、风疹病毒和衣原体的感染来说尤其重要。对于测定保护抗体的滴度以及检查免疫接种的成功来说，特异于具体抗原的抗体的种类-特异性检测也是必需的。因此从诊断的观点来看，在尤其检测感染的非急性期的抗体(比如IgG和IgA抗体)方面有很大的兴趣。
在现有技术中，已经描述了多种用于检测对抗原具有特异性的具体种类的抗体的方法。因此，通过把特异性抗体结合到用特异性的抗原包被的固相上，频繁地检测具体种类的抗原-特异性抗体。通过把特异性地针对某类人Ig的抗体结合到待检测的Ig分子上，检测特异于抗原的、目前被结合到固相上的免疫球蛋白(Ig)。给针对人Ig的抗体提供一个标记，借此进行检测。但是，这样的一种测试方法仅在下列情况下是可能的，即如果在与针对人Ig的种类-特异性标记的抗体反应之前，通过洗涤除去所有的非特异性非结合的Ig。因此，作为通常需要的、用于自动系统的一步测试方法是不可能的。
根据在美国专利4,292,403中所述的方法，通过把种类-特异性抗体固定化在结合待测定的样品抗体的固相上、随后加入特异性抗原并把已结合的抗原结合到进一步进行了标记的对所述抗原具有特异性的抗体上，检测具体种类的免疫球蛋白的抗原-特异性抗体。但是，该方法的缺点为待测定种类的所有抗体都必须结合到固定化的种类-特异性抗体上。而样品抗体并不是对抗原特异性地结合着。这就可能减小了测试的灵敏度，因为对抗原-特异性抗体而言可能不存在足够的游离的结合位点。在这种测试方法中，几个洗涤步骤也是必需的。这种方法不能实现一步测试方法。
由所谓的桥测验Brückentest提供了以一步测试进行抗体检测的一种可能性。在EP-A-0 280 211中描述了桥测验的概念。在该方法中，把能够特异性地结合到待测定的抗体上的第一受体(比如抗原)结合到固相上。待测定的抗体结合到固相-结合的抗原上。此外，在测试混合物中存在另一种提供了标记的特异性抗原。通过标记来检测抗体。在这种测试中，检测了所有的抗原-特异性抗体、而不仅仅是具体种类的抗体。
在EP-A-0 307 149和美国专利5,254,458中，公开了以桥测验原理为基础的用于检测特异地针对抗原的抗体的方法。在这一情况下，使用从抗原的某个表位得到的、经重组生成的肽来结合待检测的抗体。把肽固定化到固相上。样品抗体结合到肽上。把进一步进行了标记的肽结合到样品抗体上以进行检测。为了增加试验的特异性，在不同的生物体中表达重组肽。另外在这种方法中，所有种类的抗体都结合到肽上。例如，这就不可能在IgG和IgM抗体之间加以区别。
EP-A-0 386 713描述了一种使用两种固体载体检测抗HIV的抗体的方法，其中把不同的HIV抗原固定化到两种固体载体上，使它们各自与样品的等分试样和标记的HIV抗原接触，其中通过在至少一次试验中的阳性反应来检测抗体的存在。公开了作为HIV抗原的经重组生产的多肽。在EP-A-0 627 625中公开了一种以Western印迹为基础的方法，其中通过重组蛋白或合成肽也可以检测HIV抗体。但是，这两种方法都不能实现抗原-特异性抗体的种类-特异性检测。
先有的方法不能使某类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体以一步法进行检测。从现有技术的状态已知的、以桥测验概念为基础的(其中使用了标记的抗原和能够结合到固相上的抗原)检测的免疫学方法的确能够进行一步试验。但是迄今为止，利用这一简单的原理，仅仅已经可能共同检测出IgG和IgM类的抗体。
因此，所述的目的为提供一种用于检测针对特异性抗原的非急性感染的抗体的改进方法、即具体地讲为IgG类。与此同时，该方法应当保证特异性相同的IgM抗体不被检测到。为了在自动系统中有利地使用，该方法应当优选地由一步试验的原理组成。
这一目的是通过根据本发明用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法来实现的，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起温孵所述的样品(其中的两种受体都能特异性地结合到抗体上，R1被结合或者可以结合到固相上，而R2携带一个标记)来实现，其特征在于由待测定的抗体特异性识别的呈单体形式的结合配偶体和标记组成的缀合物被用作R2。
本发明的方法可以进行样品中G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的测定，其中存在着抗原-特异性相同的IgM类抗体。
存在于样品中的与待检测的IgG抗体具有同样特异性的IgA，IgD和IgE抗体以低于IgG抗体浓度很多的浓度存在。具体说来，IgD和IgE类以低于IgG浓度几个数量级的浓度存在，从而在该检测方法中它们的反应性没有或者几乎不改变测量的结果。IgA抗体以对应于总IgG含量的大约10％的浓度存在。因而在该方法中，推测还将测量到IgA抗体。由于所述方法的主要目的为检测非急性感染的抗体，因此同为非急性感染的两种抗体、即IgG和IgA抗体的共同的检测就并不重要了。由于IgG抗体是非急性感染中主要种类的免疫球蛋白，因此在下文中使用术语IgG检测。必需做到的是，必需不检测出仅在急性感染中大量存在的抗原特异性相同的IgM抗体。
结果已经令人吃惊地弄清楚的是根据本发明在以双-抗原测试原理为基础的桥测验中呈单体形式的结合配偶体的用途使得能够仅仅检测出特异地针对具体抗原的IgG类抗体。存在于同一样品中的特异性相同的IgM类抗体令人吃惊地与单体肽不反应或者仅仅在可忽略不计的微弱的程度上反应，从而不干扰IgG的检测。术语“可忽略不计的微弱的”是指IgM抗体的抗原结合位点被呈单体形式的结合配偶体不能检测到地结合着。推测起来这是由于与以单个分子形式存在的IgG抗体相比，五聚的IgM抗体与单体表位的亲和力要低许多。
由于IgM抗体不干扰，因此在本发明的方法中，用于分离IgM抗体的连续测试步骤就不是绝对必需的。因而，所述方法的特殊的优点为简化了测试的步骤。
除了其中的测试试剂存在于液相中的所谓的湿法测试以外，还可以使用适于蛋白或抗体检测的所有标准的干法测试形式。在这些干法测试或者例如在EP-A-0 186 799中所述的测试带(Teststreifen)中，将测试组分施加到载体上。因此如果以测试带的形式来实现本发明的方法的话，就不需要洗涤步骤。但是，本发明的方法优选是以湿法测试进行的。
在一起温孵所有的受体和样品以及在一个步骤中实现所述的方法是可能的。在温孵之后，该方法可以选择地仅需要一个洗涤的步骤。
一般使用两种不同的受体R1和R2来实现本发明的方法。如果使用了湿法测试的话，受体R2存在于液相中。R1可以存在于液相中或者已经被结合到固相上。如果R1和R2存在于液相中的话，优选它们的浓度是相同的。已经证明了0.5∶1.0至1.0∶5.0的R1∶R2的浓度之比是非常合适的。最佳的浓度比可以由本领域的普通技术人员容易地测试出来。
如果把能够结合到固相上、但是仍然没有结合到固相上的受体用作R1的话，那么与受体R1和R2一起温孵样品。在该过程中，样品抗体结合到R1和R2上。这一温孵可以在有固相存在的条件下进行。在该过程中形成了一种复合物，它包括固相-R1-样品抗体-R2。随后从液相中分离出固相，可以选择地洗涤并测量R2的标记。通常是在固相中测量所述标记的，但是也可以在液相中进行测定。
如果与R1和R2一起温孵样品是在没有固相的条件下进行的话，那么随后必须使整个的测试混合物与固相接触，可以选择地进行洗涤并且测量标记。
如果受体R1已呈固相-结合的形式，那么把样品和受体R2加入固相-结合的受体R1中并一起温孵。另外的步骤对应于以上所述的方法。
但是也可能通过几个步骤来实现本发明的方法。在这种情况下，合适的做法是首先与受体R1和R2一起温孵样品。随后与其它的受体一起温孵形成的R1、R2和待测定的抗体的复合物，由此该方法可以通过几个步骤来实现。另外的测试步骤对应于前面描述的方法。
受体R2为一种呈单体形式的结合配偶体和标记的缀合物。根据本发明呈单体形式的结合配偶体恰好含有一个表位区或者对待测定的抗体而言仅有一个结合位点、即与待测定的IgG抗体特异地发生免疫反应的结构。结合配偶体的单体结构是重要的，这就确保了仅有待检测的抗原-特异性IgG抗体结合到呈单体形式的结合配偶体上并且没有特异性相同的IgM抗体的干扰。
表位区例如可以从抗原或者抗-独特型抗体得到。在呈单体形式的结合配偶体的情况下，表位区还可以由糖和/或脂类结构或者肽、脂类和/或糖组分组合的结构得到。可以使用可由表位区得到的所有结构，所述结构具有一个结合位点，而在有特异性相同的IgM抗体存在的条件下待检测的IgG类抗体特异地结合到所述结合位点上。对结合位点、即对以单体形式使用的结合配偶体而言，唯一的前提条件是保留对于IgG的特异结合能力。这一条件也适用于在结合位点中存在糖或脂类结构的情况。
根据本发明，还可能使用位于结合位点两侧或与结合位点重叠的呈单体形式的结合配偶体，其中待检测的IgG抗体特异性地结合到所述结合位点上。因而还可能检测到交叉反应的IgG抗体，该抗体的结合位点与待检测的表位重叠。因此，优选使用呈单体形式的结合配偶体的混合物来检测抗原-特异性IgG抗体。
优选使用肽作为呈单体形式的结合配偶体。在以蛋白作为分析物的情况下，结合位点被认为是一种肽，它的序列为蛋白抗原的蛋白序列的一部分，并且针对该蛋白的抗体(在本发明的情况下为IgG抗体)特异性地结合到它的上面。除了这些肽以外，还认为结合位点包括具有氨基酸序列的肽，它具有与前述的肽基本上相当的特异性和/或结合到待检测的IgG抗体上的亲和力。这些肽优选地可以由前述的肽通过取代、缺失或插入个别的氨基酸残基得到。
即使在有特异性相同的IgM抗体存在的条件下，仍可以使用具有这样一个结合位点的所有的肽，其中待测定的IgG类抗体特异地结合到所述位点上。对结合位点、即对所使用的肽而言，唯一的前提条件为保留了它特异性地结合到IgG上的能力。结合位点被认为是一种肽，它的序列为蛋白抗原(分析物)的蛋白序列的一部分，并且抗该蛋白的抗体特异性地结合到其上，在本发明中所述的抗体为IgG抗体。除了这些肽以外，还认为结合位点包括具有氨基酸序列的肽，它具有与前述的肽基本上相同的特异性和/或结合到待测定的IgG抗体上的亲和力。这些肽优选地可以由前述的肽通过取代、缺失或插入单个氨基酸残基得到。
还认为本发明的对应于特异性结合位点的肽包括肽的衍生物，其中通过化学反应已经使一个或几个氨基酸衍生化。具体说来，本发明的肽的衍生物的例子为那些其中的主链或/和活性氨基酸侧基(例如游离的氨基、游离的羧基或/和游离的羟基)已被衍生化的分子。氨基衍生物的具体实例为氨磺酰或氨甲酰、硫代氨基甲酸乙酯的衍生物以及铵盐(例如盐酸化物)。羧基衍生物为盐、酯和酰胺。羟基衍生物的例子为O-酰基或O-烷基衍生物。所述的肽优选是根据本领域普通技术人员已知的方法通过化学合成生产的，并且在此不必进行特别的说明。从原理上来讲，所述的肽还可以通过重组的方法生产。但是，较长的多肽通常倾向于发生二聚或聚合，从而为了确保单体的性质，优选通过化学合成来生产所述的肽。
此外，术语肽的衍生物还包括这样的一些肽，其中的一个或几个氨基酸被20种“标准”氨基酸的天然存在的或者非天然存在的氨基酸同系物取代。上述同系物的实例为4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。肽的衍生物必须具有与所述的肽基本上相当的特异性或/和结合到待测定的IgG抗体上的亲和力，其中所述衍生物是由所述的肽得到的。
本发明的对应于特异性结合位点的肽也被称为肽-模拟物质、即下文中的肽-模拟物，该物质具有与前述的肽或肽的衍生物基本上相同的特异性或/和结合到待测定的IgG抗体上的亲和力。肽-模拟物是化合物，就其与待测定的抗体的相互作用而论，肽-模拟物可以代替肽，并且尤其是对蛋白酶和肽酶来说，所述的模拟物可以比天然的肽具有更高的稳定性。在下列文献中描述了用于生产肽-模拟物的方法Giannis和Kolter，“Angew.Chem.”105(1993)，1303-1326以及Lee等人，《日本化学协会会刊》66(1993)，2006-2010。
本发明的结合位点的长度、即单体肽的长度通常至少为4个氨基酸。所述长度优选介于4至20个、6至15个或者特别优选介于9至12个氨基酸之间。就肽-模拟物或肽的衍生物而言，考虑到分子的大小，类似的长度是必须的。
本发明的作为呈单体形式的结合配偶体的单体肽含有表位，其中待测定的IgG抗体特异性地结合到该表位上。但是，不再对应于特异性表位的其它侧翼肽序列可以存在于所述肽的N-末端和/或C-末端。而且，给所述的肽提供为本领域的普通技术人员所熟悉的间隔基团也是可能的。唯一的前提条件是作为呈单体形式的结合配偶体的肽实际上是作为单体存在的并且保留了结合到待测定的IgG抗体上的能力。
受体R2的另一个组分为标记。可以直接检测到的物质优选用作标记，例如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者金溶胶、乳胶或金粒子。酶或其它生物分子也优选作标记、比如半抗原。在半抗原中，洋地黄毒苷是一种特别优选的标记。用于标记的方法为本领域的普通技术人员所熟悉并且在此不必进一步加以说明。通过测量化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者金溶胶、乳胶或金粒子或者通过测量由所述酶转化的底物，以众所周知的方式直接检测标记。
还可以间接地检测所述的标记。在这种情况下，另一个受体(其自身又被偶联到一个产生信号的基团上)特异性地结合到R2的标记(比如洋地黄毒苷这样的半抗原)上。通过为本领域的普通技术人员所熟悉的方法来检测产生信号的基团，例如化学发光物质、荧光物质或放射性物质或者酶或金粒子。例如，抗体或抗体的片段可以用作特异性地结合到R2的标记上的另一种受体。如果使用了标记的这种间接检测的话，那么R2标记优选为洋地黄毒苷或者另一种半抗原，并且通过偶联到过氧化物酶上的抗体进行检测，所述抗体针对洋地黄毒苷或者半抗原。
受体R1的基本组成为能够特异性地结合到待测定的IgG抗体上的结合配偶体。受体R1可以被直接结合到固相上或者能够结合到固相上。如在受体R2中的呈单体形式的结合配偶体可以用作能够特异性地结合到待测定的IgG抗体上的结合配偶体。但是，使用不以单体形式存在的结合配偶体也是可能的、即所述的结合配偶体可以有多于一个的表位或结合位点。重要的是保留了结合配偶体特异性地结合到待测定的IgG抗体上的能力。但是，呈单体形式的结合配偶体和特别优选的肽也用于受体R1。通过与针对R2的肽同样的方法来生产R1中所包含的肽。
抗体-特异性结合配偶体或者包含在受体R1和R2中的肽可以是相同的或者是不同的，但它们都必须能够同时结合到待测定的IgG抗体上。
R1或者可以被直接结合到固相上。通过本领域普通技术人员已知的方法来实现R1与固相的直接结合。R1还可以通过特异性结合系统而被间接地结合到固相上。在这种情况下，R1是一种由如上说明的肽和特异性结合系统的反应配偶体组成的缀合物。在这种情况下，认为特异性结合系统是两个可以彼此特异性地反应的配偶体。在该情况下，结合能力可以以免疫反应或者另一种特异性的反应为基础。优选地使用生物素和亲和素的组合或者生物素和链霉抗生物素蛋白的组合作为特异性结合系统。其它优选的组合为生物素和抗生物素、半抗原和抗-半抗原、抗体的Fc片段和抗该Fc片段的抗体、或者糖和凝集素。那么，这种可以特异性结合配对的反应配偶体之一即为形成受体R1的缀合物的一部分。
此外，特异性结合系统的其它反应配偶体存在于固相中。通过本领域普通技术人员已知的常规方法，可以将特异性结合系统的其它反应配偶体结合到不溶的载体物质上。在这种情况下，共价结合以及吸附结合是适宜的。特别合适的固相为由聚苯乙烯或类似的塑料制成的试管或微量滴定板，其内表面被特异性结合系统的反应配偶体所包被。颗粒状物质，诸如乳胶颗粒、分子筛物质、玻璃珠、塑料管等也是合适的并且是特别优选的。多孔的层状载体、比如纸也可以用作载体。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，利用由呈单体形式的结合配偶体和特异性结合系统的反应配偶体组成的缀合物作为R1。在该优选实施方案中，一同温孵受体R1和R2以及含有待测定的IgG抗体的样品。在该方法中，受体R1和R2的肽的部分特异性地与待测定的IgG抗体反应。使这种由R1、样品抗体和R2组成的复合物结合到固相上，所述固相通过作为R1的组成的特异性结合系统的反应配偶体而被特异性结合系统的其它反应配偶体所包被。结果，使得由R1、样品抗体和R2组成的整个复合物结合到固相上。在已经从液相中分离出固相并且任选地洗涤固相之后，通过本领域普通技术人员已知的方法来检测R2的标记。这一测试方法可以在特异性相同的IgM抗体存在的情况下，特异性地检测出IgG抗体。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，除了受体R1和R2之外使用了其它的受体。在该测试方法中，利用由呈单体形式的结合配偶体和特异性结合系统的反应配偶体(比如生物素)组成的缀合物作为R1。一同温孵受体R1和R2以及含有待测定的IgG抗体的样品。在该方法中，受体R1和R2的肽的部分特异性地与待测定的IgG抗体反应。通过作为R1的组成的特异性结合系统的一个反应配偶体来实现与所述固相的结合，其中所述固相被特异性结合系统的其它反应配偶体(例如被链霉抗生物素蛋白)所包被。结果，使由R1、R2和样品抗体组成的整个复合物结合到固相上。在从液相中分离出固相并且任选地洗涤固相之后，与特异性地识别R2的标记的其它受体一起温孵已结合到固相上的复合物。把另一种受体偶联到产生信号的基团(比如酶)上。在经历了另一任选的洗涤步骤之后，通过产生信号的基团来检测样品抗体，在这种情况下通过由酶转化的底物进行检测。如果使用了这种测试方法的话，优选采用洋地黄毒苷作为R2标记。在这种情况下，其它受体是由针对洋地黄毒苷的抗体或抗体片段和过氧化物酶组成的。在该测试方法中，与R1和R2以及其它受体一起温孵样品也可以同时进行。
该测试方法还非常适于应用到自动系统中，但其中需要两个或者多个洗涤步骤。如果打算检测几种抗原-特异性抗体(比如抗gp41，p17等的HIV抗体)的话，那么该测试方法的主要优点就变得显而易见了。在这种情况下，所述的其它受体可以用作通用的标记，这是因为这种其它受体特异性地识别R2标记。
本领域普通技术人员已知的所有生物液体都可以用作样品。体液(诸如全血、血清、血浆、尿、唾液等)优选用作样品。
除了上述样品以外，固相和前述的受体、取决于应用而可能需要的其它添加剂(诸如缓冲液，盐，洗涤剂，蛋白添加剂、比如BSA)可以存在于测试混合物中。必需的添加剂是本领域普通技术人员已知的，并且可以由所述的技术人员通过简单的方式加以确定。
为了确保IgM抗体或类风湿因子不干扰抗原-特异性IgG的检测，可能可以选择地使用其它的措施来减少干扰。这些措施例如包括使用还原性物质，比如在EP-B-0 341 439公开的方法中的二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)或β-巯基乙醇。此外，抗-Fd抗体可以选择地用于消除类风湿因子的干扰。在WO 96/14338中公开了上述概念。可以单独或者以任意的组合采用用于减少干扰的各种措施。
本发明的另一个主题为一种用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其中除了用于免疫测定的常用的测试添加剂(诸如缓冲液、盐、洗涤剂等)以外，所述试剂还包含能够结合到待测定的抗体上的受体R2，所述受体是由呈单体形式的结合配偶体和标记组成的。
此外，本发明的一个主题为一种用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其中除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂还包含能够结合到待测定的抗体上的两种受体R1和R2，其中的R1能够结合到固相上、而R2携带一个标记，其中受体R2的基本组成是呈单体形式的结合配偶体。
此外，本发明的另一个主题为一种用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其中除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂还包含能够结合到待测定的抗体上的两种受体R1和R2，其中的R1能够结合到固相上、而R2携带一个标记，其中两种受体的基本组成都是呈单体形式的结合配偶体。
另外，本发明的一个主题为呈单体形式的结合配偶体用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的用途。
本发明通过下面的实施例加以解释。
实施例1.当使用单体表位和多聚体表位时，与<HIV2>MAKs(IgG和IgM)的反应性测试方法的描述生物素-标记的和洋地黄毒苷-标记的单体(试验A)或多聚体(试验B)抗原(HIV2)与样品抗体和链霉抗生物素蛋白-包被的固相反应(在25℃或37℃下温孵大约60至180分钟，在本实施例中120分钟，25℃)。在洗涤步骤之后，结合到壁上的免疫复合物与抗-洋地黄毒苷-过氧化物酶的缀合物反应(在25℃或37℃下温孵大约30至120分钟，在本实施例中60分钟，25℃)。在另一洗涤步骤之后，通过底物的反应来检测过氧化物酶缀合物-标记的免疫复合物(在25℃下温孵缀合物60分钟)。一般说来，缀合物的温孵可以在25℃或37℃下进行大约30至120分钟。
反应步骤(除了底物的反应之外)在Tris/HCl缓冲液(pH7.5，50至150mM，在本实施例中为100mM)中发生，所述缓冲液包含约0.05至0.4％的洗涤剂(此处为0.2％的聚多卡醇)以及约0.5％的蛋白/蛋白衍生物的添加剂(此处尤其为来自乳白蛋白和BSA的胨)。
在这种情况下，所述的样品抗体为抗HIV2表位的单克隆小鼠抗体(IgM与IgG)，将该抗体在抗-HIV阴性人血清中稀释到大约2-20μg/ml。
表1试验A和B的试验结果的比较吸光度的单位为mE
呈单体形式的HIV2-特异性结合配偶体的使用使得能够特异性地检测抗HIV2的IgG抗体。抗原特异性相同的IgM类抗体却不被识别(试验A)。
当使用呈多聚体形式的HIV2-特异性结合配偶体时，区别IgG和IgM是不可能的(试验B)。
2.与黑猩猩HIV2血清转变的血清抗体的反应性实验方法如实施例1。
表2通过试验A和B的黑猩猩血清转变的试验结果吸光度的单位为mE
在待检测的HIV2感染后，呈单体形式的结合配偶体的使用可以使血清转变。在感染后第3周时，试验A的优点特别明显仅有不被呈单体形式的结合配偶体检测到的IgM抗体存在。在IgG抗体出现后，试验A仅仅显示出阳性信号。使用多聚体表位的试验B不能区分特异性相同的IgG和IgM。
3.与病人HIV1血清转变的血清抗体的反应性实验方法如实施例1，但抗原为HIV1。
表3通过试验A和B的HIV1血清转变的试验结果吸光度的单位为mE
在用HIV1(类似于实施例2的HIV2)感染的情况下，试验A也可以使得可靠地检测出IgG抗体。
4.用含有单体表位的肽检测抗风疹病毒的IgG测试方法的描述在购自德国Boehringer Mannheim GmbH的Elecsys2010仪器中，按照生产厂家的说明，通过本发明的呈单体形式的结合配偶体来检测风疹病毒-特异性IgG。使用了下列试剂试剂R1风疹病毒E1抗原的环肽，生物素化的。
Tris缓冲液，pH7.5，0.2％Myrij，0.2％BSA，0.1％R-IgG试剂R1风疹病毒E1抗原的环肽，ruthenylated。
Tris缓冲液，pH7.5，0.2％Myrij，0.2％BSA，0.1％R-IgG使用人血清样品作为样品。
所述的测试是通过下列步骤完成的1.30μl样品+65μlR1+65μlR22.在37℃下温孵9分钟3.加入40μl的SA-包被的磁珠4.在37℃下温孵9分钟5.检测反应测量电化学发光信号表4结果
仅有含抗原-特异性IgG的样品被识别为阳性。根据本发明，仅含抗原-特异性IgM(第1.3和1.4号)的样品不被识别为阳性。
权利要求
1.用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的方法，该方法通过与至少两种不同的受体R1和R2一起温孵所述的样品，其中的两种受体都能特异性地结合到所述抗体上，R1被结合到固相上或者可以被结合到固相上、而R2携带一个标记，其特征在于，使用由待测定的所述抗体特异性识别的呈单体形式的结合配偶体和标记的组成的缀合物作为R2。
2.如权利要求1所要求保护的方法，其特征在于，R1的基本部分为呈单体形式的结合配偶体。
3.如权利要求1或2所要求保护的方法，其特征在于，使用生物素/抗生物素蛋白；生物素/链霉抗生物素蛋白；生物素/抗生物素；半抗原/抗半抗原；抗体的Fc片段/抗该Fc片段的抗体；糖/凝集素作为用于把R1结合到所述固相上的特异性结合系统。
4.如权利要求1至3之一所要求保护的方法，其特征在于，所述的受体R2是用化学发光物质、荧光物质或放射性物质、酶或另一种生物分子标记的。
5.如权利要求1至4之一所要求保护的方法，其特征在于，所述的样品与R1和R2同时温孵。
6.如权利要求1至5之一所要求保护的方法，其特征在于，所述的测试混合物与特异性地结合到所述受体R2的所述标记上的其它受体一起温孵，其中所述的其它受体为一种对R2的所述标记具有特异性的受体和标记组成的缀合物，随后测定所述的标记。
7.如权利要求1至6之一所要求保护的方法，其特征在于，R1中被所述待测定的抗体特异性识别的呈单体形式的结合配偶体的数量大于R2中被所述待测定的抗体特异性识别的呈单体形式的结合配偶体的数量或者与之相同。
8.用于测定如前述权利要求之一所要求保护的G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的试剂，其特征在于，除了用于免疫测定的常用的测试添加剂以外，所述试剂包含能够结合到所述待测定的抗体上的受体R2，所述受体是由呈单体形式的结合配偶体和标记组成的。
9.呈单体形式的结合配偶体用于测定G类免疫球蛋白的抗原-特异性抗体的用途。
全文摘要
本发明涉及一种在有M类免疫球蛋白存在的情况下,用于测定体液中G类免疫球蛋白的抗原特异性抗体的方法,该方法通过与至少两种不同的受体R
文档编号G01N33/68GK1245561SQ97181481
公开日2000年2月23日 申请日期1997年11月26日 优先权日1996年11月29日
发明者E·法茨, U·施米特 申请人:罗赫诊断器材股份有限公司