专利名称：基于SAA1β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法
技术领域：
本发明涉及利用甄别SAAl (血清淀粉样蛋白Al)基因型来实现对肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的方法，具体涉及了一种基于血清淀粉样蛋白AlSAAl β / β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，包括适用于临床应用的试剂盒。
背景技术：
人类血清淀粉样蛋白Al (Serum Amyloid Al, SAA1)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白。其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAAl是一种急性炎性蛋白，因为在急性炎症中，SAAl可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成，浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外，SAAl在生理状态下可与高密度脂蛋白(HDL)结合，在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其水平升高。但是，近年来大量研究表明=SAAl已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为天然固有免疫的调理素，SAAl可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAAl在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。在肝脏疾病发生中，香港大学He博士等发现，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中，SAAl蛋白明显增高。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中，SAAl是否参与上述病变至今未见报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明=SAAl蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系，乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAAl蛋白表达明显受抑，提示SAAl可能与HBV感染和后续肝硬化等病变有关。
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SAAl 基因基于 α、β、Y 等位基因可分为 α/α，α/β，a / γ , β/β，β / Y , Y /Υ6种基因型。不同的SAAl基因型在人群中所占的比例存在一定的差异性。近年来，越来越多的研究聚焦在了 SAAl基因型与疾病的关系上。众多研究表明，SAAl基因型确实和疾病有相关性。例如，Yamada等对321名日本人SAAl基因型的研究发现，α (1.1)、β (1.5)、Y (1.3)这3种等位基因在日本人中的分布频率分别为0.310，0.347，0.330。Ishii等发现，在127例RA患者中，发生淀粉样变者最常见的基因型是SAAl γ/Y (1.3/1.3)。淀粉样沉积物的出现和SAAl Y的基因频率高度相关。且在Y/Y纯合子基因型中，血清SAAl蛋白的浓度水平，以及SAAl与同为急性期反应蛋白CRP的比值高于其他基因型。而在高加索人中，淀粉样变与SAAla等位基因的频率呈正相关。在地中海出血热的研究中，有文献报道，SAAl a型的发病率是其他型别的7倍。而在SAAl的SNP分析研究中，也有报道表明不同的基因型在HDL-C的水平上存在显著差异。而SAAl基因型与肝硬化的相关性研究至今未见报道。
多态性(Polymorphism)是指在一个生物群体中，同时存在多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性(Genetic Polymorphism)或基因多态性。基因单核苷酸多态性(Singal Nuclear Ploymorphism, SNP),即基因核苷酸序列内的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失，插入和置换。人类基因多态性与医学有着密切的关系，在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，可阐明人体对疾病的易感性，在认识疾病的发生机理、预测疾病等方面具有重要作用，为临床医学及预防医学发展带来新的领域。同时，疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到广泛重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，阐明基因型与表型之间的联系在认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面具有重要的作用。基因多态性还可以用于疾病的分型与治疗，即根据患者疾病多态性的基因型来解释疾病的病因和临床表现。由于基因多态性有明显的种族差异，因此在不同的种族之间有可能不同。所以，开展我国人群的基因多态性研究具有重要的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高了预防的效率。而对特定的易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。因此基因多态性在临床医学、检验医学、预防医学、遗传医学等方面均具有重要意义。目前检测基因多态性的方法有多种，但主要由以下几种:限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP):由于DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，就会产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。单链构象多态性(SingleStrain conformation polymorphism, SSCP):基于相同长度的单链DNA如果核苷酸序列不同，会形成不同的构象，在电泳时就会出现泳动变位，因此可鉴定是否存在突变及诊断未知突变。该方法的缺点是较多因素的影响，例如电泳分辨率，片段大小、变性条件，电泳电压及时间等，不易进行大样本的操作检测。等位基因特异性寡核苷酸探针法(PCR-Allele Specific Oligonucleotide,PCR-AS0):在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。PCR-顺序特异寡核苷酸法(PCR-Sequence Specifc 01 igonucleotide,PCR-SS0):PCR片段扩增后利用序列特异性DNA探针，通过杂交对扩增片段进行分析鉴定。等位基因特异性PCR(Allele_specific PCR，AS-PCR):即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的(Allele-specific)或组特异性(Group-specific)的引物。与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增达到分析基因多态性的目的。PCR-荧光法:通过不同荧光标记的引物同时反应，PCR扩增待检测的DNA，发现目
的基因存在与否。

DNA测序:对PCR产物直接测序。基因芯片法(Gene Chips):使用大量密集排列已知的序列探针，被标记的靶核酸片段与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据探针的核甘酸序列确定祀基因的序列。变性梯度凝胶电泳法(DenaturingGradinent Electrophoresis, DGGE):基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。随机扩增的多态性DNA(Randomamplified polymorphic DNA,RAPD)。RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增，.并对扩增片段进行检测，从而判断基因组相应区域的DNA多态性。虽然检测基因多态性的方法有多种形式，但均有其局限和不足。目前SAAl基因多态性研究中普遍使用的是RFLP方法，该步骤极为繁琐、重复性差，不易大规模进行SNP基因型分析。因此，开发一种简便、快速、准确、经济、高通量的SAAl基因多态性检测方法，对于相关疾病的诊断有着重要的意义。
本发明创新地提出了一种基于SAAl β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断检测方法，首创提出了实时荧光定量等位基因特异性PCR，即使用实时荧光定量PCR结合采用等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)原理来对SAA基因型检测的方法，通过将SAAl等位基因的SNP位点设计于下游引物3’端的末端并对其进行硫代磷酸化修饰，采用Pfu DAN聚合酶等优化步骤，达到了高通量和高特异性的目标，实现了对肝硬化患者及正常对照人群SAAl基因型的检测分析。本发明首次提出了 SAAl β/β纯合子基因型与肝硬化的显著相关性；提出了 SAAl β/β基因型在肝硬化预后和/或肝硬化的临床检测方法及其诊断价值；并对本发明方法进行了临床应用评估。本发明提出的用于检测人SAAl等位基因SNP的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，具有流程简单、易操作、高通量和高特异性等特点，可实现对肝硬化易感人群的筛选；本发明并适用于SAAl SNP与其它相关疾病的研究。本发明还采用已往报道的PCR联用RFLP方法，对本发明的高通量实时荧光定量等位基因特异性PCR进行反复论证，证实本发明检测方法的可靠性和准确性。

发明内容
本发明提出了一种基于SAAl β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的方法，依据SAAl α、β、Y三个等位基因的核苷酸序列合成引物，对待测样品进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，依据CT值及溶解曲线判断PCR扩增产物的基因型，经检测PCR产物的基因型为β/β型的，则待测样品属于肝硬化的易感人群。其中，所述引物包括:I) A3 套引物所述上游引物5，-3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ；所述下游引物5’ -3’ 序列(Seq ID N0.2)为:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG ；2)A2 套引物所述上游引物5，-3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ；所述下游引物5’ -3’ 序列(Seq ID N0.3)为:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA ；
3)B3 套引物所述上游引物5，-3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ；所述下游引物5’ -3’ 序列(Seq ID N0.4)为:TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG ；4)B2 套引物所述上游引物5，-3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ；所述下游引物5’ -3’ 序列(Seq ID N0.5)为:TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。本发明所述引物还可以是含上述引物序列(Seq ID N0.1 Seq ID N0.5)的延伸引物系列。其中，引物3 ’端末端进行硫代磷酸化修饰。其中，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，退火温度为60_67°C之间，PCR扩增片段长度为120-200bp ;待测基因组DNA浓度范围为5_15ng之间。本发明中，所述肝硬化可以是由肝脏疾病发展形成。本发明还提供一种基于SAAl β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和或肝硬化诊断用试剂，其用于实施本发明所述的检测方法，包括优化的实时荧光定量等位基因特异性PCR反应体系；所述引物；含人SAAl α、β、Y等位基因基因组DNA片段的质粒阳性对照；pfu DNA 聚合酶(Pyrococcus furiosus DNA polymerase);突光染料(SYBR Green I)及荧光校正染料R0X。本发明还提供 一种试剂盒，其用于实施本发明所述的检测方法，包括上述基于SAAl β / β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和或肝硬化诊断用试剂。本发明在甄别SAAl β/β纯合子基因型的技术方案的基础上，提出了肝硬化诊断试剂和肝硬化预后诊断试剂，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，采用本发明所述的A3套引物、Α2套引物、Β3套引物、Β2套引物。本发明甄别SAAl β/β纯合子基因型应用于制备肝硬化诊断试剂及肝硬化预后诊断试剂中，所述诊断试剂是包括本发明的引物、反应缓冲液、含人SAAla、β、Y等位基因基因组DNA片段的质粒、pfu DAN聚合酶以及荧光染料的试剂盒。本发明在SAAl基因型的研究中，建立了一种简便、准确、快速、高通量的用于检测人SAAl等位基因SNP的实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法，还可以应用于SAAl SNP与其他疾病的相关性研究。本发明依据人SAAl α、β、Υ三种等位基因SNP序列(8052位T、C ；8067位T、C)合成相应引物，将SNP位点设计在下游引物3’端的末端，上游引物为SAAl基因组上的一段保守内含子核苷酸序列。利用优化的PCR反应程序，通过实时荧光定量等位基因特异性PCR反应，对人血液样本提取的基因组DNA进行扩增，并根据CT值及溶解曲线来进行SAAl基因型分析。本发明中，所采用的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的优化过程包括pfuDNA聚合酶的运用、合理的引物设计和修饰以及PCR反应体系的优化。由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在，本发明运用了 pfu DNA聚合酶，该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’ -5’端的DNA外切酶活性，因此其既能进行DNA合成又可以即时的识别并切除错配核苷酸，极大提高了 PCR扩增的特异性，同时降低了引物二聚体的产生。
本发明通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰，防止引物末端被pfu DNA聚合酶3’ -5’外切酶活性进行降解，从而进一步提高扩增的专一性。同时，通过选择更优化的PCR反应条件，如引物浓度范围(0.5-5mM);引物长度范围(20-30bp);反应时的退火温度(60°C -67°C );扩增片段长度(120-200bp);待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)等进一步提高了 PCR扩增的专一性和扩增效率。本发明中，运用实时荧光定量等位基因特异性PCR技术中的染料法，根据A3、A2、B3、B2四套引物间的基因组扩增产物的CT值差异与标准参考样品(克隆的含人SAAl α，β，Y三种等位基因基因组DNA片段的质粒)的比较，提高了数据分析结果的可靠性和准确率。本发明利用实时荧光定量等位基因特异性PCR反应中引物在3’端末端存在错配时不能延伸的原理，将SAAl等位基因SNP位点设计在引物的3，端末端;采用合适的引物修饰；使用Pfu DNA聚合酶等手段，并对反应体系如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等进行一系列优化，从而准确快速检测人基因组中的SAAl基因型SNP位点，本发明技术方案的原理和方法亦适用于其它基因的SNP检测。本发明中提供了一种特殊引物，以人SAAl α、β、Y三种等位基因上特异的SNP序列合成四套引物，即Α3、Α2、Β3、Β2 ;运用pfu DNA聚合酶，通过实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法，检测人SAAla、β、Y等位基因并据此进行SAAl基因型分型，从而研究中国人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝硬化等患者中SAAl基因分布频率。本发明首次建立通过实时荧光定量等位基因特异性PCR检测SAAl基因型分布方法。并且本发明的实时荧光定量等位基因特异性PCR具有操作简便、准确率高、高通量等特点，适合进行大规模SAAl α、β > Y等位基因基因型的分布检测及其与疾病的相关性研究。本发明通过实时荧光定量等位基因特异性PCR方法分析人SAAl α/α , α/β , α/γ,β/β,β/γ,γ/γ6种基因型，并应用该方法检测SAAl基因型在中国健康人群以及疾病人群如乙型肝炎及肝 硬化等患者中的分布，确定特定SAAl β/β纯合子基因型与肝硬化等肝脏疾病的密切的相关性，从而论证了本发明在临床上的应用性和可行性。本发明联合采用AS-PCR与RFLP的方法，对427例中国汉族健康人群进行SAAl基因型筛查，结果与已有报道的用同样方法获得的其它人种的SAAl基因分布进行比对，不仅明确了中国汉族人群中SAAl基因型分布，还对本发明的实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法进行了论证。本发明对SAAl β/β纯合子基因型在乙肝转化为肝硬化的临床预后诊断价值的评估，进一步发现SAAl β/β纯合子基因型有可能作为肝硬化的高危因子，实现对肝硬化预后诊断，可从乙肝患者中检测出易感人群。另外，SAAl β/β纯合子基因型作为全新的肝硬化生物标志物,结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值，可大大提高非侵入性肝硬化诊断的准确性。综上所述，对于SAAl β/β纯合子基因型的检测不仅可用于监测乙肝患者发展为肝硬化的患病几率，从而指导治疗方案的实施；并且，本发明的SAAl β/β纯合子基因型检测方法结合血浆AST/ALT比、TBA和LDL值等检测项目，可用于非侵入性的肝硬化诊断。鉴于SAAl基因型的检测对于相关疾病的预防、筛查及易感人群的早期干预和诊断等方面有重要作用与临床意义，因此，本发明通过对SAAl基因型的研究不仅为SAAl蛋白参与乙肝型肝硬化的发病机理提供了实验依据，还为甄别SAAl β/β纯合子基因型从而发现肝硬化易感人群建立了高通量的实时荧光定量等位基因特异性PCR方法，为实现早期诊断肝硬化和预测治疗转归奠定了理论与实验基础。对肝硬化易感人群进行早期预防，早期诊断，早期干预，从而大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，不仅对患者个人还对整个社会的经济和医疗水平的发展、提高都有不可估量的重大意义。


图1所示为以含人SAAl β基因型基因组DNA片段的质粒为模板进行实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增结果示意图。其中，图1A为扩增产物的溶解曲线图，图1B为扩增产物荧光扩增曲线，图1C为达到设定荧光值的PCR循环数。图2所示为实时荧光定量等位基因特异性PCR检测人基因组DNA SAAl基因型的结果示意图。其中，图2Α为检测SAAla/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图2Β为SAAl β / β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图，图2C为SAAl γ/β基因型的实时荧光定量等位基因特异性PCR扩增产物的溶解曲线图和产物荧光扩增曲线图。图3所示为SAAl基因 型中β / β型及非β / β型在健康对照人群、乙型肝炎患者及乙型肝炎后肝硬化(乙肝型肝硬化)患者中所占百分比柱状图。图4所示为AS-PCR联用RFLP结果示意图。其中，图4Α为3 %琼脂糖DNA电泳:以含人SAAl α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，Β3套引物进行AS-PCR扩增的结果示意图；图4Β为3%琼脂糖DNA电泳:以含人SAAl α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为模板，Β2套引物进行AS-PCR扩增，扩增产物经BanI酶切后的结果示意图。图5所示为采用实时荧光定量等位基因特异性PCR的检测方法和AS-PCR联用RFLP的检测方法对SAAl基因型中β/β型及非β/β型在健康对照人群中的分布的比较图。图6所示为实施例1阳性克隆DNA序列测定结果示意图。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施例1实时荧光定量等位基因特异性PCR的建立及其临床评估和应用一.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的建立实时荧光定量PCR技术具有实时监测、定量和高通量等特点，而且操作简便、灵敏度高。荧光定量PCR分为探针定量PCR及荧光染料定量PCR。荧光染料定量PCR中加入SYBR Green I染料，它能特异性地嵌入双链DNA分子中，与DNA分子结合时能发出荧光。而当DNA分子为单链时，染料被释放，荧光减弱。因此在一个反应体系中，荧光的强弱与DNA双链分子含量呈正相关。因此每一个循环，收集荧光信号，即可通过荧光强度变化监测到DNA扩增产物量的变化，从而得到一个荧光扩增的曲线图，最终通过计算可得到单个体系反应时间内的PCR产物扩增量。通过定量PCR仪计算CT (Threshold cycle)值可判定扩增产物的有无。CT值为PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数。等位基因特异性PCR的原理是基于Taq DNA聚合酶不能修复DNA引物在3'端末端的单个碱基错配。所以，当引物的3,端核苷酸与等位基因变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物3,端末端核苷酸与模板错配，则模板不会被扩增或扩增效率极低。因此，通过对PCR产物的检测可确定SAAl基因型。本发明采用上述基于等位基因特异性PCR的原理而经过改良的实时荧光定量PCR:实时荧光定量等位基因特异性PCR方法检测SAAl α，β，γ三种等位基因中的两个氨基酸位点V57A、V52A相对应的SNP位点，对66名乙肝(尚未转化为肝硬化)和103名乙肝型肝硬化患者进行临床实验，并对其作为肝硬化生物标志物的可能性作出评估。本发明以SAAl 全基因组中(GenBank:NCBI Reference Sequence:NG_021330.1)7800到8300之间的核苷酸序列为基础，运用实时荧光定量等位基因特异性PCR的方法检测SAAl α、β、Y等位基因上的两个SNP位点。本发明依据人SAAla、β、γ 三种等位基因的 SNP (GenBank: NCBI ReferenceSequence:NG_021330.1)序列(8052位的T或C ；8067位的T或C)合成相应的引物，将SNP位点设计在下游引物3,端的末端，上游引物为SAAl基因组上的一段保守的核苷酸序列。通过实时荧光定量等位基因特异性PCR反应，对人血液样本提取的DNA进行扩增，并根据CT值和溶解曲线进行SAAl基因型分析。一.实验方法:1.获得待测样品:血液中人基因组DNA的抽提，取人血液500 μ L，用血液DNA抽提试剂盒抽提，测定260nm吸光值以计算DNA浓度，并将其稀释到10ng/uL浓度。2.实时荧光定量等位基因特异性PCR引物的设计:参照已报道的人SAAla、β、Y等位基因序列，设计 四套引物，即A3，Β3, Α2，Β2套引物。引物的3’端末端为SAAl等位基因 SNP 位点。根据 SAAl 基因组 DNA 序列(GenBank:NCBI Reference Sequence:NG_021330.1)设计引物，其中上游引物为通用引物，在全基因组7907 7933bp (GenBank:NCBI ReferenceSequence:NG_021330.1)处。下游引物为针对α、β、γ等位基因的多态性位点的4条引物，其3’端末端在基因组DNA序列的8052位点或8067位点，分别为A3，Β3，Α2，Β2，见表6。另外，引物3'端的末端被硫代磷酸化修饰，以期提高检测SAAl α、β、Y等位基因SNP位点的特异性。上游端正向通用引物
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A套引物B套引物实时荧光定量PCR所选用人SAAl基因组序列及引物设计位置如上所示。其中，第一个黑框部分为上游端通用引物tcccttctgcctttcctttcctttcc (Seq ID N0.1),第二个黑框部分为A套反向两条引物(即A3, A2,) CctgggctgcagaagCgatcacg taa,灰底标示序列为B 套反向引物(即 B3, B2) Cgatcacg taactggagc tcctggga,如表 6 所示。表I实时荧光定量等位基因特异性PCR引物
权利要求
1.一种基于SAAl β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，其特征在于，依据SAAla、β、Y三个等位基因的核苷酸序列合成引物，对待测样品进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，依据CT值及溶解曲线判断PCR扩增产物的基因型，经检测PCR产物的基因型为β/β基因型的，则待测样品属于肝硬化的易感人群。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物包括: A3套引物 所述上游引物 5’ -3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.2)为:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG ； A2套引物 所述上游引物 5’ -3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.3)为:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA ； B3套引物 所述上游引物 5，-3 ，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5’ -3’ 序列(Seq ID N0.4)为 TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG ； B2套引物 所述上游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.1)为:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5’ -3’ 序列(Seq ID N0.5)为 TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物还包括含引物序列(SeqIDN0.1 SeqID N0.5)的延伸引物系列。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中，退火温度为60-67°C之间，PCR扩增片段长度为120-200bp ;待测基因组DNA浓度范围为5-15ng 之间。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述肝硬化由肝脏疾病发展而成。
7.一种基于SAAl β/β纯合子基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的试剂，其特征在于，其用于实施如权利要求1所述的检测方法，包括如权利要求2所述的引物；含人SAAl α、β、γ等位基因基因组DNA片段的质粒为阳性对照；pfu DNA聚合酶；荧光染料SYBRGreenI，及荧光校正染料ROX。
8.一种试剂盒，其特征在于，其用于实施如权利要求1所述的检测方法，包括如权利要求6所述的试剂。
全文摘要
本发明公开了一种基于SAA1β/β基因型的肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断的检测方法，所述检测方法采用依据SAA1α、β、γ三个等位基因的核苷酸序列合成引物，进行实时荧光定量等位基因特异性PCR，判断待测目标是否属于肝硬化易感人群。本发明检测方法具有简便、准确、快速、高通量等优点，适用于SAA1 SNP与相关疾病的研究。
文档编号G01N21/64GK103160576SQ20111041892
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者王荣芳, 吴峻, 张艳, 钱震斌 申请人:德赛诊断系统(上海)有限公司