专利名称：日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白及其筛选方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体涉及联合蛋白质学技术和血清学技术筛选日本血 吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白并以此作为日本血吸虫病诊断的潜在靶点，尤其涉 及一种日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白及其筛选方法和用途。
背景技术：
血吸虫病作为一个全球性的公共卫生问题是世界上仅次于疟疾的第二大寄生虫 病。血吸虫病历史悠久分布广泛，严重影响着人类的健康和社会经济的发展。估计全世界 有76个国家和地区流行血吸虫病，被感染的人口达2亿，受威胁人群5-6亿，其中有症状的 约1. 2亿，重症和伤残人数约2000万，每年死亡2万，严重影响着人类的健康和社会经济的 发展。但是由于该病主要是在发展中国家的贫困地区流行，所以在很大程度上一直处于被 忽视的地位。日本血吸虫作为三大主要血吸虫之一，主要在中国以及东南亚等国家流行。血吸 虫病的诊断在血吸虫病防治活动中处于中心环节，它是寻找并确定指示血吸虫在机体存在 的直接或间接证据，为血吸虫感染的临床诊断提供依据。通过诊断结果还可以了解疾病的 传播情况，有可能在感染的初期及时发现，随即采取相应的措施有效地控制疾病的大规模 传播。免疫学诊断方法因具有良好的特异性、敏感性以及实用性等优点，而成为血吸虫疫区 筛查目标人群的一种有力的流行病学工具。另一方面，吡喹酮作为日本血吸虫病目前唯一 有效的治疗药物被广泛地用于现场防治中，化疗也成为重要的血吸虫病防治措施。但是由 于长期大规模的使用可能诱导血吸虫产生抗药性。疗效考核和规范用药是延缓抗药性产生 的重要手段。目前，已有的诊断方法均不能有效区分现症感染病人和吡喹酮治愈病人，不能 有效指导规范用药，评价治疗效果。因此，寻找具有疗效考核价值的诊断抗原具有重要的现
眉、^C ο虫卵是日本血吸虫致病的主要原因，虫卵抗原在调节宿主体内针对寄生虫 S4J ^^^MBt^'MTM^M^ [Pearce EJ, MacDonald AS. Theimmunobiology of schistosomiasis. Nat Rev Immunol. 2002,2 :499-511]，有证据显示化疗后能在患者体内 引起一系列血吸虫特异性抗体水平的改变，尤其是可以引起特异性的抗虫卵抗体水平的 变化[Mutapi F, Ndhlovu PD, et al. Changes in specific anti-egg antibody levels following treatment withpraziquantel for Schistosoma haematobium infection in children. Parasite Immunol. 1998,20 :595-600],吡喹酮还能改变可溶性虫卵抗原 相关的免疫反应[Martins-Leite P，Gazzinelli G，et al. Effect of chemotherapy withpraziquantel on the production of cytokines and morbidity associated withschistosomiasis mansoni. Antimicrob Agents Chemother. 2008，52 :2780-2786]，这 些抗体水平可以反应宿主体内现有的抗原水平。血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)是血清学诊 断中最为常用的抗原。但是粗抗中成分复杂，会对免疫诊断的特异性造成一定影响。而且大多数中国现场使用的免疫学诊断方法证明血吸虫特异性抗体在患者治愈后至少一年内 都维持一个高水平，在很多情况时间甚至更久，由此也导致了在粪检虫卵中的阴性病人经 过血清学检测后得到阳性结果，无法区分既往感染和现症感染的患者。
近期，包括基因组、转录组、蛋白质组以及代谢组等在内的组学研究已经成为了生 物医学和生命科学中的热点研究领域之一。组学研究的主要优势在于可以利用高通量的 实验技术而获得信息量庞大的数据。基因组和蛋白质组学的研究成果也为免疫组学研究 带来了契机，免疫组学特别强调在基因组学和蛋白质组学研究的基础上，充分利用生物信 息学、生物芯片、系统生物学、结构生物学、高通量筛选等技术，大规模开展免疫系统和免疫 应答分子机理研究，发现新的免疫相关分子，为全面系统了解免疫系统和免疫应答提供基 础。基因组和转录组数据的逐步释放，尤其是2009年日本血吸虫和曼氏血吸虫基因组草图 的公布，为利用质谱鉴定血吸虫蛋白质提供了强有力的支撑。人们也用蛋白质组学技术分 析鉴定了大量血吸虫生物学相关以及寄生虫-宿主相互作用的蛋白质。而蛋白质组学技术 和血清学技术的结合则成为了鉴定血吸虫蛋白中的抗体靶点中的一个有效工具。研究者借 助这一工具分析鉴定了埃及血吸虫病患者治愈前后血清中成虫抗原性蛋白质组分[Mutapi F，Burchmore R，Mduluza T，et al. Praziquanteltreatment of individuals exposed to Schistosoma haematobium enhancesserological recognition of defined parasite antigens. J Infect Dis，2005，192 :1108-1118]以及牛血吸虫成虫膜蛋白及排泄分泌产物 [Perez-Sanchez R，Ramajo-Hernandez A，et al. Proteomic analysis of the tegument andexcretory-secretory products of adult Schistosoma bovis worms·]，包括糖酵角军 相关的酶、分子伴侣以及肌肉蛋白等。但是，目前对于日本血吸虫可溶性虫卵抗原的免疫组 学研究还未见相关报道。了解吡喹酮对于日本血吸虫虫卵抗原组分的影响会有助于更好的 了解血吸虫虫卵相关的致病机理以及宿主-寄生虫之间的相互作用，同时也可以为日本血 吸虫病诊断靶点的选择提供参考依据，满足我国血吸虫病防治现场应用的需要。

发明内容
本发明要解决的技术问题之一是鉴定日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性 蛋白组分，并以此作为日本血吸虫病诊断的潜在靶点。本发明要解决的技术问题之二是提供上述日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫 原性蛋白的筛选方法，即联合蛋白质组学技术和血清学方法筛选日本血吸虫可溶性虫卵抗 原中的免疫原性蛋白。本发明要解决的技术问题之三是提供上述日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫 原性蛋白的用途。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，筛选一组日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，该 免疫原性蛋白选自SEQ ID NO :2-SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。日本血吸虫重要可溶性虫卵抗原(P40，编号=GI =226477156)的序列如SEQ ID NO 1所示。在本发明的另一方面，提供了一种上述日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性 蛋白的筛选方法，包含如下步骤
1)制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；2)将步骤1)制备的日本血吸虫可溶性虫卵抗原进行双向电泳分离，得到双向凝 胶电泳图谱；3)将日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳胶进行免疫印迹杂交(Western blot)，再分别用加入适量吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人的血清作为一抗与NC膜进行反 应；4)重复步骤2)和3)以确保结果的正确，从与治疗前后血清反应显色后的NC膜上 挑出反应强烈的点以及差异明显的点，然后再反馈到相应的双向凝胶电泳图谱上，选出与 NC膜对应的蛋白质点；5)对步骤4)选出的蛋白质点进行质谱分析，将质谱鉴定的日本血吸虫虫卵肽段 序列与日本血吸虫蛋白质数据库进行比对，得到一批日本血吸虫虫卵抗原中的免疫原性蛋白。步骤1)具体为日本血吸虫尾蚴经腹感染新西兰兔，42天后将兔剖杀，取感染兔 的肝脏，剪碎后勻浆，铜筛过滤淘洗，离心分离虫卵及兔肝脏碎片，收集干净的虫卵，用生理 盐水清洗后置于液氮中保存。步骤2)具体为A)用等电聚焦仪进行第一向等电聚焦，在20°C自动进行IPG干胶条水化和等电聚 焦，程序设置为30 ν 12h、500 ν IhUOOO ν lh、8000 ν 6h、500 ν 4h ；B)等电聚焦结束后，将IPG胶条在平衡缓冲液中，于摇床上振荡平衡两次，其中第 一种平衡液含二硫苏糖醇，第二种平衡液由2. 5%碘乙酰胺取代；C)取出平衡后的胶条，重蒸水冲洗，滤纸吸干多余水分，在Hofer SE 600垂直电 泳槽上进行SDS-PAGE电泳，用厚度为1. 0mm、浓度12. 5 %的聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳条 件先30mA/胶恒流电泳30min，然后加大到60mA/胶恒流电泳至溴酚蓝前沿到达胶最底端 0. 5cm为止；D)凝胶采用银氨法，按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行硝酸银染色，固定lh， 敏化Ih，清洗池，银染45min，清洗3次，每次3min，显色5min，终止15min，获得双向凝胶电 泳图谱。步骤3)具体为A)将日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳胶进行Wfestern blot，进行蛋白质电 转移，蛋白质转膜完成后，把凝胶用考马斯亮蓝染色，检查蛋白质转移是否完全；把滤膜染 色5-10分钟，蛋白条带出现后，于室温用去离子水漂洗NC膜数次，至水不再变色，在NC膜 上做好标记；B)加入适量的封闭液室温下反应过夜；次日，将已封闭好的NC膜沿着与标记垂直 的方向切下合适宽度的条带，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次；C)分别加入适量的吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人混合血清以及非疫区正常人 混合血清，室温下与NC膜反应浊；D)弃去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，加入HRP标记的羊抗兔 IgG,室温反应Ih ；用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，用DAB显色，出现条带后，终
止反应。
步骤5)具体为A)先切下差异蛋白质点处的凝胶，再用重碳酸胺洗涤胶片，然后用乙腈抽提、再进 行还原和烷基化。最后利用胰酶过夜进行胶内酶解，再用含三氟乙酸的60%乙腈抽提 三次，收集提取物低压冻干；B)抽提的样品与基质进行等量混合进行肽指纹图谱分析，仪器参数设定为发 射模式，200个集成光束，离子源电压为Ι-Wkv，离子源为2-16. 27kv，延迟100纳秒和 600-3500m/z的离子门；C)可溶性抗原蛋白质点的的肽指纹图谱利用MS-FIT和Mascot软件对 SffISS-PROT和NCBInr数据库进行查询分析。在本发明的另一方面，提供一种上述日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋 白作为日本血吸虫病诊断靶点的应用。本发明的有益效果在于本发明联合蛋白质组学技术和血清学方法筛选血吸虫病 诊断靶点，具体涉及利用双向电泳、Western blot (2D-WB)以及质谱的方法分析日本血吸虫 可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，并以此作为日本血吸虫病诊断的潜在靶点。实验证明， 筛选出的这批免疫原性蛋白具有一定的诊断价值，可作为日本血吸虫病的诊断靶点。


图1是日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向凝胶电泳图谱；图2是日本血吸虫可溶性虫卵抗原2D-WB (Western blot)分析示意图；其中，图2A 表示治疗前血清；图2B表示治疗后血清；图3是正常人血清对照示意图(相对于图2)；图4是日本血吸虫可溶性虫卵抗原双向电泳图谱的蛋白质点选取示意图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白一 .双向电泳联合Wfest blot的详细步骤如下1.采集日本血吸虫病患者吡喹酮治疗前后血清。以血吸虫病流行区安徽省安庆 市大观区庙岭村为现场调查点，采集实验所需要的血清样本。随机选择该村常住居民为研 究对象，对其连续2天重复收集共2次新鲜粪样，按Kato-Katz粪便厚涂片检查法[Katz N，Chaves A，Pellegrino J. A simpledevice for quantitative stool thick-smear technique in Schistosomiasismansoni. 1972，Rev Inst Med Trop Sao Paulo 14 397-400]制作6张粪量为41. 7mg的涂片(二送六检)，用浸有含孔雀绿透明液的透明玻璃 纸覆盖并压平，透明24h后镜检计数，读片采用2人双盲法读片，再随机选取15%的涂片由 第三为镜检人员复检虫卵计数，确保误差在5%以内，以进行镜检质量控制。感染度以每克 粪虫卵数(EPG)表示，EPG = 6张涂片虫卵的合计乘以4。然后对Kato-Katz 二送六检的 阴性者进行尼龙绢集卵孵化法粪检，2送6检，在25士3°C的温度条件下孵化，孵化水用去氯 水，PH为7. 4左右，孵化后3、5、10小时各观察一次毛蚴，阴性者12小时后再观察一次，记录结果。只要单次或6次重复加藤法和粪孵法任何一种检测结果为阳性或均为阳性都判断 为阳性结果。在征得上述两种方法初始筛查后的阳性病人同意后，对他们进行吡喹酮口服 治疗，剂量为标准用量40mg/kg。在服药五个月后再次用两种方法筛查这批患者，将阴性结 果的人血清收集起来。在收集血清的同时也记录包括村民姓名、性别、出生年月、职业、接触 疫水方式等在内的流行病学资料。2.可溶性虫卵抗原的制备1000条日本血吸虫尾蚴(安徽株)经腹感染新西兰 兔(日本血吸虫尾蚴由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所钉螺房提供，新西兰兔 购自于上海市松江区松联实验动物场)，42天后将兔剖杀，取感染兔的肝脏，剪刀剪碎后勻 浆，500目铜筛过滤淘洗，！^call分离液800g离心分离虫卵及兔肝脏碎片，收集干净的虫 卵，用生理盐水清洗后置于液氮中保存。3.将制备好的可溶性虫卵抗原进行双向电泳分离，同时制备三张相同的双向电 泳分离胶，其中每张胶的上样量为800 μ g SEA，依次计划在后续免疫印迹实验中分别和治 疗前血清、治疗后血清以及正常人血清反应。双向电泳操作步骤如下用Ettan IPGphor 等电聚焦仪(Amersham，Piscataway，NJ)进行第一向等电聚焦，主要IPGphor等电聚焦系 统指南禾口 Gorg 等[GorgA, Obermaier C, et al. The current state of two-dimensional electrophoresiswith immobilized pH gradients.Electrophoresis. 2000, 21 1037-1053]的方法进行。在20°C自动进行IPG(pH3-10非线性胶条)干胶条水化和等 电聚焦，上样量 100μ g。程序设置为30 ν 12h、500 ν IhUOOO ν lh、8000 ν 6h、500 ν 4h。等电聚焦结束后，将IPG胶条在平衡缓冲液中，于摇床上振荡平衡两次15minX2次， 其中第一种平衡液含二硫苏糖醇(DTT)，第二种平衡液由2. 5%碘乙酰胺(IAA)取代。 取出平衡后的胶条，重蒸水冲洗，滤纸吸干多余水分，在Hofer SE 600垂直电泳槽上进行 SDS-PAGE电泳，用厚度为1. 0mm、浓度12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳条件先30mA/胶 恒流电泳30min，然后加大到60mA/胶恒流电泳至溴酚蓝前沿到达胶最底端0. 5cm为止。凝 胶参考 Hochstrasser 等人[Hochstrasser DF, PatchornikA, Merril CR. Development of polyacrylamide gels that improve theseparation of proteins and their detection by silver staining. Anal Biochem. 1998，173 :412-423]的银氨法，按蛋白质银染试剂盒 的操作手册进行硝酸银染色，固定lh，敏化lh，清洗池，银染45min，清洗3次，每次3min，显 色5min，终止15min，获得双向凝胶电泳图谱。4.将日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳胶进行Wfestern blot (蛋白免疫印 迹杂交)，连接电源，0. 22A，冰浴下进行蛋白质转移，约1. 可完成电转移。5.蛋白质转膜完成后，断开电源，小心拆卸转移装置。把凝胶用考马斯亮蓝染色， 检查蛋白质转移是否完全。把滤膜转移到含有丽春红S工作液的托盘中染色5-10分钟，蛋 白条带出现后，于室温用去离子水漂洗NC膜数次，至水不再变色。用防水笔在NC膜上做好 标记。6.加入适量的封闭液(3%的BSA)室温下反应过夜，封闭可能结合非相关蛋白的 位点，从而降低非特异性结合背景。7.次日，将已封闭好的NC膜置于干净的玻璃板上，沿着与Marker(SE)垂直 的方向切下合适宽度的条带。用PBST(PBS溶液加上Tween-20.，PBS溶液是指磷酸缓冲液 (Phosphate Buffer Solution))漂洗NC膜3次，再用TBS (Tris缓冲盐溶液)漂洗1次。
8.分别加入适量的PZQ (吡喹酮)治疗前后病人混合血清以及非疫区正常人混合 血清，室温下与NC膜反应2h。9.甩去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，每次lOmin。加入HRP 标记的羊抗兔IgG(Sigma)，室温反应lh。10.用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次。用DAB显色，出现条带后，终止反应。11.双向电泳和免疫印迹再重复两次以确保结果的正确，从与治疗前后血清反应 显色后的NC膜上挑出反应强烈的点以及差异明显的点，然后再反馈到相应的双向电泳图 谱上，找出与NC膜对应的蛋白质点，做好标记。12.利用基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱仪(MALDI-T0F/T0F)分析日 本血吸虫可溶性蛋白质点的肽指纹图谱数据。此项工作是由中科院上海生科院蛋白质组研 究分析中心完成的。具体操作为先切下差异蛋白质点处的凝胶，再用重碳酸胺洗涤胶片， 然后用乙腈抽提、再进行还原和烷基化。最后利用胰酶过夜进行胶内酶解，再用含三氟 乙酸的60%乙腈抽提三次，收集提取物低压冻干。抽提的样品与基质进行等量混合进行肽 指纹图谱分析。仪器参数设定为发射模式，200个集成光束，离子源电压为l_19kv，离子源 为2-16. 27kv，延迟100纳秒和600-3500m/z的离子门。可溶性抗原蛋白质点的的肽指纹图 谱利用MS-FIT和Mascot软件对SWISS-PR0T和NCBhr数据库进行查询分析。二 .实验结果通过双向电泳分离，我们获得了重复性较好，分辨率较高的的日本血吸虫日本血 吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳图谱(图1)。这些蛋白质等电点和分子量分布范围较广， 图1中从左至右为等电点增加(pH 3-10)，从上至下位分子量增加(90kDa-17kDa)。为了能够确定在日本血吸虫可溶性虫卵抗原中有哪些蛋白可以被吡喹酮治疗前 后患者的混合血清识别，我们将上述的双向电泳胶进行了 Western blot转膜，然后再分别 用治疗前后血清作为一抗与硝酸纤维素膜进行反应，其结果如下图2A和图2B所示。日本 血吸虫可溶性虫卵抗原对应的硝酸纤维素膜与两种血清反应经显色后，表明反应强烈，且 治疗前后血清所识别可溶性虫卵抗原中的蛋白有一定差异。作为对照的非疫区正常人混合 血清与日本血吸虫可溶性虫卵抗原无明显反应(见图3)。将日本血吸虫可溶性虫卵抗原与治疗前后血清反应后的硝酸纤维素膜与之前仔 细进行比对，挑选出了 84个反应强烈的蛋白质点(见图4)。然后日本血吸虫可溶性虫卵抗 原双向电泳图谱上挑选的这84个蛋白质点进行质谱分析，成功鉴定出了 67个日本血吸虫 虫卵蛋白，将质谱鉴定的日本血吸虫虫卵肽段序列与日本血吸虫蛋白质数据库进行比对， 得到了一批血吸虫虫卵特异性蛋白，我们根据这些鉴定出来的蛋白功能对它们进行了分类 (见表1)。其中主要涉及的功能蛋白有伴侣蛋白，诸如HSP60和HSP70，以及主要虫卵抗原 P40，而此类蛋白在曼氏血吸虫虫卵蛋白质组分析也是属于高峰度的蛋白；涉及能量代谢的 相关蛋白有磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等，其中GAPDH是这 批免疫原性蛋白中除了 HSP之外又一高丰度的蛋白，GAPDH是一种糖酵解的酶，据观察这一 抗原的IgG抗体和感染抗性密切相关；另外还有一类马达蛋白，诸如肌动蛋白、肌球蛋白 重链和轻链以及微管蛋白。除了上述在血吸虫虫卵蛋白质组中常见的蛋白之外，我们还发 现几个首次在日本血吸虫中功能未知的免疫原性蛋白，但在其他血吸虫中有所报道，比如说参与能量代谢过程中的和曼氏血吸虫乌头酸水合酶同源蛋白，以及马达蛋白中的肌钙蛋白T。值得一提的是通过质谱的鉴定还发现了一个重要免疫相关分子烯醇酶(En。lase)，烯醇酶是在磷酸甘油酸脂转变为磷酸烯醇丙酮酸脂过程中起催化作用的，在埃及血吸虫和牛血吸虫的免疫原性蛋白中都发现了该蛋白的存在，另外在日本血吸虫转录组数据和蛋白质数据的比较研究中也发现了这一重要的免疫相关蛋白，提示我们烯醇酶很可能在血吸虫调节宿主的免疫应答中起到一定作用，因此有必要对血吸虫中烯醇酶的功能做详细研究。
表l被识别的日本血吸虫虫卵免疫原性蛋白分类
功能分类蛋白性质
伴侣蛋白热击蛋一1 60(编号G工257215736)，
其序列女[I S[!Q[D NO3所示
热击蛋一1 70(编号G工2829289)，
其序列女[I S[!Q[D NO4所示
主要虫卵抗原(P40)(编号G工
226477156)，其序歹0女口SEQ[D NOl
]听示
_马L达蛋白肌动蛋白(编号G工226472934)，
其序列女[I S[!Q[D NO8所示
微管蛋白(编号G工226471718)，
其序列女[I S[!Q[D NO9所示
肌钙蛋白T(编号G工226478018)，
其序列女[I S[!Q[D NO5所示
I讥球蛋白重链
I讥球蛋白调节轻链2，光滑肌肉小异
构体(编号G工226469350)，其序
歹0女口SEQ[D NO。L4，F；i)-；示
能量代谢烯醇酶(编号G工257123775)，其序
歹0女口SEQ[D NO2所示
头酸水合酶
精氨酸激酶
磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶
3一磷酸甘油醛脱氢酶(编号G工
257209391)，其序歹0女口SEQ[D NO7
]听示
二氢嘧啶酶
线粒体A／I’合成酶a亚基
226471614)，其序歹0女口SEO ID NOl l
I听示
尿嘧啶一DNA转葡糖基酶
氨基酸转氨酶支链
微管蛋白络氨酸连接酶
粦酸甘油酸酯激酶l
转运通路钙网织蛋白(编号G工226473210)，
其序列如SEQ ID NO12，／~；fi；示[OLOO]F~纤维蛋白溶酶[oioi] 钙结合20kDa钙结合蛋白(抗原Sm20)
防御相关磷酸酶2A抑制剂工2PP2A
其他功能ATt’合成酶氢离子转运线粒体Fl复
合体p多肽
KH 剪切调节蛋白
尿苷二磷酸一半乳糖一4一表异构酶
[OL08]
酯水解酶Cll，J千放阅读框54同源蛋[oi io]当
26S蛋白酶调节亚基6a
不均一核糖核酸核糖核蛋一I A2同源
蛋白l
根丝素(纤毛根丝卷曲螺旋蛋白)
牙本质唾液磷蛋白(编号G工
226480886)，其序歹0女口SEQ ID NOlo
}听示[oi 1 8] 未知功能S]CHGC04997蛋白
S]CHGC03722蛋白
SJCHGC05927蛋白(编号G工
76156667)，其序歹0女口SEQ ID NO6[oi22]l听示
SJCHGC01885蛋白(编号G工
76154815)，其序歹0女口SEQ ID NO13[oi25]l听示[oi26]未知蛋白
[oi 28] 实施例2利用免疫酶联吸附试验来验证筛选出的日本血吸虫病诊断靶点[oi29] 一．实验详细步骤
1.从筛选出的日本血吸虫可溶性虫卵抗原的免疫原性蛋白中挑选日本血吸虫热 击蛋白60 (Sj HSP60)进行原核表达并纯化(具体操作方法参考默克pET原核表达手册)。2.将纯化好的充足蛋白分别以 0. 625μ g/ml、0. 125μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 5 μ g/ ml、l. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、10y g/ml、20y g/ml 和 30 μ g/ml 的浓度包被 96 孔酶标板，4°C过夜。3.用PBST在洗板机上洗板3次，每次;3min ；每孔加入100 μ 1的BSA (牛血清 蛋白)，于37°C封闭池。4.用PBST在洗板机上洗板3次，每次;3min ；以100 μ 1/孔加入不同稀释度的混合 病人血清(混合的10份确诊病人的血清，安徽省)和混合正常人血清(混合的10份正常 人血清，非疫区)，37°c反应2h。5.用PBST在洗板机上洗板4次，每次!Bmin ；每孔加入100 μ 1的HRP标记羊抗人 IgG (Sigma, 1 20000 稀释)，37°C反应 lh。6. PBST在洗板机上洗板4次，每次;3min ；每孔加入100 μ 1底物显色缓冲液，室温 显色后加入50 μ 1的2Μ H2SO4终止反应。7.用酶标仪读取0D490nm的数值。二.实验结果为了验证筛选出的这批免疫原性蛋白，我们从中挑选了 HSP60进行克隆表达，并 评价了其纯化产物的诊断价值，从日本血吸虫病人血清中随机分别挑选10份血清进行混 合，OD值结果显示在Sj HSP60抗原包被设定的9个浓度范围内，同时以10份混合的非疫 区正常人血清作为对照，1 μ g/ml和5 μ g/ml的效果最好，病人和正常人OD值相差一倍以上 (见表幻，表明该蛋白具有一定的诊断价值，目前正在用个体血清进行大规模的评价。表2 ELISA检测安徽血吸虫病人血清中抗HSP60抗体的滴度
包被 0.06250.125 0.25 05 510 "20 30
pg/ml
病人 0.2775““0.257 0.2760.248““026 0.25050.2740.237"""0.222 正常人 0.158 0.169 0.1475 0.146 0.1345 0.124 0.1445 0.1265 0.14权利要求
1.一组日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，其特征在于，该免疫原性蛋白 选自SEQ ID NO :2-SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，其特征在于， 该日本血吸虫可溶性虫卵抗原的序列如SEQ ID N0:1所示。
3.—种如权利要求1所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方 法，其特征在于，包含如下步骤1)制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；2)将步骤1)制备的日本血吸虫可溶性虫卵抗原进行双向电泳分离，得到双向凝胶电 泳图谱；3)将日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳胶进行免疫印迹杂交，再分别用加入适量 吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人的血清作为一抗与NC膜进行反应；4)重复步骤2)和3)以确保结果的正确，从与治疗前后血清反应显色后的NC膜上挑出 反应强烈的点以及差异明显的点，然后再反馈到相应的双向凝胶电泳图谱上，选出与NC膜 对应的蛋白质点；5)对步骤4)选出的蛋白质点进行质谱分析，将质谱鉴定的日本血吸虫虫卵肽段序列 与日本血吸虫蛋白质数据库进行比对，得到一批日本血吸虫虫卵抗原中的免疫原性蛋白。
4.如权利要求3所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法，其 特征在于，步骤1)具体为日本血吸虫尾蚴经腹感染新西兰兔，42天后将兔剖杀，取感染兔 的肝脏，剪碎后勻浆，铜筛过滤淘洗，离心分离虫卵及兔肝脏碎片，收集干净的虫卵，用生理 盐水清洗后置于液氮中保存。
5.如权利要求3所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法，其 特征在于，步骤2)具体为A)用等电聚焦仪进行第一向等电聚焦，在20°C自动进行IPG干胶条水化和等电聚焦， 程序设置为:30v 12h、500v IhU OOOv lh、8 OOOv 6h、500v 4h ；B)等电聚焦结束后，将IPG胶条在平衡缓冲液中，于摇床上振荡平衡两次，其中第一种 平衡液含二硫苏糖醇，第二种平衡液由2. 5%碘乙酰胺取代；C)取出平衡后的胶条，重蒸水冲洗，滤纸吸干多余水分，在HoferSE 600垂直电泳槽 上进行SDS-PAGE电泳，用厚度为1. 0mm、浓度12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳条件先 30mA/胶恒流电泳30min，然后加大到60mA/胶恒流电泳至溴酚蓝前沿到达胶最底端0. 5cm 为止；D)凝胶采用银氨法，按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行硝酸银染色，固定lh，敏化 lh，清洗池，银染45min，清洗3次，每次3min，显色5min，终止15min，获得双向凝胶电泳图谱。
6.如权利要求3所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法，其 特征在于，步骤3)具体为A)将日本血吸虫可溶性虫卵抗原的双向电泳胶进行Wfestern blot，进行蛋白质电转 移，蛋白质转膜完成后，把凝胶用考马斯亮蓝染色，检查蛋白质转移是否完全；把滤膜染色 5-10分钟，蛋白条带出现后，于室温用去离子水漂洗NC膜数次，至水不再变色，在NC膜上做 好标记；B)加入适量的封闭液室温下反应过夜；次日，将已封闭好的NC膜沿着与标记垂直的方 向切下合适宽度的条带，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次；C)分别加入适量的吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人混合血清以及非疫区正常人混合 血清，室温下与NC膜反应浊；D)弃去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，加入HRP标记的羊抗兔IgG， 室温反应Ih ；用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，用DAB显色，出现条带后，终止反 应。
7.如权利要求3所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法，其 特征在于，步骤5)具体为A)先切下差异蛋白质点处的凝胶，再用重碳酸胺洗涤胶片，然后用乙腈抽提、再进行还 原和烷基化。最后利用胰酶过夜进行胶内酶解，再用含三氟乙酸的60%乙腈抽提三次， 收集提取物低压冻干；B)抽提的样品与基质进行等量混合进行肽指纹图谱分析，仪器参数设定为发射模式， 200个集成光束，离子源电压为l_19kv，离子源为2-16. 27kv，延迟100纳秒和600-3500m/z 的离子门；C)可溶性抗原蛋白质点的的肽指纹图谱利用MS-FIT和Mascot软件对SWISS-PR0T和 NCBInr数据库进行查询分析。
8.—种如权利要求1所述的日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白作为日本 血吸虫病诊断靶点的应用。
全文摘要
本发明公开了一组日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，该免疫原性蛋白选自SEQ ID NO2-SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。此外，本发明还公开了上述日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白的筛选方法和用途，主要通过联合蛋白质组学技术和血清学方法筛选日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，具体涉及利用双向电泳、Westernblot(2D-WB)以及质谱的方法分析日本血吸虫可溶性虫卵抗原中的免疫原性蛋白，并以此作为日本血吸虫病诊断的潜在靶点。
文档编号G01N33/561GK102079781SQ201010155040
公开日2011年6月1日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者冯正, 卢艳, 张颋, 徐斌, 胡薇, 莫筱瑾, 陈绅波, 鞠川, 魏刚刚 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所