专利名称：碱性磷酸酶标记信号放大系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超灵敏的信号倍增系统，具体地说，涉及一种新的碱性磷酸酶标记信号放大系统。
背景技术：
酶作为灵敏的标记物已被广泛用于各种生化检测系统，如免疫测定(ELISA)，核酸测定(PCR和基因测序)等，其酶活力大小可用在一定条件下催化某一化学反应的速度来表示，催化反应速度愈大，活力愈高，反之则活力愈低，因此，测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度常用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，单独一个酶分子可以催化大量底物(如一分子高纯度酶在Imin内可催化10000-1000000分子的底物)，因而通过对产物生成及底物或共反应物消耗来反应的酶活力，检测的不是酶本身，而是大量生成的底物或消耗的产物，从而提供了高度放大的信号。目前利用工具酶结合其他分析检测手段的信号放大技术因其具有特异、灵敏、简便、快速等特点，已在生物医学研究领域及临床疾病的诊疗中得到广泛应用。相较于放射免疫(RIA)技术，酶联技术具有试剂半衰期长，对环境污染小，试验废物易于处理等优点，但其测定敏感性仍比不上RIA技术，在一些方面尤其在微量物质测定方面还不能替代RIA。但由于放射性物质对人体、环境有极大危害，并且其操作和处理极为不便，因此，如何提高酶联技术的测试灵敏度，使其达到甚至超越RIA技术，一直是科研界的研究热点。酶循环法是在原始标记酶催化基础上附加了一个反应系统(如酶底物反应循环或酶级联反应)，利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)的测定方法。传统的酶反应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物质的重复反应来增加产物的量。因此，通过延长反应时间和/或增加酶的用量可加速循环，增加循环次数，从而提高检测灵敏度。这种由数个催化反应耦联而构建的放大系统，是酶循环法标记技术放大的根本之所在，其敏感性的提高来源于真正的信号放大，而不是简单地将一个分子转变为更多的易于测定的分子，并且酶循环法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质进行提取，是一种临床应用前景十分广阔的测定技术。单分子检测一直是科学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，其技术的实现可使检测灵敏度达到极限，在低含量物质检测中更是具有里程碑的意义。酶循环法通过偶联数个催化反应，可使单一底物通过循环反应生成大量的产物，从而实现高度的信号放大。因此，将酶循环法运用至酶标技术中，可实现酶标技术质的飞跃，大大的提高其检测灵敏度，实现对微量甚至是痕量物质的检测，进一步可以替代RIA法，实现技术更替。自1971年Engvall等学者创立了酶免疫分析技术以来,至今已有二十多种酶被应用于此项技术，其中碱性磷酸酶因具有高活性、高敏感性，在室温下稳定，反应产物易于显现，能商品化生产，染色背景低等优点，应用日益广泛，尤其在免疫检测、核酸测定等方面。

发明内容
本发明针对现有酶联技术灵敏度低的不足，提供了一种通过循环酶法放大碱性磷酸酶标记信号的系统即碱性磷酸酶标记信号放大系统。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种碱性磷酸酶标记信号放大系统，包括( I) 一种碱性磷酸酶底物，其结构通式如下式(I)所示
权利要求
1.一种碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于该系统包括 (1)碱性磷酸酶底物，其结构通式如下式(I)所示
2.根据权利要求I所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于式(I)中所述的烷基，烯烃基和炔烃基为Cl-IO的烷基、C2-10的烯烃基或炔烃基；或Cl-IO的烷基、C2-10的烯烃基或炔烃基的取代基。
3.根据权利要求2所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述的Cl-IO的烷基、C2-10的烯烃基或炔烃基的取代基包括卤代，=0，=N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2,SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, C00R, CONR2, 00CR, COR 和 NO2，其中每个R可以是H，C1-C8烷基，C2-C8杂烷，C3-C8环烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2-C8杂炔或C5-C10杂环；其中R也可被卤代，=0，=N-CN, =N-0R’，=NR，，OR，，NR，2，SR，，SO2R，，SO2NRj 2，NR，SO2R，，NR，C0NR，2，NR，COOR，，NR，COR，，CN, C00R，，C0NR，2, 00CR，，COR，和 NO2 取代，其中每个 R’ 可以是 H，C1-C8 烷基，C2-C8杂烷，C3-C8环烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2-C8杂炔或C5-C10杂环取代，每个取代又可被适宜的取代基取代；如果取代基R或R'在相同或相邻的原子上，两者可形成5-8碳的环状化合物，并且环上可以包含一个杂原子。
4.根据权利要求I所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于，所述的碱性磷酸酶标记信号放大组合物，包括了碱性磷酸酶底物，具体还包括以下几项 (1)醇类氧化酶，能分别将碱性磷酸酶水解碱性磷酸酶底物生成的伯醇或叔醇氧化成相应的醛或酮化合物； (2)醇类脱氢酶，能将生成的醛和酮化合物转化为醇化合物； (3)参与还原反应的共反应物——NADH，其与醇类脱氢酶共同作用能将生成的醛和酮化物转化为醇化物； (4)用于检测副产物H2O2的试剂。
5.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述的醇类氧化酶包括醇氧化酶(EC1. I. 3. 13)或二级醇氧化酶(EC1. I. 3. 18);所述的醇氧化酶(EC1. I. 3. 13)包括但不限于自然提取、工程菌表达制备及基团修饰处理的乙醇氧化酶；二级醇氧化酶(EC1. I. 3. 18)包括但不限于自然提取、工程菌表达制备及基团修饰处理的二级醇氧化酶； 所述的醇类脱氢酶包括醇脱氢酶(EC1. I. I. I)或S-二级醇脱氢酶(EC1. I. 1.B3);所述的S-二级醇脱氢酶(EC1. I. I. B3)包括但不限于自然提取、工程菌表达制备的及基团修饰处理的S- 二级醇脱氢酶。
6.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述的NADH包括还原型的NAD+或合适的衍生物——乙酰-NADH或硫代-NADH。
7.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述测量副产物H2O2的试剂包括通过比色法、电化学法、化学发光法或荧光法进行检测的试剂。
8.根据权利要求7所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述比色法的检测试剂包括辣根过氧化物酶，4-乙酰氧基氮杂环丁酮，酚类化合物，和/或苯胺类似物； 所述的化学发光法检测试剂包括发光底物——鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N_乙基异鲁米诺、N- (6-氨基已基)-N_乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺、N- (4-异硫氰基丁基)-N_乙基异鲁米诺、吖啶酯、光泽精、洛粉碱，邻菲罗林和/或催化剂——Cu2+，Co2+，铁氰酸盐，过氧化物酶。
9.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述碱性磷酸酶包括单独的碱性磷酸酶或与抗原，半抗原，抗体，蛋白质，核酸或寡聚核苷酸相连接的碱性磷酸酶；其中“抗体”不仅指完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段，单链，微型双功能抗体，多特异性抗体，突变体及其融合蛋白，包括抗体部分和其他任何修饰的免疫球蛋白分子及所需的特异性抗原识别位点；任何类型的IgG，IgA或IgM及其子类均可以使用。
10.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大系统，其特征在于所述碱性磷酸酶底物及其碱性磷酸酶标记信号放大组合物可做成试剂盒的形式，该试剂盒为每个组分单独包装或根据试剂的性质将有些组分混合包装，该试剂盒还包括用于校准检测系统的一个或多个标准及检测说明。
全文摘要
本发明公开一种碱性磷酸酶标记信号放大系统，以烷烃，烯烃或炔烃醇磷酸酯为底物，在碱性磷酸酶作用下产生游离的磷酸及相应的醇化合物，醇化合物在氧气的参与下经醇类氧化酶作用生产醛或酮化合物及过氧化氢(H2O2)，生成的醛和酮化合物在NADH存在下经醇类脱氢酶作用还原成醇化合物，生成的醇化合物继续参与循环反应。循环生成的大量H2O2配合不同底物经过氧化物酶催化后可通过比色法、电化学法、化学发光法或荧光法进行检测。因此，本系统可灵敏的对单独的碱性磷酸酶或与抗原，半抗原，抗体，蛋白质，核酸及寡聚核苷酸相连接的碱性磷酸酶进行检测，起到放大信号作用。所述的底物结构式如下
文档编号G01N27/26GK102706869SQ201210185739
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者沃燕波, 袁艺天, 邹炳德, 邹继华 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司