专利名称：一种血浆游离dna水平检测肝细胞坏死程度的方法
技术领域：
本发明涉及一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，属于生物技术领 域。
背景技术：
肝病是常见的临床疾病，仅乙肝、丙肝等病毒性肝炎患者在世界各国人数接近5 亿，占全球人口的1/12，中国是慢性乙型肝炎高发地区，每年约有35万人死于乙肝相关疾 病，如肝硬化、肝癌、重型肝炎等，的乙型肝炎患者发生重型肝炎。重型肝炎是机体在多 种致病因子作用下，肝脏在短期内的大量坏死所致的肝功能衰竭的一类综合症，其临床表 现特点为病情重、发展快、并发症多、病死率高，迄今仍是肝病领域中亟待解决的难题。目前，临床上检测肝细胞损害最直接的方法就是肝细胞穿刺，但由于其有创性，且 可能造成一定风险，尚不能被广泛接受，而体液中可靠的肝细胞坏死标志尚未完全探索清 楚，有很多血液生化指标可以间接的对肝脏损害进行评价，如转氨酶、胆红素、白蛋白、胆碱 酯酶、凝血酶原活动度等等，但这些实验室指标都各自存在着一些缺点，如胆红素及凝血指 标，都是在肝细胞很大程度上死亡，剩余肝细胞不能代偿时才有变化，且半衰期较长，如白 蛋白半衰期达15-19天，不能及时反应肝脏损伤状态；胆红素由于直接胆红素和间接胆红 素在体内代谢的特点，在临床上，梗阻性黄疸和肝细胞性黄疸有时难以鉴别；转氨酶、胆碱 酯酶等的变化在重型肝炎中肝损害的检测中也只有辅助作用。因此，在重型肝炎诊断标准 方面一直存在着一些争议，有学者按现行的2000年西安会议修订的慢性乙型重型肝炎病 理学诊断标准确立118例患者，其中17. 8%不符合临床诊断标准，其中少数病例在组织学 上已呈现肝细胞大块、亚大块坏死，PTA仍高达60% ；总胆红素有11例未达到诊断标准，但 病理已证实为重型肝炎。所以，探索新的肝坏死标志物、及时有效的预测重型肝炎的发生及 发展显得极为重要。目前在循环核酸的研究中，循环核小体浓度的研究作为一种预测疾病进展以及预 测疾病发生的重要作用已经公认，它作为机体的一种代谢产物，来源与细胞凋亡与坏死、血 细胞代谢以及淋巴细胞和肿瘤细胞的分泌，与机体的状态、自身免疫性疾病、感染、创伤、移 植、肿瘤、产科疾患都有着关联，目前在定量实验中虽然存在着一些方法学上争论，但各种 定量技术已经非常成熟。而且，在实验前准备、使用血清或者血浆等方面已经达成一定的 共识。而且在肝炎研究方面中，国外已有学者研究了急慢性肝衰竭的核小体变化并比较了 MARS前后的变化，发现了急性肝衰竭患者血浆核小体明显的升高。国内有学者在检测了 重型肝炎患者的血浆核小体水平，认为其比急性肝炎、慢性肝炎及肝硬化升高中，并将其与 ALT进行了相关性比较，其他方面的研究尚未见文献报道，重型肝炎中核小体的定量测定是 可行的。

发明内容
本发明的目的是提供一种血浆游离DNA分离提取方法以及定量，以游离DNA水平
3反映肝细胞坏死程度。为了达到本发明的目的，本发明是这样实现的本发明提供了 一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，包括引物 β -globin标准品制备，肝病患者血浆标本血浆DNA的提取，对血浆标本中提取的血浆DNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应，血浆游离DNA的浓度测算，其特征在于，所述β -globin 标准品为引物合成，上、下游引物分别为上游引物globin-F :ACACAACTGTGTTCACTAGC下游引物globin-R :CAACTTCATCCACGTTCACC。所述的引物β-globin标准品制备方法如下反应总体积25μ 1的β-globin 引物进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C lmin，然后95°C 30s, 57°C 20s, 72°C 20s，共 45个循环；凝胶回收纯化PCR产物；制备DH5a超级感受态细胞；目的基因连接转化及转 化后测序验证；提取质粒，并进行定量；所述β -globin重组质粒长度为2802bp，浓度为 2. 58X1013copies/ml, 10倍梯度稀释后即为所须标准品。所述的肝病患者血浆样本血浆DNA的提取方法如下取300 μ 1血浆，按1 3 体积加入裂解液 900 μ 1 (0. IM Tri-HCL 90 μ 1,0. 05Μ EDTA90 μ 1,1% SDS 450 μ 1，ddH20 270μ 1)，加入6μ 1蛋白酶!((Proteinase K 20mg/ml)至终浓度为100 μ g/ml，于振荡器上 混勻10s，短暂离心后于56°C水浴2h ；水浴混合液体于95°C水浴lOmin，变性Proteinase K;短暂离心，加入等体积Tris饱和酚氯仿异戊醇(体积比25 24 1)混合液 1200 μ 1，振荡器上充分混勻，约2-3min ； 12，OOOrpm离心15min，小心吸取上清，置于新EP 管中(建议使用进口 EP管)；于上清液中加入其2. 5倍体积的无水乙醇(约3000 μ 1)，颠 倒混勻，于_20°C过夜沉淀(12h以上)；常温12，OOOrpm离心20min，小心去上清；加入2 倍体积的70%乙醇800 μ 1，常温12，OOOrpm离心IOmin ；小心去上清，于56°C烘箱中放置 20min，后置于超净台Ih彻底挥发酒精；加入40 μ 1 ddH202溶解DNA，轻微震荡，短暂离心， 置于4°C Ih充分溶解DNA ；DNA标本于_20°C保存。所述的血浆标本中提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应包括以下步 骤反应总体积20μ 1的β-globin引物进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C lmin，然后 95°C 30s, 57°C 20s，72°C 32s，共 45 个循环。所述的血浆游离DNA的浓度测算包括将已知浓度为2.58X1013COpieS/ml的 β -globin重组质粒作为标准品系列10倍等比稀释，使其终浓度分别为2. 58 X IO5Copies/ μ 1、2· 58X IO4Copies/μ 1、2· 58X IO3Copies/μ 1、2· 58X IO2Copies/μ 1，建立标准曲线确 立Ct值与标准品起始模板的对数之间的线性关系；血浆中循环核小体的量按下式计算C =QX (VDNA/VPCE) X (1/Vext)，其中C为待测样品血浆循环核小体浓度(GE/ml)，Q为仪器分析 软件所计算的DNA量(copies)，Vdna为抽提出的DNA总量(40 μ 1),VPCE为加入到反应体系 中DNA量(9. 5 μ 1)，Vext为用于抽提和纯化DNA的血浆总量(300 μ 1)。本发明在对肝病患者提取的血浆标本血浆DNA中，通过引物β -globin标准品进 行实时荧光定量聚合酶链反应，测算血浆游离DNA的浓度，为重型肝炎的诊断提供新的诊 断指标。
具体实施例方式

图1为2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果图，图中1，2，3，4，5为全基因组DNA的
4PCR 扩增产物，Maker 为 DL500 marker。图2为琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒结果图，图中Marker为DL2000 marker, 1,2 为β-globin重组质粒。图3为样本扩增曲线图。图4为样本标准曲线图，图中斜率为-3. 664065，截距为44. 995626，R2为 0.996965。图5为血浆游离DNA在各肝病组间分布图，图中a 肝炎病人血浆中游离DNA主要 分布于 15-20 (Iog2) ；b Iog2 (cell free DNA) < 15 主要分布于 DLC 组；c Iog2 (cell free DNA) > 20主要分布于LF，AH and HCC组与DLC组。图6为血浆游离DNA在各组中平均值分布图。图7为游离DNA水平与各检测项目相关性图，图中血浆游离DNA Iog2 > 20 :a.游 离DNA与MELD评分R2 = 0. 72，P值0. 002 ；b.游离DNA与血清胆固醇水平存在相关性R2 =0. 575，P值0. 011 ；c.游离DNA与血清直接胆红素浓度存在相关性R2 = 0. 591，P值 0. 009 ；d.游离DNA与血清Na离子水平存在相关性R2 = 0. 707，P值0. 002 ；e.游离DNA 与白细胞水平存在相关性R2 = 0. 588，P值0. 010 ；f.游离DNA与单核细胞水平存在相关 性=R2 = 0. 934，P 值0. 000。图8为ALT > 500U/L时，a.血浆游离DNA与MELD评分存在相关性R2 = 0. 615， P值0. 000 b.血浆游离DNA与血浆胆固醇水平存在相关性R2 = 0. 353，P值0. 001。图9为肌酐大于3mg/dl时，血浆游离DNA与血清肌酐存在相关性，R2 = 0. 756，ρ 值0. 005。下面结合附图对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。实施例一，引物β-globin标准品的制备。1、实验主要试剂及器材1)氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钠、氯化钾、无水乙醇、冰乙酸、乙酸氨、乙酸钠、异戊
醇等常用化学试剂均为西安化学试剂厂生产，纯度级别为分析纯；2)EB(Sigma公司产品分装，购于华美生物工程公司)；3) loading buffer (宝生物TaKaRa产品分装，购于西安周鼎国生物工程公司)；4)琼脂粉(GEGE TECH上海有限公司，购于西安周鼎国生物工程公司)；5)琼脂糖(Amresco公司原装产品，购于西安周鼎国生物工程公司)；6)核酸分子量参照物500bp DNA maker,2000bp DNA maker (西安沃尔森生物工程 公司)；7)上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒；8) Promega中量质粒提取试剂盒；9)上海生工生物工程有限公司UNIQ-5柱式DNA胶回收试剂盒；10) β -globin 引物合成上游引物 globin-F :ACACAACTGTGTTCACTAGC，下游引物 globin-R :CAACTTCATCCACGTTCACC,由上海生工生物技术有限公司合成和标记；11)PCR反应试剂含Taq酶，反应缓冲液，镁离子，dNTP(宝生物TaKaRa产品，购于 宝泰克生物工程公司)；上述试剂按照说明储存。
主要器械单道可调式微量移液器一次性离心管恒温培养箱恒温振荡器全自动生化分析仪压力蒸汽灭菌器温度梯度程控PCR扩增仪紫外凝胶成像仪系统低温离心机
型号或规格 1000 μ 1 200 μ 1 10 μ 1 0. 5ml 1. 5ml PXY-DHS 400-BS CHA-S AU5400 LDZX-50KB
2104142 型 T2A型
Sigma,3-18K
上海博泰有限公司 国华企业有限公司 日本OLYMPUS公司 上海申安医疗器械厂 德国Biometra公司 意大利Bio-RAD公司 德国SIGMA公司
德国Eppendorf公司 美国BD公司
生产公司2、PCR 扩增用β -globin弓丨物对人全基因组DNA进行扩增，反应总体积25 μ 1，按以下体系进行扩增条件预变性95°C lmin，然后 95°C 30s,57°C 20s,72°C 20s，共 45 个循环。2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，于1 IObp左右出现清晰条带，即目的条带，如图 1，确立β-globin基因扩增条件。3、凝胶回收采用切胶纯化法(按上海生工生物工程有限公司UNIQ-5柱式DNA胶回收试剂盒 说明进行)步骤如下1)取一个新鲜、灭菌1. 5ml离心管称重。2)于紫外透射仪中铺上一块新鲜的保鲜纸，将凝胶(见图3-1)放在保鲜纸上(以 尽量提高DNA回收的纯度)，打开长波紫外灯用干净的手术刀快速将目的片段(IlObp左 右)从琼脂糖凝胶上切下来(尽可能去除多余的琼脂糖胶)。切下来的胶块放入1. 5ml的 离心管中，用微量电子天平称重并作好记录。3)按每IOOmg琼脂糖凝胶加入400 μ 1 Binding buffer的量来计算，加入相应体 积的Binding buffer,混勻后置于50_60°C水浴中lOmin，使胶彻底融化(加热融胶时，每 2min混勻一次)。4)将融化的胶溶液转移到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2min，用 台式离心机高速(6000rpm)离心lmin。5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，加入 500 μ 1 Wash solution, 8000rpm lmin。6)重复步骤5 —次。7)取下UNIGKO柱，倒掉收集管中的废液，将UNIGKO柱放回收集管中，12，OOOrpm lmin。8)将UNIQ-10柱放入一新鲜洁净的1. 5ml离心管中，在柱膜中央加30 μ 1 Elution反应液组份加量(μ )终浓度PCR 试剂混合物 2χ 12.5Ix上游引物FlOumol 0. 50. 125umol下游引物RlOumol 0.50. 125umol待测样品(或标准品)2. 0无菌去离子水9. 5
6Buffer到UNIQ-10柱中，室温放置2min。(提高洗脱温度至55_80°C有利于提高DNA的洗 脱效率) 9) 12，OOOrpm室温离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，保存于_20°C10)取3 μ 1 PCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，1. 5%琼脂糖电泳检查回收率， 出现IlObp左右较淡的单一条带，DNA回收纯化成功。4、制备超级感受态细胞1)制备前准备(1)配制SOB培养基配制每IL培养基，在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g，酵母提取物5g， NaCl 0. 5g。磁力搅拌器使溶质完全溶解。加IOml 250 mmol/L KCl溶液。用5mol/L NaOH 调PH值至7.0。用去离子水定容至1L。高压下蒸汽灭菌20min 4°C保存。注意该溶液在使 用前，加入5ml灭菌的2mol/L MgCl20(2)配制SOC培养基配制lmol/L的葡萄糖溶液将18g的葡萄糖溶解在90ml的去离子水中，定容至 100ml，用0.22 μ m滤膜过滤除菌。向100ml SOB培养基中加入除菌的lmol/L葡萄糖溶液 2ml，均勻混合。4°C保存。(3) LB培养基配制配制每IL培养基，应该在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物 5g, NaCl IOgo磁力搅拌器使溶质完全溶解。用5mol/LNa0H调pH至7.0。用去离子水定 容至1L，高压下蒸汽灭菌20min。(a).配制LB-AMP抗性培养基配制LB液体培养基100ml，步骤同上。LB液体培养基中加1. 5%琼脂粉，高压灭菌消毒20min。从高压锅中取出培养基，轻轻旋动使溶解的琼脂粉均勻分布。含氨苄青霉素Amp的LB固体培养基将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至 60°C左右，加入氨苄青霉素储存液(原浓度为50mg/ml) 120 μ 1。(b). LB/AMP/X-Gal/IPTG 培养皿配制同上配制LB-AMP抗性培养基，取IOOmm无菌培养皿，每个中倒入约35ml，凝固。滴 加20mg/ml的X_gal 50 μ 1禾口 24mg/ml的IPTG 100 μ 1，均勻涂布于平板培养基上。(4) Inoue转化液的配制配制IL Inoue 转化液，分别称取 10. 88g 的 MnCl2 ·2Η20、1· 665g 的 CaCl2、18. 65g 的KCl加入800ml的去离子水中，完全溶解后加入20ml的PIPES，然后用去离子水定容至 1L，0. 45 μ m滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存，备用。2)使用Inoue方法制备超级感受态细胞步骤如下(1)挑取一个在37°C过夜培养的DH5 α大肠杆菌单个菌落(直径2 3mm)，接种 至250ml锥形瓶中的25ml LB培养液中，于37°C摇床250rpm培养8h ；(2)8h后，将上述初始培养物接种于三个盛有250ml LB培养液的IL锥形瓶中，第一个加10ml，第二个加4ml，第三个加2ml，于18°C 200rpm转速的摇床过夜培养；(3)次日早上，测量三瓶培养物的0D_值，每45min测定一次，当有一瓶的培养物 OD600 = 0. 55时，将培养瓶置于冰水浴中lOmin，摇动培养瓶使培养物充分降温，弃去另两瓶 培养物；(4)于4°C以2500g离心IOmin收集菌体；(5)倒去培养液，将离心管中剩余液体尽量甩干，用吸水纸吸干；(6)加入40ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细胞沉淀，轻轻旋转混勻，不要用振荡 器或吹吸混勻，4°C 2500g离心IOmin收集菌体，弃去上清；(7)将离心管中剩余液体尽量甩干，加入IOml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬 沉淀；(8)加入750 μ 1 DMS0。轻轻混勻，放置冰水浴中IOmin ；(9)迅速将悬液以每管100 μ 1分装到冷却的无菌1. 5ml离心管中，封紧管口，没入 液氮中快速冰冻感受态细胞(半小时以上)。贮存于-80°C备用。5、目的基因的连接和转化连接建立10 μ 1连接反应体系(按照TaKaRa pMD18T载体说明书)PMD18T 载体1μ 1，β -globin DNA (前面经过纯化):1 μ 1，ddH20 :3μ 1力Π入5 μ 1的solution I轻轻混勻后在16°C水浴箱内反映30min ；同时设置阴性 对照和阳性对照。转化1)从-80°C取100 μ 1 (1管)DH5 α感受态细胞握在手心迅速融化后置冰上 IOmin ；2)把反应30min后的连接反应物(10 μ 1)用预冷的枪头移入感受态细胞悬液中， 轻轻混勻后冰上放置30min ；3) 42°C水浴热激 90s ；4)快速转到冰浴2min ；然后加入900 μ 1 SOC培养基；5)37°C，225rpm 振荡培养 60min ；6)涂布取50 μ 1的转化液滴在37°C预热的平板LB/AMP/X-Gal/IPTG培养皿上， 用无菌涂布器将其均勻涂开，置于37 °C培养箱培养，待转化液完全吸收后，倒置培养皿，继 续培养12-16h ；7)将培养板取出，4°C放置5h，使蓝色充分显色。目的菌落出现；8)摇菌取2个50ml离心管，各加入5ml LB/AMP培养基。用无菌牙签分别挑取2 个白色克隆菌落，接种到50ml离心管内，标注为1、2 ；9)37°C、225rpm振荡培养。8h 后，测 OD 值=ODl :0· 885、0D2 1. 320 (取 2ml 菌液用 于提取重组质粒，另外使用30%甘油保存菌液，以备后续的验证实验使用)。6、小量提取重组质粒1)将培养好的2ml菌液12000rpm离心lmin，去上清；2)加250 μ 1 Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌；3)加入250μ1 Solution II，立即上下颠倒5 10次，使细菌裂解，室温放置2min ；
4)加入350 μ 1 Solution III，立即上下颠倒5 10次，使之充分中和，室温放置 2min ；5) 12，OOOrpm 离心，5min ；6)将步骤5中的上清转移至已套放于2. Oml收集管内的UNIQ-10柱中，12，OOOrpm 室温离心Imin ；7)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，吸取500μ 1 Wash Solution 到 UNIQ-10 柱，12，OOOrpm 室温离心 Imin ；8)重复步骤7);9)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，12，OOOrpm室温离心 2min 以彻底去除 Wash Solution ；10)将UNIQ-10柱放入新的洁净1. 5ml离心管中，加50 μ 1 DW(或Elution Buffer)，室温放置2min后，10，OOOrpm室温离心lmin。离心管中的溶液即为所抽提的质粒 DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定是否提出质粒，出现均一条带，如图2。7、鉴定所提质粒(PCR法初步验证)使用β -globin引物进行扩增体系25 μ 1，具体组成如下反应液组份加量(μ ) 终浓度PCR 试剂混合物(2χ) 12.5Ix上游引物IOumol0.50. 2umol下游引物IOumol0.50. 2umol质粒DNA2无菌去离子水9.5PCR仪设置条件预变性95°C Imin ；变性95°C 30s，退火57°C 20s,延伸72°C 20s，共45个循环。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果出现大小为IlObp目的条带。(初步证明目的基因转化DH5a成功，为了进一步验证，将保存的菌液重新增菌后 送公司测序)测序结果经比对表明β -globin已连于T载体上并转化成功。8、中量提取重组质粒操作过程如下(1)取5(^1^重组质粒转化菌液接种到51^的1^/^1^培养基，371震荡培养6-811。 然后取2ml菌液加入100ml S0B/AMP培养基内过夜培养；(2)次日，测0D_ = 1. 983。室温下5000g离心lOmin，收集菌体，并尽可能的吸去
上清；(3)加入3mL细胞重悬液(cell resuspension)，涡流震荡确保细菌沉淀重新悬 浮；(4)加入3mL细胞裂解液(cell lysis solution)，轻轻地颠倒5-10次以混合均 勻，然后静置3min至溶液粘稠而澄清；(5)加入5mL中和液(Neutralization)，立即轻柔颠倒5次，静置2min ；(6)将蓝色离心柱放入50ml离心管，将第4步所得的混合液移至柱子内，在室温下
91500g离心5分钟(若仍有液体，可再次离心)；(7)将白色吸附柱放入干净的50ml离心管，将第5步收集的液体转移至白色吸附 柱内，3000rmp 离心 30min ；(8)向白色吸附柱内加入5mL内毒素去除液，室温下3000rpm离心3min，倒掉收集
管中的废液，将柱子重新放回到收集管中；(9)向白色吸附柱内加入20ml纯化洗柱液3000rpm离心5min，弃废液，将柱子重 新放回收集管，3000rpm离心5min，以去除洗涤液中的乙醇；(10)将白色吸附柱移到一个新的50ml离心管，室温下5，OOOg开盖离心lOmin，以 彻底去除残留的乙醇；(11)将白色吸附柱转至一个新的50ml离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.6ml的 ddH20(pH在7. 0-8. 5之间)，室温放置lmin, 2000g离心5min,以洗脱质粒DNA ；(12)提高得率，可用第10步所得的液体再洗脱一次，离心后收集到离心管中，即 所提取的质粒DNA。9、定量测OD值，采用紫外吸收法，测量OD26tl的吸收值。计算机直接测出β -globin重组 质粒的浓度为 79. 4ng/ μ 1 ；将ng/μ 1 换算为 copies/ml :copies/ml = (6. 02 X IO23) X (ng/ μ 1X1(T6)/(DNA lengthX 660)；β -globin重组质粒长度为β -globin与T载体碱基数之和，为2802bp，最终换算 出浓度为2. 58X1013copies/ml, 10倍梯度稀释后即为所须标准品。实施例二，血浆核小体的提取及定量1、实验主要材料荧光PCR 反应混合物 SYBR Premix Ex Taq ，含 SYBR Green I，反应缓冲液，dNTP， TaKaRa Ex Taq TM HS，镁离子(宝生物TaKaRa产品，购于宝泰克生物工程公司)，试剂按照
说明储存。血常规管 荧光定量PCR伩 微量加样器吸头 PCR反应管 低温离心机
5
Q
I
说明书
美国Bio-Rad公司
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20, 200，ΙΟΟΟμΙ 美国 Axygen 公司 0.2ml 8连管 日本TaKaRa公司 3-18K德国SIGMA公司
单道可调式微量移液器1 ΟΟΟμΙ 200μ1 10μ1德国Eppendorf公司 一次性离心管0.5ml 1.5ml 美国BD公司2、研究对象西安交通大学医学院第一附属医院感染科2009年3月至2010年6月间收住的乙 型肝炎、丙型肝炎以及药物性肝炎引起的急、慢性肝损害患者、肝癌患者共204例。临床诊 断符合2000年西安会议修订的病毒性肝炎防治方案。年龄5-79岁，平均45. 14士 14. 547 岁；其中男性146例，年龄5-79岁，女性58例，年龄16-73岁。所有病例均排除系统性红斑 狼疮和类风湿性关节炎等全身性自身免疫性疾病。3、标本的采集晨起后未进食前采集患者及志愿者标本，于肘静脉抽取静脉血3ml置于EDTA抗凝 管中，标本于2h内进行下一步处理。4、标本处理和保存1)将标本配平后置于低温超速离心机于4°C下1600g离心IOmin ；2)轻轻地取出试管，用ΙΟΟΟμΙ可调式移液器(使用一次性高压消毒枪头)吸取 上层血浆，置于1. 5ml的经过高压消毒处理后的微离心管中；3)配平微离心管后，置于低温超速离心机于4°C下1，6000g离心IOmin ；4)轻轻地取出离心管，用ΙΟΟΟμΙ可调式移液器(使用一次性高压消毒枪头)吸 取上清液，装于1. 5ml的经过高压消毒处理后的离心管中，并按照标本登记标明编号；5)于-80°C保存上述血浆标本备用，以上备用标本保存过程中，严格注意保存条 件，防止反复冻融。5、检测临床指标标本采集同时采血进行以下项目检测血常规测定、肝功十项测定、凝血四项测 定、肾功能测定，所有患者血清样品检测在我院检验科完成。6、血浆DNA提取血浆游离DNA提取采用经典酚、氯仿、异戊醇(体积比25 24 1)抽提方法。1)取 300μ 1 血浆，按 1 3 体积加入裂解液 900 μ 1 (0. IMTri-HCL 90 μ 1,0. 05Μ
11EDTA 90μ 1,1% SDS 450 μ l,ddH20 270 μ 1)，加入6 μ 1 蛋白酶!((Proteinase K 20mg/ml) 至终浓度为100 μ g/ml，于振荡器上混勻10s，短暂离心后于56°C水浴2h ；2)第一步混合液体于95°C水浴lOmin，变性Proteinase K ；短暂离心，加入等体 积Tris饱和酚氯仿异戊醇(体积比25 24 1)混合液1200 μ 1，振荡器上充分混 勻，约 2-3min ；3) 12，OOOrpm离心15min，小心吸取上清，置于新EP管中(建议使用进口 EP管)；4)于上清液中加入其2. 5倍体积的无水乙醇(约300(^1)，颠倒混勻，于_201过 夜沉淀(12h以上)；5)常温12，OOOrpm离心20min,小心去上清；6)加入2倍体积的70%乙醇800 μ 1，常温12，OOOrpm离心IOmin ；7)小心去上清，于56°C烘箱中放置20min，后置于超净台Ih彻底挥发酒精；8)加入60 μ 1 ddH20溶解DNA，轻微震荡，短暂离心，置于4°C Ih充分溶解DNA ；9) DNA 标本于 _20°C保存。7、对所有提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应1)引物，即 β -globin 引物。上游引物 globin-F :ACACAACTGTGTTCACTAGC，下游引 物globin-R :CAACTTCATCCACGTTCACC。由上海生工生物技术有限公司合成和标记。2)反应体系总体积20μ 1，定量标准品、阳性、阴性对照及待测样本均按以下体
系进行。
权利要求
一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，包括引物β globin标准品制备，肝病患者血浆标本血浆DNA的提取，对血浆标本中提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应，血浆游离DNA的浓度测算，其特征在于，所述β globin标准品为引物合成，上、下游引物分别为上游引物globin FACACAACTGTGTTCACTAGC下游引物globin RCAACTTCATCCACGTTCACC。
2.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，其特 征在于，所述的引物β-globin标准品制备方法如下反应总体积25μ1的β-globin 引物进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C lmin，然后95°C 30s, 57°C 20s, 72°C 20s，共 45个循环；凝胶回收纯化PCR产物；制备DH5a超级感受态细胞；目的基因连接转化及转 化后测序验证；提取质粒，并进行定量；所述β -globin重组质粒长度为2802bp，浓度为 2. 58X1013copies/ml, 10倍梯度稀释后即为所须标准品。
3.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，其特 征在于，所述的肝病患者血浆样本血浆DNA的提取方法如下取300 μ 1血浆，按1 3体 积加入裂解液 900 μ 1(0. IMTri-HCL 90 μ 1,0. 05Μ EDTA 90 μ 1,1 % SDS 450 μ 1, ddH20 270μ 1)，加入6μ 1蛋白酶!((Proteinase K 20mg/ml)至终浓度为100 μ g/ml，于振荡器上 混勻10s，短暂离心后于56°C水浴2h ；水浴混合液体于95°C水浴lOmin，变性Proteinase K;短暂离心，加入等体积Tris饱和酚氯仿异戊醇(体积比25 24 1)混合液 1200 μ 1，振荡器上充分混勻，约2-3min ； 12，OOOrpm离心15min，小心吸取上清，置于新EP 管中(建议使用进口 EP管)；于上清液中加入其2. 5倍体积的无水乙醇(约3000 μ 1)，颠 倒混勻，于_20°C过夜沉淀(12h以上)；常温12，OOOrpm离心20min，小心去上清；加入2 倍体积的70%乙醇800 μ 1，常温12，OOOrpm离心IOmin ；小心去上清，于56°C烘箱中放置 20min，后置于超净台Ih彻底挥发酒精；加入40 μ 1 ddH202溶解DNA，轻微震荡，短暂离心， 置于4°C Ih充分溶解DNA ；DNA标本于_20°C保存。
4.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，其特征 在于，所述的血浆标本中提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应包括以下步骤 反应总体积20 μ 1的β -globin引物进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C lmin,然后 950C 30s, 570C 20s, 72°C 32s，共 45 个循环。
5.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，其 特征在于，所述的血浆游离DNA的浓度测算包括将已知浓度为2. 58X1013copies/ml的 β -globin重组质粒作为标准品系列10倍等比稀释，使其终浓度分别为2. 58 X IO5Copies/ μ 1、2· 58X IO4Copies/μ 1、2· 58X IO3Copies/μ 1、2· 58X IO2Copies/μ 1，建立标准曲线确 立Ct值与标准品起始模板的对数之间的线性关系；血浆中循环核小体的量按下式计算C =QX (VDNA/VPCE) X (1/Vext)，其中C为待测样品血浆循环核小体浓度(GE/ml)，Q为仪器分析 软件所计算的DNA量(copies)，Vdna为抽提出的DNA总量(40 μ 1)，Vpck为加入到反应体系 中DNA量(9. 5 μ 1)，Vext为用于抽提和纯化DNA的血浆总量(300 μ 1)。
全文摘要
本发明涉及一种血浆游离DNA水平检测肝细胞坏死程度的方法，属于生物技术领域。本发明是通过一种血浆游离DNA分离提取方法以及定量，以游离DNA水平反映肝细胞坏死程度，包括引物β-globin标准品制备，肝病患者血浆标本血浆DNA的提取，对血浆标本中提取的血浆DNA进行实时荧光定量聚合酶链反应，血浆游离DNA的浓度测算，为重型肝炎的诊断提供新的诊断指标。
文档编号G01N21/64GK101955998SQ20101023319
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者何英利, 刘红莉, 崔美灵, 李倩, 王科, 赵英仁, 阎志, 陈天艳 申请人:赵英仁