专利名称：微型全息式生物传感反应器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种可用于代谢通量分析的微型全息式生物传感反应器系统及其应用。
背景技术：
对于生物产品生产来说，要想提高和改进生产工艺过程，首先必须对微生物胞内的代谢状态有个详细的了解，这方面研究最有力的工具是利用代谢网络通量分析方法，来对细胞的生理状态参数和代谢变化情况进行测定。代谢通量(metabolic flux)是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。代谢通量分析(metabolic flux analysis,MFA)是根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验中所测得的数据来确定整个代谢反应网络中代谢通量分布的一种方法，在代谢工程中占有重要地位。通过计算不同途径或不同条件下的代谢通量分布，可以表征细胞的代谢能力，洞察遗传修饰对细胞代谢状态的影响，从而为进一步更加合理的遗传改造提供理论依据。MFA已经成功应用到了多种生物代谢途径优化中，实现了包括有机酸、维生素、乙醇等多种目的产物产率的提高。MFA经历20多年的迅猛发展，无论在实验方法、测量手段、 还是数据分析与评估方面，所涉及的相关技术日趋完善，已经成为代谢工程中一种标准且广泛应用的诊断工具。传统的MFA是基于物质守恒，利用胞内主要化学反应的化学计量模型及胞内的物料平衡(黑箱模型)计算胞内的代谢通量，因此也称之为计量学MFA(Vallinc), J. J. and Stephanopoulos, G.，1993)。计量学MFA的测量参数主要包括底物吸收速率、产物生成速率、生物量的组成及⑶2的释放等(vanGulik，1995 Jin, S.，1997)。然而这种计量学MFA在处理实际问题时显示出很多局限性(Zupke，1994)首先这种局限性表现在能量平衡分析上，能量平衡分析需要确定细胞中所有涉及辅因子(NADH或NADPH等)和ATP的产生与消耗的反应，由于全面确定与能量相关的反应非常困难，所以由此计算出来的某些通量并不准确；其次，在原核生物中存在大量无效循环，这对计量学MFA处理能量平衡问题带来了更大的困难；再次，计量学MFA不能确定细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应及并行反应中的净通量。而这些途径的存在和通量的大小在产物的合成过程中却起着非常重要的作用(Wolfgang Wiechert，2001)。近年来，基于计量学MFA的上述局限性，发展了以％标记实验(13Clabeling experiments, CLEs)为基础的 1V 代谢通量分析("C-metabolic fluxanalysis, 13C-MFA), 该方法利用标记的葡萄糖、甘油、氨基酸和甲醇等底物进行标记代谢实验，根据代谢过程中原子的生化途径代谢变化，建立物质碳原子与碳原子之间的映射对应网络矩阵，并根据得到的标记碳原子的质量风度分部信息，对代谢流通量进行计算(khmidt，K.，1997 ； Christensen, B.，and Nielsen, J.，1999 ；Stephanopoulos, G. 1999，)。1V-MFA 最典型的应用是在连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用这时的菌体蛋白组成原氨基酸的标记信息，来对中心代谢通量进行计算。然而，该方法的主要缺点在于由于这些原蛋白是在整个过程中生成的，所以不能代表代谢过程中某一时刻的代谢流变化，从而不能对瞬时代谢流进行测定分析，只能对于处于对数生长期和连续培养的拟稳态过程进行原蛋白氨基酸的丰度测定，来计算该过程的代谢通量。近年来，一些研究成果表明，利用胞内游离的氨基酸信息，而不是原蛋白氨基酸的信息来进行代谢通量分析是一种行之有效的方法。在菌体细胞的非生长期，菌体原蛋白氨基酸的更新速率非常慢，但胞内游离氨基酸池的变化速率非常快，所以游离氨基酸的标记丰度信息可以用于胞内瞬时代谢通量的分布信息。Kromer和Wittmarm，C.等利用GC-MS 通过测定批次培养过程中不同时刻的胞内游离氨基酸的来分析谷氨酸棒杆菌的代谢通量； Wahl (2004年)利用NMR分析了 L-Phe生产菌合成过程中的代谢变化；Drysch在2004年利用游离氨基酸信息研究了 Lys合成过程通量分析。Van Winden在2005年提出了 13C-MFA分析的新方法，该方法基于快速取样和细胞的快速灭活。在连续培养过程中利用LC-MS分析胞内游离氨基酸的丰度信息用于代谢流的计算；Iwatani S.等提出了在代谢流分析过程中，增加了对胞内外已存在的中间代谢物影响的校正。前体物质、游离氨基酸和菌体氨基酸之间的相互影响也进行了讨论分析。同位素标记实验的真正目的是要用于指导生产过程的，由于标记底物的价格非常昂贵，因此限制了同位素标记试验在25升、50升或更大体积的发酵罐或反应器代谢通量分析中的直接应用。所以，需要利用微型反应器去跟踪生产发酵罐，通过在微型反应器中进行标记试验从而进行代谢通量的分析。综上所述，本领域尚缺乏准确、及时、不昂贵的了解发酵过程中微生物代谢通量的技术，因此迫切需要开发新的能够准确、及时、价廉地测定发酵过程中微生物代谢通量方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种准确、及时、价廉地测定发酵过程中微生物代谢通量的方法以及相关设备。在本发明的第一方面，提供了一种用于同位素标记的代谢通量分析的微型反应器装置，所述的装置包括1) 一用于微生物发酵的微型反应器，所述的微型反应器配有测定发酵体系的溶氧传感器、PH传感器和温度传感器；并且，所述的微型反应器配有进气管、排气管、补料管和取样管；并且，所述的微型反应器的容积为30_500ml ；2) 一用于采集发酵参数的数据采集装置，所述的数据装置与所述的溶氧传感器、 PH传感器和温度传感器相连；3) 一用于调节供氧水平和补料的控制系统，所述的控制系统包括控制空气进气的微型质量流量计、控制搅拌的磁力搅拌器以及控制补料的蠕动泵；4)用于对微型反应器的排气的中分子量为45的"C标记二氧化碳和分子量为44 的非标记的二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪；以及5)用于测定发酵体系中"C标记的氨基酸的气相-质谱联用仪系统(GC-MS系统)，所述的GC-MS系统对发酵过程的取样样品进行(a)菌体水解的氨基酸和/或(b)胞内游离的氨基酸的测定，从而得到用于代谢通量分析的标记丰度数据。在另一优选例中，在所述装置中，通过微型质量流量计和磁力搅拌器，根据发酵体系对供氧的需求而自动调节进气流量和搅拌转速；并且，所述装置根据补料速率的设定和称量所述微型反应器重量的电子称的读数，自动调节蠕动泵的转速，从而控制补料与否以及补料速度。在另一优选例中，所述的装置还包括用于对反应器的进气中分子量为45的工义标记二氧化碳和分子量为44的非标记的二氧化碳组分进行在线测定的进气气体质谱仪。更佳地，所述的进气气体质谱仪和排气气体质谱仪为同一气体质谱仪。在另一优选例中，所述的微型反应器的容积为50_250ml，更佳地，所述的微型反应器的容积为70-100ml。在另一优选例中，所述的装置还包括一生产反应器，其中所述生产反应器的容积为50升以上(如50-10000升)；以及用于对生产反应器的排气的中二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪。在另一优选例中，用于测定生产反应器和微型反应器的排气的排气气体质谱仪为同一气体质谱仪。在另一优选例中，所述的微型反应器的控制系统根据排气质谱仪对所述生产反应器和微型反应器的排气组分的测定数据，对所述微型反应器实施反馈控制，从而使生产反应器和微型反应器的排气组分的构成尽可能一致。当生产反应器和微型反应器的排气组分的构成相同或相似(尽可能一致)时，可以认为微型反应器中的菌体代谢与生产反应器内菌体的代谢相似或相同。在另一优选例中，所述的温度电极兼作为挡板。在另一优选例中，所述的数据采集装置将温度、溶氧和PH信号通过AD转换器(模拟-数字转换器)进行在线采集。在另一优选例中，所述的数据采集装置还采集补料数据，并将补料信号通过AD转换器进行在线采集。在另一优选例中，所述的装置还包括用于去除进气中二氧化碳的进气预处理装置。在另一优选例中，所述的预处理装置是装有IM的NaOH溶液的容器。在另一优选例中，所述的微型反应器的径高比为1 1.8-2.2。在另一优选例中，所述的磁力搅拌器通过带动微型反应器中磁力转子进行搅拌控制。在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的微型反应器装置的用途， 它被用于13C同位素标记的代谢通量测定。在本发明的第三方面，提供了一种13C同位素标记的代谢通量测定方法，包括步骤1)在本发明第一方面中所述的微型反应器装置中的微型反应器中，在1 标记的碳源存在下，进行微生物发酵培养；
2)在发酵培养过程中，从微型反应器的发酵体系中取样，获得待分析的样品；3)通过所述的微型反应器装置中的气相-质谱联用仪系统，对取样样品进行(a) 菌体水解的氨基酸和/或(b)胞内游离的氨基酸的测定，得到用于代谢通量分析的标记丰度信息，从而获得代谢通量的测定结果。在另一优选例中，所述方法还包括在一生产反应器中，在无1V标记的碳源存在下，进行微生物发酵培养，其中，所述生产反应器的容积为50升以上(如50-10000升)；并且在发酵培养过程中，对所述生产反应器和微型反应器的排气组分的分别进行测定，并对所述微型反应器实施反馈控制，从而使微型反应器的排气组分的构成与生产反应器的排气组分的构成尽可能一致(相同或相似)。在另一优选例中，所述的反馈控制通过以下方式进行通过微型质量流量计和磁力搅拌器，根据发酵体系对供氧的需求而自动调节进气流量和搅拌转速；和/或，所述装置根据补料速率的设定和称量所述微型反应器重量的电子称的读数，自动调节蠕动泵的转速，从而控制补料与否以及补料速度。在另一优选例中，所述方法还包括在"C标记的二种或两种以上碳源存在下，进行微生物发酵培养；并且对微型反应器的发酵体系的排气中的分子量为45的1V标记二氧化碳和分子量为 44的非标记的二氧化碳组分进行在线测定，并根据测量值计算代谢通量。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再 --累述。


图1显示了本发明一个实例中的全息式传感反应系统。图2显示了本发明一个实例中的跟踪生产过程的控制系统。图3显示了 50升发酵罐中的过程的变化曲线(OUR、CER和RQ)。图4显示了微型传感反应器中的跟踪发酵过程变化曲线。图5显示了两个平行的反应器(50升反应器和微型反应器)中在维生素B12的发酵的菌体浓度(按菌体干重(DCW)计)、残糖含量以及胞外氨基酸和有机酸的浓度变化。图6显示了微反应器系统批培养考察甜菜碱利用过程的动态曲线。图7显示了 50L生产罐发酵过程曲线图。图8显示了传感反应器中的同位素标记排气信息以及宏观发酵过程参数的实时采集。图9显示了排气中二氧化碳和胞内游离氨基酸的标记丰度变化。图10显示了胞内氨基酸的质量同位素碎片的动态变化。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可用于13C标记代谢流分析实验的微型全息式反应系统(也称为微型反应器装置)。该系统包括一用于微生物发酵的微型反应器；一用于采集发酵参数的数据采集装置；一用于调节供氧水平和补料的控制系统；用于在线测定的排气质谱仪；测定发酵体系中1V标记的氨基酸的气相-质谱联用仪系统。本发明的微型全息式生物传感反应器系统可以准确、及时、价廉地测定发酵过程中胞内的微生物代谢通量。微型全息式反应器系统如本文所用，术语“微型全息式反应器系统”、“微型反应器装置”和“传感反应器” 可互换使用，都指本发明第一方面中所述的装置。本发明的可用于同位素标记的代谢通量分析的微型全息式反应器系统包括1) 一用于微生物发酵的微型反应器，所述的微型反应器配有测定发酵体系的溶氧传感器、PH传感器和温度传感器；并且，所述的微型反应器配有进气管、排气管、补料管和取样管；并且，所述的微型反应器的容积为30_500ml ；2) 一用于采集发酵参数的数据采集装置，所述的数据装置与所述的溶氧传感器、 PH传感器和温度传感器相连；3) 一用于调节供氧水平和补料的控制系统，所述的控制系统包括控制空气进气的微型质量流量计、控制搅拌的磁力搅拌器以及控制补料的蠕动泵；4)用于对微型反应器的排气的中分子量为45的"C标记二氧化碳和分子量为44 的非标记的二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪；以及5)用于测定发酵体系中"C标记的氨基酸的气相-质谱联用仪系统(GC-MS系统)， 所述的GC-MS系统对发酵过程的取样样品进行(a)菌体水解的氨基酸和/或(b)胞内游离的氨基酸的测定，从而得到用于代谢通量分析的标记丰度数据。一种优选的反应器系统如图1所示，具体包括1)微型反应器径高比1 2，容积75_80ml，有溶氧、pH和温度电极接口(同时做挡板用)，有进气管、排气管、补料管和取样管。其中，进气管与微型流量计相连。如图所示，微型反应器宜配有磁力搅拌装置以及AD转换装置。2)数据采集系统和3)控制系统空气由微型质量流量计进行调控，通过磁力搅拌器带动罐体里的磁力转子进行搅拌控制。温度、溶氧、PH及补料装置的信号通过AD转换器进行在线采集和控制。4)气体质谱仪对反应器的进气和排气的组分进行测定，尤其是二氧化碳的信息 (13C标记二氧化碳分子量45，天然的二氧化碳分子量为44)，能够进行精确测量。5)GC-MS系统对标记实验过程中得到的菌体水解的氨基酸或胞内游离的氨基酸和部分有机酸进行测定，得到的标记丰度信息用于代谢流的计算。微型传感反应器通过数据采集系统来实现反应器各种参数(包括搅拌转速、流量、pH、溶氧、温度等)的监测，控制系统同时根据气体质谱仪得到的信息进行反应器的反馈控制，实现传感反应器与生产罐内菌体的代谢相似；然后在二者达到代谢相似的情况下， 快速取样通过气相-质谱仪进行菌体氨基酸标记状态的分析，从而了解生产罐内菌体的生理代谢状况。在一优选例中，该反应器容积为约80_120ml，装液体积35_50ml，溶氧通过搅拌和空气流量对溶氧进行调整；为了避免空气中的二氧化碳对发酵排气中标记二氧化碳的影响，进气用IM的NaOH预处理，pH通过流加10%的氨水进行自动调控；采用磁力搅拌驱动系统，最高转速1800rpm。跟踪生产过程控制系统本发明的微型全息式反应器系统还可用于跟踪生产过程并进行控制。本发明的跟踪生产过程控制系统除了包括上述的微型全息式反应器系统之外，还包括(i) 一用于发酵生产的生产反应器，其中所述生产反应器的容积没有特别限制，通常为50升以上(如50-10000升)；(ii)用于对生产反应器的排气的中二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪。本发明的一种传感反应器实验装置与标记流程实例如图2所示。传感反应器与大规模生产反应器以随动方式相连。当对某一发酵阶段过程代谢进行标记实验考察时，将生产反应器中培养液无菌导入传感反应器中，通过过程参数及排气测定分析系统来快速调整微传感反应器参数，使得与生产反应器有一致的运行状态。例如，并且在发酵培养过程中，对所述生产反应器和微型反应器的排气组分的分别进行测定，并对所述微型反应器实施反馈控制，从而使微型反应器的排气组分的构成与生产反应器的排气组分的构成尽可能一致(相同或相似)。通常，所述的反馈控制通过以下方式进行通过微型质量流量计和磁力搅拌器，根据发酵体系对供氧的需求而自动调节进气流量和搅拌转速；和/或，所述装置根据补料速率的设定和称量所述微型反应器重量的电子称的读数，自动调节蠕动泵的转速，从而控制补料与否以及补料速度。在本发明中，因为微型反应器和生产反应器中微生物的代谢通量基本一致，因此仅需在微型反应器中加入少量(通常仅或更少量)同位素标记的底物，并连续快速取样处理测定胞内游离氨基酸或有机酸的标记信息，从而测定和获得该状态下的微型反应器和生产反应器的代谢通量分布信息。因此，本发明方法可以大幅度降低同位素标记的代谢通量分析的成本。排气检测在标记实验中，排气中二氧化碳的标记信息在代谢流计算中也有很大的作用，代谢途径通量的变化使得消耗特定标记底物生成的标记二氧化碳的比例有所不同，而且对于大多数批次培养过程来说，即使菌体的蛋白氨基酸没有变化，胞内的游离氨基酸的替换也很小，但只要有标记底物的消耗，就会有二氧化碳的生成，因此可以通过二氧化碳的丰度信息来对代谢途径通量进行计算，可以进行快速检测。在本发明的一个优选例中，使用在"C标记的二种或两种以上碳源(例如"C标记标志的不同化合物(如果糖和葡萄糖)，或1V标记位置不同的同种碳源(例如葡萄糖))， 进行微生物发酵培养；并且对微型反应器的发酵体系的排气中的分子量为45的"C标记二氧化碳和分子量为44的非标记的二氧化碳组分进行在线测定，从而根据测量值计算代谢通量。本发明的主要优点在于(a)该微型反应器系统可以能够跟踪和模拟微生物发酵生产过程大型反应器中的微生物代谢状态，为生产过程的缩小和放大研究提供了技术平台。(b)微型反应器的体积小，因此在利用同位素标记底物研究微生物的代谢途径通量变化过程中，能大幅度降低标记底物的消耗量，降低成本。(c)比传统的代谢通量方法相比能够更详细的描述生物体的代谢状态。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。材料与方法生物系统和培养条件菌种脱氮假单胞杆菌O^seudomonas denitrificans)购自华荣制药有限公司。菌悬液制备用无菌水洗涤培养好的斜面，制成菌浓为IO8个细胞每毫升的菌悬液。母瓶种子培养将制好的菌悬液接种2ml到母瓶培养基中，装量100ml/500ml， 32 °C,转速260rpm,培养20-22小时。50L发酵罐培养将培养好后镜检无菌的母瓶种子液1250ml，火焰保护接种到装有25培养基的发酵罐中，培养条件为二级搅拌浆，320C，通气量20L/min。复合培养基(g/L)蔗糖80，玉米浆 45，甜菜碱 14，(NH4)2SO4I, KH2PO4O. 75， CoCL · 6H20 0. 075，MgO 0. 5，DMBI 0. 05，ZnSO4 · 7H20 0. 08，CaCO3 1，pH7. 2-7. 4。合成培养基(g/L)葡萄糖30，(NH4)2HPO4 10,KCl 0. 2,MgSO4 ·7Η20 1. 4，(NH4)2SO4 5，5，6-二甲基苯并咪唑 0. 0065，混合溶液(TES) 100ml, pH7. 2-7. 4. TES (g/1) =MnSO4 ‘ H2O 0. 2，ZnSO4 · 7H20 0. 2，CoCl2 · 6H20 0. 025，FeSO4 · 7H20 0. 03，Na2MO4 0. 02.发酵过程中根据菌体生长情况开始连续补加葡萄糖和甜菜碱料液培养基，补料培养基1 (g/L)葡萄糖 300，DMBI 0. 15，CoCL · 6H20 0. 15补料培养基1 (g/L)甜菜碱 30，DMBI 0. 4，CoCL · 6H20 0. 3测定方法菌体量测定将菌液稀释后于波长700nm处测定吸光值，以去离子水为对照。菌体光密度值 (OD700) = OD读数X稀释倍数，细胞干重(DCW)与菌体光密度之间有很好的线性关系，DCW =OD700 XO. 78，菌体干重根据测得的光密度值进行计算。葡萄糖测定采用常规的“改良的DNS法”进行测定。氨基酸测定样品用邻苯二甲醛衍生后用HPLC(AglientllOO)测定，色谱柱型号EclipseAAA 柱。有机酸测定AgilentllOO 色谱系统，色谱柱，AquaS印.公司 C8 (4. 6mmX 25cm，5 μ m)。维生素B12含量的测定取IOml发酵液，加入8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸各2. 5ml，摇勻，于95_100°C水浴30min ；水浴后冷却至室温，加去离子水定容至50ml，过滤；用AgilentllOO色谱系统进行检测，色谱柱为Beckman G.6mmX 250mm，5 μ m)；检测波长为361nm ；进样量20 μ 1 ；流速为 1. Oml/min。GC-MS分析标记氨基酸样品收集取菌体培养液Iml于EP管中，12000rpm低温冷冻离心5min，收集菌体， 用双蒸水洗涤后，加6M HCl中，95°C，酸水解Mh。将水解液用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤后用气流干燥，得到的菌体蛋白水解氨基酸样品放入真空干燥箱50°C干燥过夜，保证氨基酸样品的绝对干燥。样品衍生因为氨基酸气化点较高，大部分不能直接进行GC-MS测定，需用硅烷化试剂衍生后测定。将绝对无水的氨基酸固体用300 μ 1的吡啶(色谱纯)溶解，再加100 μ 1 衍生剂N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(MBDSTFA)，用震荡器震荡IOmin混勻后于60°C，30min进行衍生，过滤后用GC-MS分析。GC-MS条件GC分离条件HP5MX柱，起始柱温100°C，保持:3min，再以10°C /min升至220°C，后以10°C /min升至280°C，保持5min ；进样口温度280°C ；载气为高纯氦气，恒流， 载气流速1. OmL/min，分流比1 10。MS条件EI电离方式，接口温度，离子源温度200 ；全扫描模式，扫描质量范围100-600。实施例1生产罐、微型反应器装置和摇瓶的对比分析本实施例采用50升发酵反应器作为生产罐，采用图1所示的微型反应器装置作为传感反应器。1宏观代谢参数的一致性分析为了考察该微型反应系统的可行性，本发明人进行了生产罐和传感反应器的发酵性能考察；在50升发酵反应器中用复合培养基进行维生素B12的发酵试验，当发酵过程进行到一定阶段时，从50升发酵反应器中无菌取样分别分装到微型反应器中和摇瓶中，以排气中二氧化碳含量、OUR和CER为控制参数，通过调节小反应器的搅拌和通气条件，保证两个反应器中菌体生理状态的一致性。501反应器和微型反应器中的过程变化曲线如图3和图4所示。从两个反应器中菌体代谢的变化曲线中可以看出，微型传感反应器中菌体的呼吸生理代谢特性与生产条件下一致，以排气监测系统为指导，对传感反应器中的菌体生理特征变化进行调整，能做到及时快速的响应，从而使得传感反应器能更好的代表生产条件下的代谢状态。2对发酵过程中代谢参数的考察为了更加深入地了解微型传感反应器的跟踪生产条件的可行性，对两个平行反应系统进行同时取样分析，测定其菌体生长情况，糖耗的变化和胞外氨基酸与有机酸的变化。结果见图5，从取样分析的结果可以看出，传感反应器和生产条件下的菌体生长和糖耗变化有非常高的相似性，相关度在98%以上，同时两个反应器系统中的胞外氨基酸和有机酸的浓度变化也非常一致。这种相似程度不仅表现在两个反应器中的物质浓度变化上，而且也表现在了物质的变化速率上，表1分析了两个培养过程25-30小时对应的葡萄糖的消耗速率，菌体的比生长速率和代谢物的生成和消耗速率，这些物质对单位菌体的变化速率非常接近，这些数据充分说明微型传感反应器中菌体的代谢特性与对应的生产条件下的代谢特性是一致的，该传感反应器系统能够跟踪生产罐进行实时跟踪代谢分析。表1两个不同反应器中跟踪培养25-30小时阶段的葡萄糖消耗速率，二氧化碳释放速率和有机酸及氨基酸的生成速率
变化速率(微型反应器)变化速率(50升反应器) _(XlO2)_(xlO2)_
生长速率μ(1/1ι)6.73 ±0.126.86±0.19葡萄糖(mmol/g/h)-8·92±0.27-9.01 ± 0.42CO2 (mmol/g/h)18.24 土 1.1719.76 ±0.99酮戊二酸 Oxoglutarate (mmol/g/h)0.093 土 0.0060.103 ±0.015乙酸 Acetate (mmol/g/h)0.269 ± 0.0220.257 ±0.031玻珀酸 Succinate (mmol/g/h)-0.0206 土 0.005-0.0156 ±0.007甘氨酸 Gly (mg/g/h)6.313 ±0.386.017 ±0.53丙氨酸 Ala (mg/g/h)0.789 ±0.0320.888 ±0.027天冬氨酸Asp (mg/g/h)1.381 ±0.0820.986 ±0.124赖氨酸 Lys (mg/g/h)0.996 ± 0.0720.976 ±0.031色氨酸 Try (mg/g/h)-9.765 土 0.97-9.568 ±0.83甲硫氨酸Met (mg/g/h)2.367 士 0.0922.072 ±0.107实施例2微型反应器在批次培养同位素标记实验中的应用为了更好的研究甜菜碱在菌体生长阶段的利用情况，利用标记的葡萄糖作为底物，在微型反应器中进行批次培养，根据排气中二氧化碳的标记丰度信息和菌体蛋白氨基酸的标记信息，详细分析甜菜碱的利用情况，验证微型反应系统的可行性。本实施例采用50升发酵反应器作为生产罐，采用图1所示的微型反应器装置作为传感反应器。1.标记底物和培养方法标记底物的选取选用全标记的葡萄糖(5g/l)和天然甜菜碱(3g/l)作为唯一的含碳物质。培养过程将培养在全标记葡萄糖合成培养基的种子，用无菌水洗下后，取0. 5ml 接种到微型反应器中，每次取样1. 5ml测定残糖，菌浓和菌体蛋白氨基酸的标记情况，排气系统实时采集。2.标记实验分析甜菜碱的利用情况过程中实时采集排气中二氧化碳的标记信息，并对发酵过程进行定时取样分析， 图6显示了发酵过程中的底物浓度，菌体生长和排气二氧化碳的信息。
在培养过程中，进气用质量流量计控制30ml/min，空气经IM的NaOH处理除去其中的CO2,以避免空气中的(X)2对氨基酸标记信息和排气(X)2标记丰度的干扰。从图6b可以看出，该系统中发酵过程的PH，溶氧，温度都能够很好地采集和控制，空气质量控制准确度较高，发酵过程中的氧摄取速率OUR和(X)2生成速率CER能得到准确测定；气体质谱仪能够对排气组分的标记情况进行精确测量。随着菌体生长进入指数增长阶段，糖耗速率迅速增加，甜菜碱的浓度也迅速降低； 培养25小时对发酵液组份测定没有发现有维生素^2和其合成前体物质5-氨基乙酰丙酸的积累。从排气中CO2的标记丰度信息可以看出，标记的(X)2占得比例在10小时左右达到最低，因为底物用的是全标记的葡萄糖，因此生成的CO2的标记丰度应该在98%以上，因此肯定有葡萄糖以外的碳源物质，即甜菜碱参与了(X)2的生成代谢。对培养过程中的菌体的蛋白氨基酸用GC-MS进行了测定，其测定结果见表2。表2发酵M小时菌体水解后蛋白氨基酸校正后的标记丰度信息
权利要求
1.一种用于同位素标记的代谢通量分析的微型反应器装置，其特征在于，所述的装置包括1)一用于微生物发酵的微型反应器，所述的微型反应器配有测定发酵体系的溶氧传感器、PH传感器和温度传感器；并且，所述的微型反应器配有进气管、排气管、补料管和取样管；并且，所述的微型反应器的容积为30-500ml ；2)一用于采集发酵参数的数据采集装置，所述的数据装置与所述的溶氧传感器、PH传感器和温度传感器相连；3)一用于调节供氧水平和补料的控制系统，所述的控制系统包括控制空气进气的微型质量流量计、控制搅拌的磁力搅拌器以及控制补料的蠕动泵；4)用于对微型反应器的排气的中分子量为45的1V标记二氧化碳和分子量为44的非标记的二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪；以及5)用于测定发酵体系中％标记的氨基酸的气相-质谱联用仪系统(GC-MS系统)，所述的GC-MS系统对发酵过程的取样样品进行(a)菌体水解的氨基酸和/或(b)胞内游离的氨基酸的测定，从而得到用于代谢通量分析的标记丰度数据。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的微型反应器的容积为50-250ml，更佳地，所述的微型反应器的容积为70-100ml。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括一生产反应器，其中所述生产反应器的容积为50升以上(如50-10000升)；以及用于对生产反应器的排气的中二氧化碳组分进行在线测定的排气气体质谱仪。
4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的温度电极兼作为挡板。
5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的数据采集装置将温度、溶氧和PH信号通过AD转换器(模拟-数字转换器)进行在线采集。
6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括用于去除进气中二氧化碳的进气预处理装置。
7.如权利要求1所述的微型反应器装置的用途，其特征在于，用于13C同位素标记的代谢通量测定。
8.一种13C同位素标记的代谢通量测定方法，其特征在于，包括步骤1)在权利要求1所述的微型反应器装置中的微型反应器中，在1V标记的碳源存在下， 进行微生物发酵培养；2)在发酵培养过程中，从微型反应器的发酵体系中取样，获得待分析的样品；3)通过权利要求1所述的微型反应器装置中的气相-质谱联用仪系统，对取样样品进行(a)菌体水解的氨基酸和/或(b)胞内游离的氨基酸的测定，得到用于代谢通量分析的标记丰度信息，从而获得代谢通量的测定结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在一生产反应器中，在无"C标记的碳源存在下，进行微生物发酵培养，其中，所述生产反应器的容积为50升以上(如50-10000升)；并且在发酵培养过程中，对所述生产反应器和微型反应器的排气组分的分别进行测定，并对所述微型反应器实施反馈控制，从而使微型反应器的排气组分的构成与生产反应器的排气组分的构成尽可能一致(相同或相似)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的反馈控制通过以下方式进行 通过微型质量流量计和磁力搅拌器，根据发酵体系对供氧的需求而自动调节进气流量和搅拌转速；和/或，所述装置根据补料速率的设定和称量所述微型反应器重量的电子称的读数，自动调节蠕动泵的转速，从而控制补料与否以及补料速度。
全文摘要
本发明涉及一种微型全息式生物传感反应器系统。更具体地，本发明提供了一种可用于代谢通量分析的微型全息式生物传感反应器系统及其应用。所述装置包括一用于微生物发酵的微型反应器；一用于采集发酵参数的数据采集装置；一用于调节供氧水平和补料的控制系统；用于在线测定的排气质谱仪；测定发酵体系中13C标记的氨基酸的气相-质谱联用仪系统。本发明的微型全息式生物传感反应器系统可以准确、及时、价廉地测定发酵过程中胞内的微生物代谢通量。
文档编号G01N30/02GK102250764SQ201010176549
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者储炬, 刘玉伟, 庄英萍, 张一鸣, 张嗣良, 王泽建, 陈丽, 黄明志 申请人:华东理工大学