专利名称：抗核周因子试剂盒及其制备和保存方法
技术领域：
本发明涉及一种类风湿关节炎早期诊断用试剂盒，特别是涉及一种抗核周因子检测试剂盒。本发明还涉及该试剂盒的制备方法和保存方法。
背景技术：
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的诊断，尤其是早期诊断是世界性的难题。目前国际常用的ACR 1987年RA分类诊断标准主要是依靠临床表现、X线改变和类风湿因子(RF)的检测进行综合判断，缺乏可靠的客观指标，往往是符合上述判断标准时，病人已经出现了骨质的破坏，使得早期病例难以诊断。RF是分类诊断标准内唯一的血清学指标，但RF可出现于许多结缔组织病及其它疾病中，如急性病毒感染和结核患者，甚至5％的正常人群中也可能出现，对于诊断RA的特异性很差。因此，国内外学者在探讨RA特异性诊断指标方面进行了大量研究工作，相断发现了一些对RA较为特异的自身抗体。
抗核周因子(antiperinuclear facror antibodies，APF)是最早发现的一个RA特异性自身抗体，自1964年Nienhuis首次发现APF以来，国内外研究证实APF不仅可以出现在RA疾病的早期阶段，甚至可以出现于RA临床症状发生以前若干年，对RA高度特异，因此具有早期诊断价值。
但是有关APF的检测一直未能广泛开展，且迟迟不能应用于临床，包括著名的德国欧盟医学诊断有限公司也没有APF检测的试剂盒。其原因主要是存在以下两个问题一、合适的抗原底物获取有一定困难。APF检测是以人颊粘膜细胞作为抗原底物，用间接免疫荧光法进行检测，不同提供者颊粘膜细胞的抗原性不同，不是每个人的颊粘膜细胞均适合做抗原底物，据国外文献报道，仅有10％的人可以提供合适的抗原。
二、抗原底物的保存困难，即APF的制片困难。APF检测的每次实验均需要重新制备抗原底物，首先刮取颊粘膜脱落细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，离心、弃上清液，置于倒置显微镜下计数，调整细胞数，滴至玻片制得抗原片后，才能进行间接免疫荧光检测，而制备抗原片的过程大约需要3～4小时。由于APF每次实验均要从制备抗原开始，过程复杂，检测周期长，难以避免检测批间差异，稳定性差，因此很难在临床上大规模应用。而且通常制备的APF抗原片是直接放置在-30℃保存，一般一个月后就不能再用于检测，其抗原片的保存也是一大难题。
Hoet.R.M.A.对抗核周因子抗原片的制备进行了研究(Annals of theRheumatic Diseases，1991.50.611～618)，他发现，如果使用0.5％Triton-X100的PBS缓冲液漂洗人颊粘膜细胞后，制得的APF抗原片检测敏感性显著提高，至少70％正常健康人的颊粘膜细胞可以作为核周因子抗原的提供者，而且制备的抗原片可以在-70℃保存二周。
但是，Hoet的研究结果仅将颊粘膜细胞提供者的比例提高到70％，仍然没有完全解决抗原底物的获取问题，而且由于制备的抗原片保存时间过短，不能规模化批量制备APF检测试剂盒，也没有解决临床大规模应用的问题。

发明内容
本发明的目的是提供一种可供临床应用的抗核周因子试剂盒。
提供该试剂盒的制备方法，是本发明的另一发明目的。
本发明的目的还在于提供该试剂盒的保存方法。
本发明的试剂盒是将人颊粘膜细胞用磷酸盐缓冲液漂洗离心后，再用含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液静置10～15分钟后离心，用磷酸盐缓冲液漂洗离心后，置于试剂盒中，干燥密封后得到。
其具体的制备方法是a、清洁口腔，用海绵涂抹两侧颊粘膜；b、将海绵置于10mL磷酸盐缓冲液中，挤压海绵，使颊粘膜细胞溶入缓冲液中；c、以800g/min离心3分钟，弃去上清液；d、沉淀细胞中加入10mL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，静置10～15分钟，以800g/min离心3分钟，弃去上清液；e、沉淀细胞用10mL磷酸盐缓冲液洗涤，并以800g/min离心3分钟，弃去上清液；
f、沉淀细胞置于倒置显微镜下计数，调整细胞数为1000个/10μL，在试剂盒上每孔加入15μL，干燥并密封试剂盒。
其中，使用的磷酸盐缓冲液是pH＝7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。制备出的试剂盒干燥后放入铝箔袋中密封，置于-70℃保存。
试剂盒产品的临床使用方法为将待测血清用PBS液以1∶10的比例稀释，试剂盒放置到室温，打开包装，每孔中加入25μL稀释好的血清，于室温下孵育90分钟，之后用PBS液洗涤三次，每次洗涤5分钟。
再在每孔中滴加15μL以1∶40稀释的羊抗人IgG荧光二抗，置温盒中室温孵育45分钟，再用PBS液洗涤三次，每次5分钟。
以缓冲甘油(50％甘油、50％PBS，含0.5μg/mLEB)封片，立即在荧光显微镜下观察结果。
检测的判定标准为全片出现2个以上APF典型核周均质圆形荧光颗粒时，判定为阳性；全片仅见1个APF典型荧光颗粒时，判定为可疑，进行重复检测。
Hoet首先采用了Triton-X100处理人颊粘膜细胞，使得处理后细胞的APF检测敏感性显著提高，由原来报道的10％左右提高到了70％(未给出数据)，从而使绝大多数人群都可以作为颊粘膜细胞抗原底物的提供者。但是，Hoet的方法虽然扩大了抗原底物提供者人群的范围，仍然还需要通过试验来筛选合适的颊粘膜细胞作为抗原底物，没有完全解决抗原底物获取困难的问题。
Triton-X100是一种表面活性剂，对于细胞膜能起到打孔效应，当它作用于细胞时，能与细胞膜充分作用，增加细胞膜对抗体的通透性，有利于抗体进入细胞膜与抗原结合；同时，Triton-X100还具有清洗作用，可以除掉杂质，使背景更清楚，抗原片的质量更高，从而增加阳性检出率。本发明对Hoet的方法进行了改进，将Triton-X100的作用时间从漂洗一次改变为静置10～15分钟，以增加Triton-X100与细胞膜之间的作用，通过上述改进，进一步提高了APF检测的敏感性，取得了意想不到的效果。
随机选取10例正常健康人(其中4例女性)的颊粘膜细胞作为抗原底物进行APF检测，结果显示全部为阳性，敏感性达到了100％，只是其中女性颊粘膜细胞偏小，相应的核周荧光颗粒也偏小，不利于结果的判断。上述试验结果表明了任何正常健康的人群都可以提供合适的颊粘膜细胞作为抗原底物，从而彻底解决了寻找抗原提供者，获取抗原底物的问题。
由于先前制备的抗原片不能长期保存，因此每次进行APF检测时必须从制备抗原片开始，不仅过程复杂、检测周期长，也难以避免批间差异，使得APF检测一直不能应用于临床常规检测中。本发明将制备得到的抗原片干燥后密封，于-70℃保存，可以防止潮解，抗原底物脱落及蛋白变性，有利于APF抗原长期保存的稳定性，解决了抗原底物保存的难题，制备出了可供临床应用的试剂盒，利用该试剂盒可直接进行间接免疫荧光检测，2～3小时即可得出结论，使大规模开展常规检测成为了可能。
将制备的试剂盒密封后，置于-70℃保存，分别在3个月，6个月、11个月时，用相同的血清与新鲜抗原和保存试剂盒进行检测对比。共检测了20例标本，其中采用新鲜抗原检测的14例阳性中，保存11个月后的试剂盒检测有13例呈阳例，仅有1例为阴性，其它6例新鲜抗原与试剂盒检测结果皆为阴性，两组对照结果无差异(P＝1)，显示检测结果阳性与阴性都有很高的符合率，说明试剂盒经干燥密封，-70℃保存后，至少11个月仍可使用，从而彻底解决了抗原底物的保存问题。
由于本发明解决了APF抗原底物的提供和保存两大难题，使得批量生产APF试剂盒成为了可能，不需要再从头制备APF抗原片进行实验室检测，用制备的试剂盒可以直接开始间接免疫荧光检测，2～3小时即可出结果，为大规模临床应用提供了可能。
具体实施例方式
选择正常健康人，清洁口腔后，用海绵涂抹两侧颊粘膜，收集颊粘膜细胞。将海绵置于10mL pH＝7.4的0.01mol/L PBS液中，反复挤压海绵，使颊粘膜细胞脱落，溶入PBS液中，先于800g/min离心3分钟，使细胞沉淀，并弃去上清液，再将收集的细胞中加入10mL含0.5％Triton-X100的PBS液，静置10～15分钟，以800g/min离心3分钟，弃去上清液，最后用PBS液洗涤，并以800g/min离心3分钟，弃去上清液。
制备好的细胞于倒置显微镜下计数，并调整细胞数为1000个/10μL，于试剂盒中每孔加入15μL，之后风干，放入铝箔袋中，加干燥剂密封包装，于-70℃保存备用。
权利要求
1.抗核周因子试剂盒，其特征是由下述方法制备得到将人颊粘膜细胞用磷酸盐缓冲液漂洗离心后，再用含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液静置10～15分钟后离心，用磷酸盐缓冲液漂洗离心后，置于试剂盒中，干燥密封。
2.权利要求1所述抗核周因子试剂盒的制备方法，其特征是包括以下步骤a、清洁口腔，用海绵涂抹两侧颊粘膜；b、将海绵置于10mL磷酸盐缓冲液中，挤压海绵，使颊粘膜细胞溶入磷酸盐缓冲液中；c、以800g/min离心3分钟，弃去上清液；d、沉淀细胞中加入10mL含0.5％Triton-X100的磷酸盐缓冲液，静置10～15分钟，以800g/min离心3分钟，弃去上清液；e、沉淀细胞用10mL磷酸盐缓冲液洗涤，并以800g/min离心3分钟，弃去上清液；f、沉淀细胞置于倒置显微镜下计数，调整细胞数为1000个/10μL，在试剂盒上每孔加入15μL，干燥并密封试剂盒。
3.根据权利要求2所述抗核周因子试剂盒的制备方法，其特征是所述的磷酸盐缓冲液是pH＝7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。
4.权利要求1所述抗核周因子试剂盒的保存方法，其特征是将试剂盒干燥后密封，置于-70℃保存。
全文摘要
抗核周因子试剂盒，是将人颊粘膜细胞用PBS液漂洗离心后，用含0.5％Triton－X100的PBS液静置10～15分钟，再用PBS液漂洗离心，置于试剂盒中，干燥密封制得，并于－70℃保存。本发明的APF试剂盒解决了抗原底物获取和保存的两大难题，可以使用任何健康人群的颊粘膜细胞作为抗原底物，并可在－70℃至少保存11个月，从而成功制备出了可应用于临床的APF检测试剂盒。
文档编号G01N33/53GK1484030SQ0313893
公开日2004年3月24日 申请日期2003年7月29日 优先权日2003年7月29日
发明者李小峰, 李鸿斌, 王彩虹, 罗静, 张乃峥, 唐福林, 赵春阳, 王建民 申请人:李小峰