专利名称：用于样品瞬逝照明的装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种用于样品瞬逝照明的装置和方法。
背景技术：
在样品的瞬逝照明中，如此提供照明样品的光线束以使得在样品的边界面发生 全反射。因此样品中形成了持续存在的瞬逝波，其强度随相对边界面的距离按指数减 弱。强度下降到Ι/e的距离可以定义为描述瞬逝波穿透深度的距离。典型值位于100 至200nm的范围内。瞬逝辐射例如用于在样品中激发荧光。然后能够借助显微镜探测所激发的荧光 辐射。几种具有不同波长的荧光越来越多地被激发。这在相同的条件下应该明显发 生至最可能的程度，以使得单个荧光图像依然有意义并且能够定量地相互结合或相互比 较。在穿透深度依赖于波长和入射角这方面存在难题。在相同入射角时，穿透深度对于 不同波长是大小不同的。

发明内容
在此基础上，本发明的目的是提供一种用于样品瞬逝照明的装置，其中穿透深 度与波长相关的差异被减小。而且，将提供用于样品瞬逝照明的特定方法。该目的通过一种用于样品瞬逝照明的装置而实现，所述装置包括照明光学器 件，其设有校正光学器件和设置于所述校正光学器件下游的物镜，并且用所提供的包含 至少两种不同波长光辐射的光线束瞬逝照明样品，校正光学器件具有横向色差，其在照 明期间导致光辐射根据波长在不同高度穿过物镜光瞳，并且对其以如此方式选择，即减 小在瞬逝照明期间辐射进入样品的穿透深度与波长相关的差异。因此，根据本发明的装置可用于同时以具有至少两种不同波长的光辐射或以具 有两种不同波长的光锥照明样品，其在例如荧光检验的情况下具有优势。穿透深度的差 异能够显著减小，由其例如可以评估来源于同时或顺序完成的频率激发的多光谱图像。因而瞬逝照明中的光谱穿透深度与依据本发明的装置相统一。所以具有不再需 要提供仪器中用于校准光谱穿透深度的调整选项的优势。在依照本发明的装置中有利地利用了物镜光瞳的高度影响照明角度并因此影响 瞬逝照明中的穿透深度。依照本发明通过有意的校正光学器件的倍率色差对其如此进行 利用，即物镜光瞳中存在需要的依赖于波长的高度，从而在瞬逝照明期间获得相同的穿 透深度。由于依照本发明的装置，可以用高得多的频率在例如其中不同荧光团或染料以 不同波长被同时或顺序激发的实验情况下进行测量或检验，因为再也不需要像以前所必 需的那样为了达到相同的穿透深度或相同的激发量而在两个检测(或瞬像(snapshot))之间移动机械元件了。校正光学器件可包括衍射和/或折射元件。尤其，其可以是倾斜放置的平板、 楔形物、棱镜、衍射元件和/或可以倾斜放置的透镜，以及这些元件的任意组合。由校 正光学器件引起的横向色差也可以通过考虑物镜的放大倍率而特别地选择。如果物镜在 照明中具有色差，这可以在选择校正光学器件的横向色差或倍率色差时考虑。校正光学器件可以具有与物镜光瞳共轭的平面，所提供的光线束穿过所述平面。尤其是，所提供的光线束平行于校正光学器件的光轴穿过共轭平面。在这种情况下 校正光学器件的设置容易实现。另外，光线束能够以离轴方式与物镜光瞳中的主光线所需传播路径相对应地以 一定距离并在一定角度下穿过该平面。例如在光纤内不同波长的光可以提供在该平面 中，依照本发明其光线以限定的横向色差在物镜光瞳中成像，由此能够以有目的的方式 减小穿透深度的光谱差。尤其，根据本发明的用于样品瞬逝照明的装置可包括馈送单元，其以离轴方式 和/或采用光线束不平行于校正光学器件的光轴延伸的方式来馈送校正光学器件的光线 束。馈送单元可包括光纤，设置其光纤端面以实现所期望的光线束馈送。可以理解馈送 单元也能够包括其它光学元件，诸如分束器、透镜、光栅等。在所提供的光线束中，包括具有不同波长尤其是彼此同轴的光锥(ray pencil)。 这简化了校正光学器件的配置。根据本发明的用于样品瞬逝照明的装置还可以包括驱动元件，其例如可以作为 馈送单元的一部分，并且用它可以设定光线束的位置和/或角度，光线束在该位置中或 该角度下穿过共轭平面。尤其，光线束到校正光学器件光轴的距离可以改变。因此有可 能同时改变对于所有波长的穿透深度。也可以这样设置驱动元件，以使得在物镜光瞳中所有依赖于波长的高度可因此 同时改变。优选地，以这样的方式实行改变，即穿透深度以不依赖于波长的方式变化。 在借助驱动元件改变穿透深度的情况下，光谱穿透深度可发生微小的依赖于波长的变 化。与非校正情形相比，仍存在的差异降低了至少一个量级。当所提供的光线束包括两个或更多个具有不同波长的光锥时，穿透深度与波长 相关的差异能够最小化。特别是有可能对于两种、三种或更多波长的穿透深度是相同 的。与穿透深度没有进行任何校正的情形相比，显著的减小在波长介于中间的情形下是 可能的。与非校正的情形相比，仍存在的差异能够降低一个或几个量级。在多于两种或三种不同波长的情况下，校正光学器件可以设置成例如这样的方 式以使得对于所有的波长光谱差异被最小化。例如对于任何波长来讲可以要求光谱差异 不超过预定的限值。任何其它类型的最小化也是可能的。光辐射或光学光锥在这里将特别理解为根据光学定律而表现的电磁辐射。尤其 是，其涉及来自可见波长范围的辐射。来自红外范围或紫外范围的辐射也是可能的。根据本发明的用于样品瞬逝照明的装置可以是显微镜组件。在这种情形下，可 以用这样的方式设置能够瞬逝照明样品的显微镜，即使得辐射在样品中的穿透深度与波 长相关的差异减小。在这种情形下，校正光学器件可以利用显微镜照明光学器件的一部分。校正光学器件可以包括设置于物镜下游的入射垂直照明的一部分。在这种情形下，校正光学器 件包括例如校正组件，其可被加到显微镜上并与照明光学器件的该部分一起实现依照本 发明的校正光学器件。在这种情形下，校正光学器件优选地以这样的方式设置，即与所 使用的照明光学器件的该部分一起实现所期望的校正光学器件的横向色差。当使用这种显 微镜探测荧光辐射时，它也经常称作TIRF(=全内反射荧光)显微 镜。在TIRF显微镜中，大幅地减小从落射荧光(epi-fluorescence)获知的背景荧光并且 成像对比度大幅地提高。结果是很高的ζ轴向分辨率(z-resolution)。瞬逝场的典型厚度 为 100 至 200nm。依据本发明的装置容许在TIRF显微镜和用几种不同波长的处理中优化激发光谱 量，以通过利用这几种波长而获得更明亮和更好的TIRF彩色图像。由于成像原理，根据本发明的装置的这种照明方法尤其适合于检测在细胞膜环 境下的动态过程以及检测无细胞的系统中分子与分子的相互作用。另外，电生理学和药 理学实验的结合(样品操作)也将起到主要作用，因为TIRF显微镜能够在先前只有间接 测量可行的地方提供图像。根据本发明的用于样品瞬逝照明的装置还可以包括产生光线束的源。辐射特别 可涉及激光辐射。根据本发明的用于样品瞬逝照明的装置和具有这种装置的显微镜可包括本领域 普通技术人员已知的控制装置。尤其显微镜可采取惯用方式设置。由用于样品瞬逝照明的方法进一步实现本发明目的，其包括光线束，所述光线 束包含具有至少两种不同波长的光辐射，经校正光学器件和设置于校正光学器件下游的 物镜将光线束引导至样品，使得样品被瞬逝照明，所述校正光学器件具有横向色差，其 在照明期间导致光辐射依照波长在不同高度穿过物镜光瞳，并且以如此方式对其选择， 即减小在瞬逝照明期间辐射在样品中的穿透深度与波长相关的差异。依据本发明的方法容许同时以不同波长瞬逝照明样品并确保穿透深度只稍有差 异。特别是，穿透深度可以相同。以这一方法可在突出方式中实现具有不同波长的相同照明条件。校正光学器件可设有至少一个折射和/或至少一个衍射元件。尤其，校正光学器件可包括与物镜光瞳共轭的平面，所提供的光线束穿过所述 平面。优选地，对于不同波长光线束作为同轴线束穿过共轭平面。在该方法中，优选以具有不同波长的光辐射同时照明样品。该方法可用于以离轴方式和/或不平行于校正光学器件的光轴延伸的方式对校 正光学器件提供光线束。因而能够以有目的的方式利用校正光学器件的横向色差，使得 不同波长在所期望的不同高度穿过物镜光瞳。依照本发明的照明方法可用于显微镜检测中。因此提供了特定的显微镜使用方 法，例如TIRF显微镜使用方法。显微镜使用方法可采用本领域技术人员已知的方式进一 步开发。要理解以上所提到和下面仍要解释的特征不仅能用于所阐明的组合中，而且也 用于不脱离本发明范围的其它组合或单独地使用。


参照所附的同样公开了有关本发明的特征的附图，本发明将在下文得到更为详细的解释，其中图1示出了依照本发明用于样品瞬逝照明的装置的一个实施例的示意图；图2示出了图1的带有样品11的物镜4的放大图；图3示出了依照本发明用于样品瞬逝照明的装置的另一个实施例；图4示出了图1-3的实施例中现有穿透深度的解释的示意图；图5示出了依照本发明使用衍射光学器件的样品瞬逝照明装置的另一个实施 例；以及图6示出了依照本发明使用以衍射方式作用的光栅的样品瞬逝照明装置的另一 个实施例。
具体实施例方式在图1和2所示的实施例中，依照本发明的样品瞬逝照明装置集成于显微镜2 中，并且包括校正光学器件3和置于校正光学器件3下游的物镜4。校正光学器件3包括带有三个透镜Li、L2和L3的校正单元5，下游的偏转棱镜 6，带有两个透镜L4和L5的入射光光学器件7和反射镜8。入射光光学器件7可以是显微镜2的常规入射垂直照明部件。出于简化图解的 原因，这里未表示入射垂直照明的更多元件。如果移除棱镜6，用于入射垂直照明的光将 从箭头Pl所示的方向遇到入射光光学器件7，然后经反射镜8被馈送到显微镜光束路径 中。反射镜8可设置为部分透明的反射镜和/或二向色反射镜(取决于应用)。显微镜2还可以包括管状光学器件9和图像传感器10。在依照图1和2的实施例中，以波长450nm和575nm的辐射15进行的样品11 的瞬逝照明采取这样的方式，即穿透深度与两波长无关，在每一情形下均为93nm。所提 供的光线束15在图1中由箭头表示。箭头的尖端位于平面16上并可以是例如辐射15出 射的光纤端面。在这种情形下，采用平面16是物镜4的出射光瞳14的共轭平面的方式设置校正 光学器件3，出射光瞳14的位置如图1中箭头14所表示。另外，校正光学器件3包括横 向色差，配置横向色差，使得以该方式补偿了两种波长450nm和575nm在待检测样品11 的瞬逝照明中穿透深度d(图2)依赖于波长的差。对于两种波长450nm和575nm，为了获得相同的93nm的预定穿透深度d，设置 校正光学器件3的校正单元5，使其具有强的横向色差。采用这样的方式选择横向色差， 即具有波长450nm的光辐射或者光学光锥Sl在探测侧比具有波长575nm的光辐射S2以 更低的高度hi (距光轴OA的距离)穿过物镜4的光瞳14，如图2中示意性地表示。通 过校正单元5预设不同的高度hi、h2(距光轴OA的距离)，使得作为因而辐射Si、S2 在样品11上产生不同入射角的结果，对于两种波长每个穿透深度d都是93nm。校正单元5的设置取决于高度h，其可以基于所期望的穿透深度d进行如下计 算穿透深度d可以根据下面的公式1表示
权利要求
1.一种用于样品瞬逝照明的装置，包括照明光学器件，其设有校正光学器件(3)和位 于所述校正光学器件(3)下游的物镜(4)，以用所提供的包含具有至少两种不同波长的光 辐射(Si、S2)的光线束(15)瞬逝照明所述样品，所述校正光学器件(3)具有横向色差， 其在照明期间导致所述光辐射(Si、S2)根据所述波长在不同高度穿过所述物镜(4)的光 瞳(14)，并且以如此方式对其选择，即减小在瞬逝照明期间辐射进入所述样品(11)的穿 透深度与波长相关的差异。
2.按照权利要求1所述的装置，其中，所述校正光学器件(3)包含至少一个折射元件 (Li、L2、L3)。
3.按照权利要求1或2所述的装置，其中，所述校正光学器件(3)包含至少一个倾斜 放置的平板(17)和/或倾斜放置的透镜。
4.按照上述权利要求中的一项所述的装置，其中，所述校正光学器件(3)包括与所述 物镜光瞳(14)共轭的平面(16)，所提供的光线束(15)穿过所述平面。
5.按照上述权利要求中的一项所述的装置，包括馈送单元，其将所述光线束(15)以 离轴方式馈送至所述校正光学器件(3)。
6.按照权利要求5所述的装置，其中，所述馈送单元以如此方式馈送所述校正光学器 件(3)的光线束(15)，以使其不平行于所述校正光学器件(3)的光轴而延伸。
7.一种用于样品瞬逝照明的方法，包括含有至少两种不同波长的光辐射的光线束， 所述光线束经校正光学器件和设置于所述校正光学器件下游的物镜引导至样品，以使得 样品被瞬逝照明，所述校正光学器件具有横向色差，其在照明期间导致光辐射根据所述波长在不同高 度穿过所述物镜的光瞳，并且以如此方式对其选择，即减小在瞬逝照明期间辐射进入所 述样品的穿透深度与波长相关的差异。
8.按照权利要求7所述的方法，其中，所述校正光学器件设有至少一个折射元件。
9.按照权利要求7或8所述的方法，其中，所述校正光学器件设有至少一个倾斜放置 的平板和/或倾斜放置的透镜。
10.按照权利要求7-9中的一项所述的方法，其中，所述校正光学器件具有与物镜光 瞳共轭的平面，所提供的光线束穿过所述平面。
11.按照权利要求10所述的方法，其中，所述光线束包括光辐射，以使其作为同轴光 线束穿过共轭平面。
12.按照权利要求7-11中的一项所述的方法，其中，用具有所述至少两种波长的光辐 射同时照明所述样品。
13.按照权利要求7-12中的一项所述的方法，其中，所述光线束以离轴方式馈送至所 述校正光学器件。
14.按照权利要求7-13中的一项所述的方法，其中，所述光线束以如此方式馈送至所 述校正光学器件，以使其不平行于所述校正光学器件的光轴而延伸。
15.按照权利要求1所述的装置，其中，所述校正光学器件(3)包括至少一个衍射元 件(20、 25)。
16.按照权利要求7所述的方法，其中，所述校正光学器件设有至少一个衍射元件 (20、25)。
全文摘要
本发明涉及一种样品瞬逝照明的装置，所述装置包括设有光学校正元件(3)和位于所述光学校正元件下游的物镜(4)的光学照明元件，从而用所提供的包含具有至少两种不同波长的光辐射的光束瞬逝地照明样品。校正光学元件(3)具有横向色差，其在照明期间导致光辐射根据波长在不同高度穿透物镜(4)的光瞳(14)，并且对其选择，使得在瞬逝照明期间辐射进入样品的穿透深度的波长相关差减小。
文档编号G01N21/64GK102016551SQ200980115071
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年5月7日
发明者布鲁尼·维纳斯, 曼弗雷德·马萨 申请人:卡尔·蔡司显微成像有限公司