同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，步骤如下：将溶菌酶报告探针和γ-干扰素报告探针分别在含有TCEP的溶液中静置，以打开二硫键并分别与溶菌酶适体和γ-干扰素适体形成双链结构；对金电极进行预处理，将处理好的金电极浸在预处理后的溶菌酶报告探针-适体双链和γ-干扰素报告探针-适体双链的混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；然后将电极浸在含有MCH的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；将上述步骤处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到电化学传感器。该电化学传感器可用于两种急性白血病标志物溶菌酶和γ-干扰素的同时检测。
【专利说明】同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用，属于临床分析及生物电化学传感【技术领域】。
【背景技术】
[0002]在当今社会中，癌症是严重威胁人类身体健康的疾病之一。癌症患者的死亡率很高的最主要的原因是，不能进行早期诊断，如果能早期诊断及时治疗，1/3的癌症可以治愈。而血清肿瘤标志物的测定对癌症的早期诊断起着重要的作用。因此，建立准确、快速检测血清中肿瘤标志物的分析方法及相应的设备引起了人们的高度重视。
[0003]急性白血病是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤，对儿童身体健康的危害极大，其早期诊断对有效治疗具有十分重要的意义。传统诊断方法多依靠肿瘤组织或细胞形态上的变化来进行的，但判断难度大、准确率低，而且一旦在组织及细胞形态上确定癌症发生，往往已进入中晚期，难以进行有效治疗。由于癌细胞变化的过程主要是由复杂的分子水平的变化所诱导的，因此研究分子水平上的差异，对此水平的标志性物质进行灵敏及特异性识别和检测，有望实现癌症的高效早期诊断。

【发明内容】

[0004]本发明的目 的在于提供一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用。
[0005]本发明所采用的技术解决方案是:
[0006]一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)将溶菌酶报告探针和Y -干扰素报告探针分别在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中静置，以打开二硫键；再向溶液中添加溶菌酶适体和Y-干扰素适体，溶菌酶报告探针和溶菌酶适体形成溶菌酶报告探针-适体双链结构，Y-干扰素报告探针和Y-干扰素适体形成Y-干扰素报告探针-适体双链结构；
[0008](2)对金电极进行预处理，将处理好的金电极浸在经过步骤(1)预处理后的溶菌酶报告探针-适体双链和Y -干扰素报告探针-适体双链混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；
[0009](3)将步骤⑵处理后的电极浸在含有6-巯基-1-己醇的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗；
[0010](4)将步骤(3)处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可同时检测两种急性白血病标志物的电化学传感器。
[0011]优选的，步骤⑴中:所述溶菌酶报告探针为5’ -巯基-06-6了6046460^46了4八(:1'(^604(:-亚甲基蓝-3’，所述溶菌酶适体为5’-41^ AGG GCT AMGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干扰素报告探针为 5’-巯基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂铁-3’，所述 Y -干扰素适体为 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
[0012]优选的，步骤(I)中:所述溶液中溶菌酶报告探针-适体双链的浓度为I μ mol/L，Y -干扰素报告探针-适体双链的浓度为I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，还含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值为 7.4。
[0013]优选的，步骤(I)中:所述静置过程在室温下进行，静置时间为2小时。
[0014]优选的，步骤(2)中所述金电极的预处理过程如下:金电极用0.3μπι的Al2O3粉打磨成镜面，二次蒸馏水清洗后，相继在二次蒸馏水和乙醇溶液中超声50s ;将清洗干净的金电极在0.5mol/L的硫酸溶液中循环伏安扫描至稳定,扫描电压为0.2?1.65V,扫描速度为
0.lV/s，然后用二次蒸馏水冲洗干净，室温晾干。
[0015]优选的，步骤(3)中:所述溶液中MCH的浓度为2mmol/L，溶液中还含有20mmol/LTris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值为 7.4。
[0016]优选的，步骤(2)与步骤(3)中:所述清洗液为浓度lOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，溶液PH值为7.4。
[0017]上述制备的电化学传感器用于两种急性白血病标志物溶菌酶和Y-干扰素的同时检测。
[0018]上述检测方法具体包括以下步骤:
[0019](I)溶菌酶和Y-干扰素检测溶液的制备:溶菌酶和Y-干扰素在溶液中配制成浓度分别为0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L，储存在4°C下备用；所述溶液中包含有 20mmol/LTris-HCl、140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值为7.4；
[0020](2)将所制备的传感器工作电极浸泡在50 μ L步骤⑴配制的溶菌酶和Y -干扰素检测溶液中，37°C下静置lh，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗，得到组装的工作电极；
[0021](3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入 40 ?60 μ L 的溶液，溶液中含有 20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2以及20mmol/L KC1，溶液pH值为7.4，然后用差分脉冲伏安法检测组装的工作电极的电流响应，根据所得电流响应与两种急性白血病标志物的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
[0022](4)将待测样品溶液代替两种标志物的标准溶液，按照所述两种急性白血病标志物的工作曲线的绘制方法进项检测。
[0023]优选的，步骤⑵中，所述清洗液为浓度lOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，溶液pH为 7.4。
[0024]本发明的工作原理及有益效果如下:
[0025]在患病初期，溶菌酶、Y干扰素等与急性白血病相关的标志物会发生变化，对它们的同时检测可辅助进行早期诊断及分型，对急性白血病的早期诊断具有非常大的意义。本发明基于核酸适体识别技术，建立电化学生物传感器实现溶菌酶(其浓度有助于区分急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病等亚型)和Y干扰素(其浓度可反映急性白血病患者的细胞免疫水平及机体免疫功能)两种急性白血病相关物质的同时、高灵敏检测，用于急性白血病早期诊断。
[0026]本发明首先在金电极上固定两种分别修饰有电活性物质(二茂铁、亚甲基蓝)的标志物的报告探针-适体双链，在溶菌酶和Y -干扰素存在下两者分别与双链中的适体结合，两报告探针的构象分别发生变化从而引起相应报告探针链上修饰的电活性物质与电极之间的距离变化，从而电流响应发生改变。本发明结合适体识别技术，所制备的传感器具有极高的选择性，可以同时实现溶菌酶和Y干扰素的高灵敏度检测；检测时仅需对样品简单处理，节省了检测时间，降低了检测成本，是一种快速、廉价且灵敏的检测方法，将促进急性白血病早起诊断及分型的发展。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1为本发明的原理图。
【具体实施方式】
[0028]结合附图，一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0029](I)将 I μ mo I/L 溶菌酶报告探针(5 ’ -巯基-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-亚甲基蓝 _3，)和 I μ mo I/L y -干扰素报告探针(5，-巯基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT- 二茂铁-3，)分别在含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)的50 μ L溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgC12, 20mmol/L KCl)中室温下静置2h，以打开二硫键。再向溶液中添加I μ mol/L溶菌酶适体(5’ -ATC AGG GCTAAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’ )和 I μ mol/L 干扰素适体(5，-GGG GTT GGT TGT GTTGGG TGT TGT GT-3’)，溶菌酶报告探针和溶菌酶适体形成溶菌酶报告探针-适体双链结构，Y-干扰素报告探针和Y-干扰素适体形成Y-干扰素报告探针-适体双链结构，得到预处理后的溶菌酶适体和Y-干扰素适体混合液。
[0030](2)金电极用0.3 μ m的Al2O3粉打磨成镜面，二次蒸馏水清洗后，相继在二次蒸馏水和乙醇溶液中超声50s ;将清洗干净的金电极在0.5mol/L的硫酸溶液中循环伏安(0.2?1.65V，0.lV/s，)至稳定，然后用二次蒸馏水冲洗干净，室温晾干。将处理好的金电极浸在经过步骤(I)预处理后的溶菌酶适体和Y-干扰素适体混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0031](3)将经过步骤⑵处理后的电极浸在含有2mmol/L6-巯基_1_己醇(MCH)的溶液(20mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.4，140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中 lh，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗。
[0032](4)将步骤(3)处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可同时检测两种急性白血病标志物的电化学传感器。
[0033]上述电化学传感器可用于两种急性白血病标志物溶菌酶和Y-干扰素的同时检测，具体包括以下步骤:
[0034](I)溶菌酶和Y -干扰素检测溶液的制备:溶菌酶和Y -干扰素在溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/L MgCl2, 20mmol/L KCl)中配制成浓度分别为
0.5?500nmol/L和0.5?500nmol/L的混合液溶液，储存在4°C下备用。[0035](2)将所制备的传感器工作电极浸泡在50 μ L步骤⑴配制的已知浓度的混合液中，37°C下静置lh，之后用二次蒸馏水和清洗液(lOmmol/L Tris-HCl, pH7.4)清洗，得到组装的工作电极。
[0036](3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入 40 ?60μ L 的溶液(20mmol/L Tris-HCl, pH7.4, 140mmol/L NaCl, 20mmol/LMgCl2, 20mmol/L KCl)，然后用差分脉冲伏安法检测组装的工作电极的电流响应，根据所得电流响应与两种急性白血病标志物的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。
[0037](4)将待测样品溶液代替两种标志物的标准溶液，按照所述两种急性白血病标志物的工作曲线的绘制方法进项检测。
[0038]检测结果如下:
[0039]1、Y-干扰素的检测:二茂铁的信号在400±4mV左右，检测范围大约为0.5?500nmol/L,检测限约为 0.3nmol/L。
[0040]2、溶菌酶的检测:亚甲基蓝的信号在_245±3mV左右，检测范围大约为0.5?500nmol/L 检测限约为 0.2nmol/L。
[0041]由以上检测数据可看出，本发明传感器对溶菌酶和干扰素可以实现同时高灵敏度检测。
【权利要求】
1.一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将溶菌酶报告探针和Y-干扰素报告探针分别在含有三(2-氯乙基)磷酸酯的溶液中静置，以打开二硫键；再向溶液中添加溶菌酶适体和Y-干扰素适体，溶菌酶报告探针和溶菌酶适体形成溶菌酶报告探针-适体双链结构，Y-干扰素报告探针和Y-干扰素适体形成Y-干扰素报告探针-适体双链结构； (2)对金电极进行预处理，将处理好的金电极浸在经过步骤(1)预处理后的溶菌酶报告探针-适体双链和Y -干扰素报告探针-适体双链混合液中，室温静置过夜，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗； (3)将步骤(2)处理后的电极浸在含有6-巯基-1-己醇的溶液中，以封闭电极，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗； (4)将步骤(3)处理后的电极作为工作电极，和参比电极、对电极连接在化学工作站上，以得到可同时检测两种急性白血病标志物的电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑴中:所述溶菌酶报告探针为5’ -巯基-C6-GTGCAGAGCTAAGTMCTCTGCAC-亚甲基蓝-3 ’，所述溶菌酶适体为 5 ’ -ATC AGG GCT AAAGAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，所述 Y -干扰素报告探针为 5’-巯基-C6-TTCAACCAACTTTTTTTTTTCAACACCCAT-二茂铁-3’，所述 Y -干扰素适体为 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGTTGT GT-3’。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中:所述溶液中溶菌酶报告探针-适体双链的浓度为I μ mol/L, Y-干扰素报告探针-适体双链的浓度为I μ mo I/L ;所述溶液中含有0.5 μ L10mmol/L三(2-氯乙基)憐酸酯，还含有 20mmol/L Tris-HCl> 140mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液 pH 值为 7.4。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中:所述静置过程在室温下进行，静置时间为2小时。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑵中所述金电极的预处理过程如下:金电极用0.3μπι的Al2O3粉打磨成镜面，二次蒸馏水清洗后，相继在二次蒸馏水和乙醇溶液中超声50s ;将清洗干净的金电极在0.5mol/L的硫酸溶液中循环伏安扫描至稳定,扫描电压为0.2~1.65V,扫描速度为0.lV/s，然后用二次蒸馏水冲洗干净，室温晾干。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑶中:所述溶液中MCH的浓度为2mmol/L，溶液中还含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值为 7.4。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑵与步骤(3)中:所述清洗液为浓度lOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，溶液PH值为7.4。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所制备的电化学传感器用于两种急性白血病标志物溶菌酶和Y-干扰素的同时检测。
9.根据权利要求8所述的电化学传感器用于两种急性白血病标志物的同时检测，具体包括以下步骤: (1)溶菌酶和Y-干扰素检测溶液的制备:溶菌酶和Y-干扰素在溶液中配制成浓度分别为0.5~500nmol/L和0.5~500nmol/L，储存在4°C下备用；所述溶液中包含有20mmol/L Tris-HClU40mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及 20mmol/L KC1，溶液 pH 值为7.4； (2)将所制备的传感器工作电极浸泡在50μ L步骤(1)配制的溶菌酶和Y-干扰素检测溶液中，37°C下静置lh，之后用二次蒸馏水和清洗液清洗，得到组装的工作电极； (3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入40~6(^1^的溶液，溶液中含有20臟01/1 Tris-HClU40mmoI/L NaCl、20mmol/L MgCl2 以及20mmol/L KCl，溶液pH值为7.4，然后用差分脉冲伏安法检测组装的工作电极的电流响应，根据所得电流响应与两种急性 白血病标志物的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线； (4)将待测样品溶液代替两种标志物的标准溶液，按照所述两种急性白血病标志物的工作曲线的绘制方法进项检测。
10.根据权利要求9所述的电化学传感器用于两种急性白血病标志物的同时检测，其特征在于，步骤(2)中，所述清洗液为浓度lOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，溶液pH为7.4。
【文档编号】G01N27/26GK103940872SQ201410181470
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王宗花, 赵凯, 夏建飞, 宋岱珉, 张菲菲, 夏霖, 迟德玲, 李延辉, 夏延致, 夏临华 申请人:青岛大学