用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法
【专利摘要】一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液体染毒，4）中性红染色，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。通过细胞接种密度的优化步骤，筛查了最佳接种密度下最适用于电子烟烟液毒性评价的细胞系BEAS-2B细胞。并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。本测定方法还具有快速简便、灵敏性高的优点。
【专利说明】用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于中性红染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。
【背景技术】
[0002]随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划(2012-2015年)》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为:电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成:烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。
[0003]检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性(例如MTT法)以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。
[0004]中性红吸收试验是广泛接受的用来评价药物、化妆品、工业化工原料及环境污染物对不同细胞的毒性的体外细胞毒性测试方法。在众多细胞毒性测试方法中，中性红试验是最为灵敏的评价卷烟烟气冷凝物细胞毒性的方法。然而，该方法是否可用于评价电子烟烟液细胞毒性还未见文献报道。

【发明内容】

[0005]本发明基于中性红细胞毒性试验的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点，通过筛选适用于电子烟烟液细胞毒性评价的细胞系，优化染毒浓度，建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法，该方法具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，包括以下步骤:
O溶液的制备:
(1)中性红染液:0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50μ g/ml ；
(2)中性红萃取液:冰醋酸:无水乙醇:水=1: 50: 49 ;
(3)阳性对照:十二烷基硫酸钠(SDS)(200 μ g/ml, 100%细胞致死率浓度)； (4)电子烟烟液染毒溶液:由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润齐U，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制。
[0007]2)细胞样本的处理:
(I)细胞接种:本方法适用的细胞种类为人肺正常上皮细胞BEAS-2B细胞。向96孔板的每孔中加入100 μ L的BEAS-2B细胞悬液。
[0008](2)电子烟烟液染毒:细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组。阴性对照组每孔加入100 μ I细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100 μ I电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h。
[0009](3)中性红染色:电子烟烟液染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μ I中性红染液，于37 °C、5% CO2条件下培养3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入IOOul中性红提取液。室温下快速振荡15?20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值。
[0010](4)结果与分析:计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率。相对吸光值C=
A540/ A54ci阴性对照
注:所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A54cihwm应小于等于0.3。
[0011]由于电子烟烟液的细胞毒性较低，应选择对其染毒响应更灵敏的细胞系作为测试细胞系，本发明中对CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞进行筛选。图1所示为CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞最佳接种密度条件优化。如图可知，当CHO细胞，A549细胞的接种密度等于或大于20000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为10000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，因此，CHO细胞和A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔。对于BEAS-2B细胞，接种密度等于或大于40000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为20000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，因此，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。
[0012]本发明采用最佳接种密度下的三种细胞系对电子烟产品I的烟液细胞毒性进行测定。图2所示为采用CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞三种细胞系进行电子烟烟液细胞毒性评价时，电子烟烟液染毒浓度与中性红吸收值的剂量效应关系，根据公式计算得到其半数抑制率IC50值分别为15.2mg/ml, 31.4 mg/ml, 46.7 mg/ml,由此可知，BEAS-2B细胞对电子烟烟液细胞毒性测定更灵敏，本发明中选择BEAS-2B细胞为电子烟烟液细胞毒性测定所用细胞株。
[0013]由图2可知，当选择BEAS-2B细胞为测试细胞株时，当染毒浓度为5mg/ml至60mg/ml时，电子烟烟液对细胞的细胞毒性由小变大，有很好的剂量效应关系，因此考察电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含5mg/ml至60 mg/ml范围。
[0014]本发明根据电子烟烟液的特性，建立了一种基于中性红试验分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法，本发明具有以下特点:(1)针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。(2)通过不同细胞系的筛选，接种密度的优化步骤，选择更适用于电子烟烟液细胞毒性评价的BEAS-2B细胞。(3)并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1.细胞接种密度优化。
[0016]图2.不同细胞系检测电子烟样品I烟液细胞毒性的剂量-效应关系。
[0017]图3.BEAS-2B细胞检测电子烟样品2烟液细胞毒性的剂量-效应关系。
【具体实施方式】
[0018]本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0019]为考察电子烟样品2烟液染毒对BEAS-2B细胞的毒性影响。经扩增培养的BEAS-2B细胞进行胰酶消化以后，制备细胞悬液(2X IO5个/ml)。96孔板(除最外周36个孔)中每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h。细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为阴性对照、8个不同剂量(5 mg/ml,10mg/ml, 15 mg/ml, 20mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml)的电子烟烟液染毒和阳性对照处理。96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I稀释培养液作为溶液背景对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h。电子烟烟液染毒染毒24 h后，吸去培养液，每孔加Λ100 μ I中性红染液，于37 °C、5% CO2条件下培养3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入I ml中性红提取液。室温下快速振荡15?20 min,使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值。图3所示为电子烟烟液染毒所得到的剂量效应曲线，如图3可知，电子烟烟液染毒浓度与中性红检测吸光度值有很好的剂量效应关系，可通过公式计算IC50值。
【权利要求】
1.一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)溶液的制备: (1)中性红染液:0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50μ g/ml ； (2)中性红萃取液:冰醋酸:无水乙醇:水=1: 50: 49 ; (3)阳性对照:十二烷基硫酸钠(SDS)，200μ g/ml, 100%细胞致死率浓度； (4)电子烟烟液染毒溶液:使用分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制； 2)细胞样本的处理: (1)细胞接种:选用人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞，向96孔板的每孔中加入100μ L的BEAS-2B细胞悬液； (2)电子烟烟液染毒:细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组，阴性对照组每孔加入100 μ I细胞 培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100 μ I电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h ； (3)中性红染色:电子烟烟液染毒24h后，吸去培养液，每孔加入100 μ I中性红染液，于37 °C、5% CO2条件下培养3 h，3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200μ IPBS洗2次，加入IOOul中性红萃取液，室温下快速振荡15-20 min,使用酶标仪检测540nm波长处的吸光烟液值； (4)结果与分析:计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率，相对吸光值C=A540/^540阴性对照； 此外，所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A54cih1wm应小于等于0.3。
2.根据权利要求1所述的用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于:人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞最佳接种密度为20000个/孔。
3.根据权利要求1所述的用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于:电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含5mg/ml至60 mg/ml范围。
【文档编号】G01N21/31GK103808681SQ201410094933
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】刘彤, 陈欢, 韩书磊, 吴帅宾, 付立伟, 张小涛, 石龙凯, 侯宏卫, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心