专利名称：红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇以及同系物的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种运用高效液相色谱测定红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇以及同系物的方法，特别是一种利用高效液相色谱同时测定红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法。
背景技术：
紫杉醇已被临床证明对治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等有明显疗效的抗癌药物。红豆杉植物和红豆杉细胞培养物中均含有紫杉醇及丰富的紫杉烷类化合物，紫杉烷类化合物中的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III是合成紫杉醇的前体，这两种成分在红豆杉植物中的含量比紫杉醇多，在太平洋红豆杉中巴卡亭III的含量高达0.2％，分离提取的回收率也比紫杉醇高，已成为合成紫杉醇的主要原料之一。三尖杉宁碱对于治疗白血病，配合地塞米松对粒细胞性白血病疗效较好，然而，三尖杉宁碱和紫杉醇的分子结构、性质非常相似，是紫杉烷类化合物中最难彼此分离的两种物质，成为紫杉醇分离纯化过程中的难点。
通过建立红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱等四种成分含量测定方法，具有重要的应用价值一是为评价不同地区的红豆杉植物中紫杉醇及其同系物含量提供依据；二是在栽培红豆杉中筛选出紫杉醇及其同系物含量较高的优株，以及为决定红豆杉植物的最佳采收季节提供依据；三是在细胞培养实验中，通过定期取样分析，可监测紫杉醇合成的高峰期以及紫杉烷类化合物相互转化的关系；四是在红豆杉细胞培养生产中，筛选出紫杉醇及其同系物含量较高的细胞株；五是为分离纯化紫杉醇工艺的改进提供依据；六是为紫杉醇药品质量提供依据。
关于紫杉醇及其同系物的测定，国内外有很多文献报道，其中具有代表性的例如罗士德等(植物资源与环境1994，3(2)31～33)采用Watmanpartisi1 ODS柱，流动相为甲醇∶水∶乙腈体积比为20∶41∶39，分析了“红豆杉及其近缘植物”中的紫杉醇、巴卡亭III、三尖杉宁碱三种成分的含量，其结果显示，上述三种成分在HPLC色谱图中反映的分离效果不理想，三尖杉宁碱峰和紫杉醇峰未能实现基线分离；项伟等(植物资源与环境1997，6(1)56～57)采用反相C18柱，流动相也用甲醇∶水∶乙腈体积比为20∶41∶39分析了云南红豆杉中紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙酰基三尖杉宁碱、taxuyunnanine A和10-deacetyltaxuyunnanine A的含量。均未提出有关10-去乙酰基巴卡亭III的测定方法，其原因是10-去乙酰基巴卡亭III的极性比其它紫杉烷类化合物的极性大得多，而三尖杉宁碱和紫杉醇之间又是极难分离的，使之在液相色谱分离中，虽然满足了10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III及其杂质成分分离的洗脱比例条件，但是，却不能满足三尖杉宁碱和紫杉醇之间的分离，反之亦然。因此，只采用一种洗脱比例是不可能同时分离出红豆杉植物提取物或红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物中10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇四种成分以及其它杂质成分的。
申请人在开发应用高效液相色谱中发现，红豆杉植物和红豆杉细胞培养物中含有多种紫杉烷类化合物以及复杂的杂质成分，要将上述四种成分在较短的时间内同时分离是比较困难的。申请人在已公开的等度洗脱法基础上，采用分步等度洗脱法，完成了测定上述四种成分采用流动相为乙腈∶水∶甲醇体积比为27∶44∶29，在反相色谱柱Nova-Pak C18上等度洗脱，先分离出结构和性质非常类似的三尖杉宁碱和紫杉醇；而用极性较大的流动相甲醇∶水体积比为43∶57，在相同的色谱柱上等度洗脱分离出极性较大的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III。此方法需要二次进样分步骤测定，其不足之处是测定时间较长、程序繁琐、工作量大，且所需的检测费用较高。
还有一种叫梯度洗脱法，有关报导如V.Bringi等在公开专利申请书(WO 97/44476.1997)中用Phenomenex Curosil-G柱，采用二元梯度比例洗脱，流动相为乙腈和含0.01m molKH2PO4的缓冲水溶液，也能分离出10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、紫杉醇三种成分，紫杉醇的保留时间约8分钟。而用Phenomenex IB-SIL Phenyl柱和采用另一种二元梯度比例洗脱，流动相是乙腈和含0.015m molKH2PO4的缓冲水溶液，分离出10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、紫杉醇三种成分，紫杉醇的保留时间约为9.5分钟，但以上二种方法均未提及三尖杉宁碱的测定。此外，V.Bringi等(WO97/44476.1997)使用Diphenyl柱，用二元梯度比例洗脱，流动相为乙腈和含0.015m molKH2PO4的缓冲水溶液，此时，虽然能够同时分离出上述四种成分及其它几个紫杉烷化合物，但是紫杉醇的保留时间为31～33分钟，完成一个分析测定至少需要40分钟，因此，此法不适用于日常大量的分析。需要特别指出的是，以上方法均使用了缓冲溶液，虽然在许多液相色谱分离中，流动相加入缓冲溶液，可以增加色谱峰的分离度，但在液相色谱系统中极易产生结晶盐，会导致管路堵塞、泵头磨损及色谱柱寿命缩短等，因此，应尽可能不使用缓冲溶液为佳。
总之，以上方法存在要么分析时间较长，要么不能够把三尖杉宁碱峰和紫杉醇峰实现基线分离，且梯度比例洗脱法均使用了缓冲溶液，存在操作比较繁琐的问题。

发明内容
本发明的目的就是提供一种既简便又快速测定红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III和三尖杉宁碱的方法。
本发明可由如下方式来实现本发明采用反相色谱柱为Nova-Pak C18，它是美国Waters公司生产，规格为3.9×150mm，填料粒度为4μm，流动相由乙腈和水二种色谱试剂组成，首先用乙腈∶水体积比为30∶70的比例平衡色谱系统，红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物或红豆杉植物提取物进入系统，梯度洗脱，在0～10分钟，乙腈∶水的体积比从30∶70逐步变化到50∶50，梯度变化曲线为0.5～0.7；然后，继续以50∶50的比例洗脱3分钟；最后，用30∶70的比例平衡系统5分钟，共18分钟完成一个分析测定，紫杉醇的保留时间为11.12～11.8分钟。见梯度表1、2。
梯度表1时间(min) 乙腈％(A) 水％(B) 流速(mL/min) 线形0 30 7010.510 50 501 113 50 501 018 30 701 1四种成分的保留时间如下所示组分 保留时间(min)10-去乙酰基巴卡亭III 3.17巴卡亭III 5.03
三尖杉宁碱 10.30紫杉醇 11.12梯度表2时间(min)乙腈％(A)水％(B) 流速(mL/min) 线形0 30 70 1 0.710 50 50 1 113 50 50 1 018 30 70 1 1四种成分的保留时间如下所示组分 保留时间(min)10-去乙酰基巴卡亭III 3.24巴卡亭III5.41三尖杉宁碱 11.04紫杉醇 11.80本发明所采用的红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物以及红豆杉植物提取物是用有机溶剂提取得到的粗提物，在色谱柱Nova-Pak C18上梯度洗脱，10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇四种成分峰同时在HPLC色谱图上基线分离。红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养物提取物以及红豆杉植物提取物是短叶红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、云南红豆杉、浆果红豆杉或曼地亚红豆杉的树皮、枝叶、细胞或细胞培养液的提取物。
本发明由于采用了改进的梯度比例洗脱法，色谱柱分离的峰塔板数增加，梯度洗脱法紫杉醇峰塔板数为3.26×104，当检测器的灵敏度是0.05Aufs时，紫杉醇的最低检出量可达0.001μg，此外，本发明不需要使用缓冲溶液，同样使红豆杉植物及其细胞培养物中10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇在HPLC色谱图上的色谱峰得到很好的分离效果，从而使本发明能快速、简便同时测定红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III和三尖杉宁碱，具有准确、灵敏度高和经济的特点。
具体实施例方式
下面结合色谱图，对本发明作进一步的描述。


图1为本发明测定红豆杉细胞的色谱图。
图2为用等度比例乙腈∶水∶甲醇测定红豆杉细胞的色谱图。
图3为用等度比例甲醇∶水测定红豆杉细胞的色谱图。
实验仪器与试药Waters 515 WDL-95高效液相色谱仪由美国Waters公司生产，色谱工作站软件由大连化学物理研究所开发。对照品即10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇购于SIGMA公司，纯度均大于97％以上；红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物以及红豆杉植物提取物由申请人提供；HPLC分析用色谱纯试剂甲醇、乙腈和纯净水，提取用分析纯试剂甲醇、丙酮、二氯甲烷和蒸馏水。
色谱条件色谱柱为Nova-Pak C18柱，它由美国Waters公司生产，规格3.9×150mm，填料粒度4μm；流速为1mL/min；紫外检测波长为227nm；检测器灵敏度为0.05Aufs；柱温为35℃；流动相采用乙腈和水，洗脱程序采用梯度表1。
制定标准曲线根据四种成分对照品的标准含量，采用外标法，准确定量红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物以及红豆杉植物提取物中四种成分的含量。精密称取10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇四种对照品，分别加甲醇溶解制成每1mL中约含0.5mg对照品的标准溶液，分别取不同体积的标准溶液，配制10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇的混合对照品溶液，10-去乙酰基巴卡亭III的浓度依次为0.001066、0.00533、0.01066、0.02665、0.0533mg/mL，巴卡亭III的浓度依次为0.00112、0.0056、0.0112、0.028、0.056mg/mL，三尖杉宁碱的浓度依次为0.00104、0.0052、0.0104、0.026、0.052mg/mL，紫杉醇的浓度依次为0.001034、0.00517、0.01034、0.02585、0.0517mg/mL。取以上各浓度的混合对照品溶液分别进样5μL，按上述色谱条件分别测定。以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇标准曲线。各自的回归方程、相关系数(n＝5)分别为Y＝(3.087×107)x+(25570.686) r＝0.9993Y＝(2.502×107)x+(103175.688) r＝0.9952Y＝(2.412×107)x+(-19541.428) r＝0.9999Y＝(2.962×107)x+(-16402.496) r＝1.0000线性范围0.001～0.3μg。
精密度及稳定性试验配制10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇的对照品混合溶液，浓度分别为0.01066，0.0112，0.0104，0.01034mg/mL，进样5μL，连续进样5次，其相对误差(RSD)分别为0.83％，0.76％，0.89％，0.52％。取供试品溶液1份，进样5μL，连续进样5次，第1、2、3天相同方法测定。10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇的日内相对误差(RSD)分别为0.58％，0.63％，0.61％，0.55％，日间相对误差(RSD)分别为2.98％，2.16％，2.07％，2.36％。结果表明供试品溶液至少在3天内是稳定的。
实施例一红豆杉细胞提取物的制备精确称取中国红豆杉冻干细胞粉0.2g，加20mL甲醇浸泡24小时后，用超声波振荡15分钟，细胞用滤纸过滤，加20mL甲醇重复超声三次，合并滤液减压浓缩至干，加10mL二氯甲烷和10mL蒸馏水萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液浓缩至干，用甲醇溶解洗脱并定容10mL，用0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定，每次进样5μL。
红豆杉细胞采用二种方法进行测定1、在上述的色谱条件下，采用本发明的二元梯度比例洗脱，见梯度表1，使上述四种成分峰同时在HPLC色谱图上实现基线分离，见色谱图1，并对四种成分进行定量分析。
梯度表1时间(min)乙腈％(A) 水％(B) 流速(mL/min) 线形0307010.51050501 11350501 01830701 1四种成分的保留时间如下所示组分保留时间(min)10-去乙酰基巴卡亭III3.17巴卡亭III 5.03三尖杉宁碱 10.30紫杉醇 11.12
2、在上述的色谱条件下，采用等度洗脱法分二次进样分别测定四种成分，采用等度比例乙腈∶水∶甲醇体积比为27∶44∶29为流动相分离三尖杉宁碱和紫杉醇，并对其进行定量分析，三尖杉宁碱和紫杉醇的保留时间分别是9.90，11.15分钟，见色谱图2；另外采用极性较大的等度比例甲醇∶水体积比为43∶57为流动相分离极性较大的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III，并对其进行定量分析，10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III的保留时间分别是6.95，11.67分钟，见色谱图3。
这二种方法的含量测定结果比较见表1。
表1 表中D表示10-去乙酰基巴卡亭III，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉宁碱，T表示紫杉醇。
实施例二红豆杉细胞培养液提取物的制备将云南红豆杉细胞用200目滤布过滤，滤液即为红豆杉细胞培养液。准确量取培养液5mL，直接加10mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液浓缩至干，用甲醇溶解洗脱并定容5mL。用0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定，每次进样5μL。
细胞培养液采用实施例一所述的二种方法进行测定，含量测定结果比较见表2。
表2

表中D表示10-去乙酰基巴卡亭III，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉宁碱，T表示紫杉醇。
实施例三红豆杉植物提取物的制备精密称取南方红豆杉枝叶粉碎的干粉5克，加入30mL丙酮和20mL水即丙酮和水体积比为6∶4浸提，并用磁力搅拌器搅拌和过滤4次，每次为60分钟，合并滤液用旋转蒸发器回收丙酮，回收丙酮后剩余的水部分分别加50mL二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷溶液减压浓缩至干，甲醇溶解洗脱并定容100mL，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定，每次进样5μL。
红豆杉枝叶采用实施例一所述的二种方法进行测定，含量测定结果比较见表3。
表3

表中D表示10-去乙酰基巴卡亭III，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉宁碱，T表示紫杉醇。
以上测定结果表明，用两种方法测定红豆杉枝叶、红豆杉细胞及培养液中10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱及紫杉醇四种成分的含量的结果基本上一致，本发明分析时间大大缩短，色谱试剂用量大大减少，又可以同时分析四种成分，具备快速、简便、准确、灵敏度高和经济的特点。
权利要求
1.一种红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇以及同系物的测定方法，其特征在于色谱柱是Nova-Pak C18，流动相由乙腈和水二种色谱试剂组成，首先用乙腈∶水体积比为30∶70的比例平衡色谱系统，红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物或红豆杉植物提取物进入系统，梯度洗脱，在0～10分钟，乙腈∶水的体积比从30∶70逐步变化到50∶50，梯度变化曲线为0.5～0.7；然后，继续以50∶50的比例洗脱3分钟；最后，用30∶70的比例平衡系统5分钟，紫杉醇的保留时间为11.12～11.8分钟。
2.依权利要求1所述的测定方法，其特征在于红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养液提取物以及红豆杉植物提取物是用有机溶剂提取得到的粗提物，在色谱柱Nova-Pak C18上梯度洗脱，10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉宁碱和紫杉醇四种成分峰同时在HPLC色谱图上基线分离。
3.依权利要求1所述的测定方法，其特征在于红豆杉细胞提取物或红豆杉细胞培养物提取物以及红豆杉植物提取物是短叶红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、云南红豆杉、浆果红豆杉或曼地亚红豆杉的树皮、枝叶、细胞或细胞培养液的提取物。
全文摘要
本发明涉及一种红豆杉植物及其细胞培养物中紫杉醇以及同系物的测定方法，其特征在于色谱柱是Nova－Pak C
文档编号G01N30/34GK1588044SQ20041005153
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者黄巧明, 夏惠青, 侯嵩生, 王国亮, 李志良 申请人:梅县梅雁生物工程研究所