专利名称：快速检测蜂产品的抗氧化性能的电化学方法
技术领域：
本发明涉及的是蜂产品的抗氧化性能的检测方法，具体是一种检测蜂产品酚酸类物质含量的电化学方法。
背景技术：
蜂蜜、蜂花粉、蜂胶等蜂产品具有多种生物学活性，如抗氧化、抗菌消炎、滋润、抗血栓、降低胆固醇、促进细胞再生等，其主要原因是蜂产品中存在大量的酚类化合物以及抗坏血酸、类胡萝卜素、过氧化氢酶、过氧化物酶等，这些物质具有很强的抗氧化活性。抗氧化活性可以保护生物体免受自由基的攻击，可以降低癌症、心脑血管疾病以及糖尿病的发生几率。蜂产品总的抗氧化性能与其含有的酚酸类物质密切相关。由于花源种类繁多，各花源色、香、味和成分不同，不同蜂产品的化学组分和特性也不尽相同，其抗氧化活性也有差异。目前，分析蜂产品中抗氧化性能的主要方法有比色法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等。这些方法要求检查仪器精密，测试成本高，操作复杂。此外，这些方法通常只能测定单一结构物质的抗氧化性，但蜂产品中的抗氧化成分多为酚酸类物质的混合物，因此其对蜂产品的抗氧化成分的分析不全面。电化学方法具有操作简便、检测快速、检测灵敏度高等优点，将其运用至酚酸类物质的测定，可避免传统光学方法的局限性，分析各种酚酸类物质的含量，从而测定其抗氧化性能。目前，尚未有电化学方法测定蜂产品抗氧化活性的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、稳定性好、简单易行的测定蜂产品中抗氧化活性的电化学方法，具体而言是蜂产品中的酚酸类物质的含量的电化学测定方法。本发明是通过以下技术方案实现的。一种快速检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，包括如下步骤步骤a)、玻碳电极的预处理；步骤b)、乙酸乙酯法提取所述蜂产品中的酚酸类物质；步骤C)、以没食子酸为标准品，制定标准曲线；步骤d)、用所述玻碳电极测定所述蜂产品中的酚酸类物质的含量。本发明具体实施时，优选地，所述步骤a)包括以下步骤将所述玻碳电极在麂皮上用Al2O3粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗，再用超声清洗10 30min ;将清洗后的所述玻碳电极依次放入体积比为I : I的硝酸、丙酮溶液中各浸泡3 15min,然后用蒸懼水冲洗所述玻碳电极；将所述玻碳电极在红外灯下烘干。本发明具体实施时，优选地，所述步骤b)包括以下步骤量取所述蜂产品放于容器中，加入的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液；在所述溶液中加入乙酸乙酯，萃取三次，合并萃取所得上清液I;将所得上清液I用双蒸水萃取，取上清液II，所述上清液II中加入乙醇溶液定容，得到待测溶液；将所述待测溶液置于冰箱内保存。、
进一步,所述步骤b)中所述蜂产品的量取量为5 IOg ;溶解所述蜂产品所加入的双蒸水的量为20 30mL ;所述乙酸乙酯的使用量为10 20mL ;所述乙醇溶液的体积浓度为60 80%，用量为10 20mL ;所述待测溶液在所述冰箱中的保存温度为O 4°C。本发明具体实施时，优选地，所述步骤c)包括以下步骤称取没食子酸标准品，溶于乙醇溶液中，配置成不同浓度的没食子酸标准液；在电化学测试杯中加入HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入配制的不同浓度的没食子酸标准液，用微分脉冲伏安法记录没食子酸的氧化峰电流值，根据没食子酸浓度值与对应氧化峰电流值绘制标准曲线。进一步，所述乙醇的体积浓度为60 80 %，所述HAc-NaAc缓冲液是pH4. O的5mL的O. 1-0. 2M(以NaAc的含量计)的HAc-NaAc缓冲液；所述的微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V,富集时间90 120s,扫描速度50 100mV/s。本发明具体实施时，优选地，所述步骤d)包括以下步骤在电化学测试杯中加入HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在所述电化学测试杯中加入所述待测溶液用微分脉冲伏安法记录所述待测溶液的氧化峰电流值，根据所述标准曲线计算所述待测溶液中酚酸类物质的含量，以没食子酸的相对量表示。进一步，所述HAc-NaAc缓冲液是ρΗ4· O的5mL的O. 1-0. 2M(以NaAc的含量计)的HAc-NaAc缓冲液，所述待测溶液的用量为100 μ L，所述的微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V,富集时间90 120s,扫描速度50 100mV/s。本发明具体实施时，优选地，所述蜂产品是蜂蜜、蜂花粉或蜂胶。本发明有如下的有益效果本发明对蜂产品中的酚酸类进行了提取和测定，通过检测所述待测溶液的氧化还原电流峰值的大小，根据标准曲线计算蜂产品的酚酸类物质的含量。本发明操作简便，成本较低，易于实现现场检测。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以使本领域的技术人员充分地了解本发明的目的、特征和效果。


图I为微分脉冲伏安法记录没食子酸的氧化峰电流值，从I至9浓度分别为Oyg/g>0. 5 μ g/g、l. O μ g/g、l. 25 μ g/g、l. 75 μ g/g、2. 25 μ g/g>2. 75 μ g/g、3. 25μ g/g 以及3. 75 μ g/g。图2为根据没食子酸浓度值与对应氧化峰电流绘制的标准曲线。图3为微分脉冲伏安法记录枇杷蜂蜜的氧化峰电流值。图4为微分脉冲伏安法记录野菊花和益母草蜂蜜的氧化峰电流值。图5为微分脉冲伏安法记录紫云英蜂蜜的氧化峰电流值。
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。一种快速检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，包括如下步骤步骤a)、玻碳电极的预处理，以活化电极；步骤b)、乙酸乙酯法提取蜂产品中的酚酸类物质；、
步骤C)、以没食子酸为标准品，制定标准曲线；步骤d)、用玻碳电极测定蜂产品中的酚酸类物质的含量。步骤a)包括以下步骤将玻碳电极在麂皮上 用Al2O3粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗，再用超声清洗10 30min ;将清洗后的玻碳电极依次放入体积比为I : I的硝酸、丙酮溶液中各浸泡3 15min,然后用蒸懼水冲洗玻碳电极；将玻碳电极在红外灯下烘干。步骤b)包括以下步骤量取5 IOg蜂产品放于容器中，加入20 30mL的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液；在溶液中加入10 20mL乙酸乙酯，萃取三次，合并萃取所得上清液I ;将所得上清液I用双蒸水萃取，取上清液II，余液用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，上清液II中加入体积浓度为60 80%乙醇溶液10 20mL定容，得到待测溶液；将待测溶液置于冰箱内在4°C保存。步骤c)包括以下步骤称取没食子酸标准品，溶于体积浓度为60 80%的乙醇溶液中，配置成不同浓度的没食子酸标准液；在电化学测试杯中加入PH4. O的5mL的O. IM的HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入配制的不同浓度的没食子酸标准液，用微分脉冲伏安法记录没食子酸的氧化峰电流值，根据没食子酸浓度值与对应氧化峰电流值绘制标准曲线。微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V,富集时间90 120s，扫描速度50 100mV/so步骤d)包括以下步骤在电化学测试杯中加入5mL的O. 1Μ(ρΗ4. O)的醋酸缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入100 μ L待测溶液，用微分脉冲伏安法记录所述待测溶液的氧化峰电流值，根据标准曲线计算所述待测溶液中酚酸类物质的含量，以没食子酸的相对量表示。微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V,富集时间90 120s，扫描速度50 100mV/s。蜂产品是蜂蜜、蜂花粉或蜂胶。实施例I步骤a)、玻碳电极的预处理将玻碳电极在麂皮上用Al2O3粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗，再用超声清洗30min;将清洗后的玻碳电极依次放入体积比为I : I的硝酸、丙酮溶液中各浸泡15min，然后用蒸馏水冲洗电极；将电极在红外灯下烘干。步骤b)，乙酸乙酯法提取蜂产品中的酚酸类物质量取上海森蜂园的枇杷蜂蜜(2010年11月生产)IOg放于烧杯中，加入IOmL的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液；在溶液中加入IOmL的乙酸乙酯，萃取三次，合并萃取所得上清液I。将所得上清液I用30mL双蒸水萃取，取上清液II，余液用旋转蒸发仪50°C、60转/min回收乙酸乙酯，上清液II加入体积浓度为70%的乙醇定容至20mL，得到待测溶液；将待测溶液置于冰箱内在4°C保存。步骤C)，没食子酸标准曲线的制定称取没食子酸标准品，溶于体积浓度为70%的乙醇溶液中，配置成浓度分别为O μ g/g、0. 5 μ g/g、I. O μ g/g、I. 25 μ g/g、I. 75 μ g/g、
2.25μ g/g、2. 75μ g/g、3. 25 μ g/g以及3. 75 μ g/g的没食子酸标准液；在电化学测试杯中加入pH4. O的5mL的0. IM的HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中分别加入上述没食子酸标准液，用微分脉冲伏安法记录没食子酸的氧化峰电流值，扫描电位范围O 0. 8V，富集时间120s，扫描速度50mV/s。根据没食子酸浓度值与对应氧化峰电流值绘制标准曲线(图 2)，线性回归方程为 I (μ A) =-0. 1908-0. 8916C(y g/g),r2 = O. 9946。;I代表氧化峰电流，C代表没食子酸浓度，r2代表线性相关系数。
步骤d)，在电化学测试杯中加入5mL的O. 1Μ(ρΗ4. O)的醋酸缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入100 μ L待测溶液，用微分脉冲伏安法记录待测溶液的氧化峰电流值，扫描电位范围O O. 8V，富集时间120s，扫描速度50mV/s。根据标准曲线计算枇杷蜂蜜中酚酸类物质的含量为105. 28±5. 60 μ g/g。实施例2步骤a)、玻碳电极的预处理同实施例I。步骤b)、乙酸乙酯法提取蜂产品中的酚酸类物质量取上海森蜂园的野菊花蜂蜜(2010年11月生产)和益母草蜜(2010年10月生产)各IOg分别放于烧杯中，加入IOmL的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液。在溶液中加入IOmL的乙酸乙酯，萃取三次，合并萃取所得 上清液I。将所得上清液I用30mL双蒸水萃取，取上清液II，余液用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，上清液II分别加入体积浓度为70%的乙醇定容至20mL，得到待测溶液。将待测溶液置于冰箱内在4°C保存。步骤c)、没食子酸标准曲线的制定同实施例I。步骤d)、在电化学测试杯中加入5mL的O. 1Μ(ρΗ4. O)的醋酸缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入100 μ L待测溶液，用微分脉冲伏安法记录待测溶液的氧化峰电流值，扫描电位范围O O. 8V,富集时间120s，扫描速度50mV/s。根据标准曲线计算得至IJ，野菊花蜜中酚酸类物质的含量为140. 55±6. 21 μ g/g，益母草蜜中酚酸类物质的含量为237. 27±10. 59 μ g/g。实施例3步骤a)、玻碳电极的预处理同实施例I。步骤b)、乙酸乙酯法提取蜂产品中的酚酸类物质量取江西汪氏蜜蜂园的龙眼蜂蜜(2010年9月生产)IOg放于烧杯中，加入IOmL的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液。在溶液中加入IOmL的乙酸乙酯，萃取三次，合并萃取所得上清液I。将所得上清液I用30mL双蒸水萃取，取上清液II，余液用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，上清液II加入体积浓度为70%乙醇定容至20mL，得到待测溶液。将配制好的溶液置于冰箱内在4°C保存。步骤c)、没食子酸标准曲线的制定同实施例I。步骤d)、在电化学测试杯中加入5mL的O. 1Μ(ρΗ4. O)的醋酸缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入100 μ L待测溶液，用微分脉冲伏安法记录待测溶液的氧化峰电流值，扫描电位范围O O. 8V，富集时间120s，扫描速度50mV/s。根据标准曲线计算，龙眼蜂蜜中酚酸类物质的含量为162. 21 ±5. 36 μ g/g。验证实施例采用Folin-Ciocalteu法测定蜂产品中酚酸类物质的含量，验证本发明方法。其反应原理是酚类化合物在碱性条件下可以将Folin-Ciocalteu试剂中的钨钥酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚含量呈正相关，在760nm左右有最大吸收。准确移取ImL实施例I 3中步骤b)所制备的待测溶液，加入ImL的Folin-Ciocalteu试剂,混勻,然后加入5mL lmol/L的碳酸钠溶液,用蒸懼水定容至IOmL,充分混匀，在黑暗条件下放置lh，在波长为760nm下测定光密度值。将对照品没食子酸配置成O. lmg/mL的标准溶液,按照上述方法制定标准曲线,实施例I 3中步骤b)所制备的待测溶液中酚酸类物质的含量在标准曲线中查得相应的值。
测定结果表明枇杷、野菊花、益母草和龙眼蜂蜜中的酚酸类物质的含量分别为108. 05±9. 00μ g/g、145. 87±9. 26μ g/g、201. 32±0. 39μ g/g 以及 162. 41 ±9. 52 μ g/g。根据实施例I 3测得的枇杷、野菊花、益母草和龙眼蜂蜜中的酚酸类物质的含量，与本验证实施例测得的酚酸类物质的含量值，经SPSS16. O软件分析，两种方法结果无显著性差异，说明本发明的方法能准确地测得蜂产品的酚酸类物质的含量。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。权利要求
1.ー种快速检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤a)、玻碳电极的预处理； 步骤b)、こ酸こ酯法提取所述蜂产品中的酚酸类物质； 步骤C)、以没食子酸为标准品，制定标准曲线； 步骤d)、用所述玻碳电极測定所述蜂产品中的酚酸类物质的含量。
2.如权利要求I所述的快速检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述步骤a)包括以下步骤将所述玻碳电极在麂皮上用Al2O3粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗，再用超声清洗10 30min，将清洗后的所述玻碳电极依次放入体积比为I : I的硝酸、丙酮溶液中各浸泡3 15min，然后用蒸馏水冲洗所述玻碳电极，将所述玻碳电极在红外灯下烘干。
3.根据权利要求I所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述步骤b)包括以下步骤量取所述蜂产品放于容器中，加入的双蒸水，搅拌至溶解形成溶液；在所述溶液中加入こ酸こ酷，萃取三次，合并萃取所得上清液I ;将所得上清液I用双蒸水萃取，取上清液II，所述上清液II中加入こ醇溶液定容，得到待测溶液；将所述待测溶液置于冰箱内保存。
4.根据权利要求3所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述步骤b)中所述蜂产品的量取量为5 IOg ;溶解所述蜂产品所加入的双蒸水的量为20 30mL ；所述こ酸こ酯的使用量为10 20mL ;所述こ醇溶液的体积浓度为60 80%，用量为10 20mL ;所述待测溶液在所述冰箱中的保存温度为O 4°C。
5.根据权利要求I所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述步骤c)包括以下步骤称取没食子酸标准品，溶于こ醇溶液中，配置成不同浓度的没食子酸标准液；在电化学测试杯中加入HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在电化学测试杯中加入配制的不同浓度的没食子酸标准液，用微分脉冲伏安法记录没食子酸的氧化峰电流值，根据没食子酸浓度值与对应氧化峰电流值绘制标准曲线。
6.根据权利要求5所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述こ醇的体积浓度为60 80%，所述HAc-NaAc缓冲液是pH4. O的5mL的O. 1-0. 2M的HAc-NaAc缓冲液；所述的微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V，富集时间90 120s，扫描速度 50 100mV/so
7.根据权利要求3所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述步骤d)包括以下步骤在电化学测试杯中加入HAc-NaAc缓冲液作为支持溶液，然后在所述电化学测试杯中加入所述待测溶液用微分脉冲伏安法记录所述待测溶液的氧化峰电流值，根据所述标准曲线计算所述待测溶液中酚酸类物质的含量。
8.根据权利要求7所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述HAc-NaAc缓冲液是pH4. O的5mL的O. 1-0. 2M的HAc-NaAc缓冲液，所述待测溶液的用量为100 μ L，所述的微分脉冲伏安法条件为扫描电位范围O O. 8V，富集时间90 120s，扫描速度 50 100mV/s。
9.根据权利要求I所述的检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，其中，所述蜂产品是蜂蜜、蜂花粉或蜂胶。
全文摘要
一种快速检测蜂产品的抗氧化活性的电化学方法，具体包括电极的预处理；乙酸乙酯法提取蜂产品中的酚酸类物质；以没食子酸为标准品，制定标准曲线；用玻碳电极测定蜂产品中的抗氧化物含量，具体是通过待测溶液的氧化还原电流峰值的大小来确定其抗氧化物质含量。本发明操作简便，成本较低，易于实现现场检测。
文档编号G01N27/26GK102636526SQ20121009838
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者王正武, 米芹 申请人:上海交通大学