专利名称：大豆内生细菌多样性的pcr-dgge分析方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆内生细菌多样性的分析方法。
背景技术：
植物内生细菌是植物微生态系统中的天然组成成分，人们发现健康植物体内存在细菌，并且已经认识到植物内生细菌具有促进宿主或周围其他植物的生长、增强宿主植物的抗性等作用。随着越来越多的细菌从不同植物体内分离到，有关内生细菌的研究才逐渐引起人们的广泛关注。植物内生细菌作为生防因子在预防植物病虫害方面具有广泛的应用前景，它们不仅能够减轻和防治植物病害，而且能够减少因使用化学农药带来的环境污染等问题。
人们对植物内生细菌的研究多数采用传统培养方法，对其生物学功能进行研究。但是，由于人们对内生细菌的生长条件尚不清楚，所用分离培养基不能满足所有内生细菌的营养需求，仅有很少一部分内生细菌能够被分离到。因此，传统培养方法不能全面客观的反映植物内生细菌的种群结构、细菌多样性等信息。

发明内容
本发明是要解决传统培养方法不能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性的问题，提供大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法。本发明大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，按以下步骤进行一、大豆根表面的清理及灭菌；二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA ；三、大豆根总DNA的纯化；四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ；五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段,然后以产物A为模板,米用添加了 GC碱基片段的引物968F和1378R为弓I物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ;六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向DGGE胶的加样孔中加入200 μ L产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30% 70% ;七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30% 70%，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向每个加样孔加入10 μ L产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为 5’ -AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物 1492R 序列为 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ ；步骤五中引物968F 序列为5’ -AACGCGAAGAACCTTAC -3’，引物1378R 序列为5’ -CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物 968F 的 5’ 端加上的碱基片段为 CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。本发明的有益效果本发明方法能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性。与传统的培养方法相比该方法具有操作简便、快速、重复性好等优势，在24小时内即可获得结果，在快速同时还能对比分析大量样品，因此它可以对比分析大豆不同组织部位的内生细菌群落的差异，也可以研究同一部位的不同生长时期的变化过程。此外，该方法可以对胶片中的单一条带进行分析直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序，分析种属多样性等。


图I为具体实施方式
五步骤二中提取的大豆根的总DNA的电泳图；图2为具体实施方式
五步骤四获得的产物A的电泳图；图3为具体实施方式
五步骤五获得的产物B的电泳图；图4为具体实施方式
五步骤六中垂直电泳；图5为具体实施方式
五步骤七中水平电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法,按以下步骤进行一、大豆根表面的清理及灭菌；二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA ；三、大豆根总DNA的纯化；四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ；五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了 GC碱基片段的引物968F和1378R为弓I物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ;六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向DGGE胶的加样孔中加入200 μ L产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30% 70% ;七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30% 70%，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向每个加样孔加入10 μ L产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为 5’ -AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物 1492R 序列为 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ ；步骤五中引物968F 序列为5’ -AACGCGAAGAACCTTAC -3’，引物1378R 序列为5’ -CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物 968F 的 5’ 端加上的碱基片段为 CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。
具体实施方式
二 本实施方式是对具体实施方式
一所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法的步骤一做进一步的说明，步骤一中大豆根表面的清理及灭菌的具体步骤为用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理无菌水冲洗3次，体积浓度为75%的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2. 5%次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75%的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。
具体实施方式
三本实施方式是对具体实施方式
一所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法的步骤四做进一步的说明，步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
权利要求
1.大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行 一、大豆根表面的清理及灭菌； 二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA； 三、大豆根总DNA的纯化； 四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A ; 五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了 GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B ; 六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向DGGE胶的加样孔中加入200 μ L产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30% 70% ; 七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30% 70%，先将电泳缓冲液预热至60°C，以180V电压预电泳lOmin，然后向每个加样孔加入IOyL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为 5’ -AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物 1492R 序列为 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ ；步骤五中引物968F序列为5’ -AACGCGAAGAACCTTAC-3’，弓丨物1378R序列为5’ -CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物 968F 的 5’ 端加上的碱基片段为 CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。
2.根据权利要求I所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤一中大豆根表面的清理及灭菌的具体步骤为用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理无菌水冲洗3次，体积浓度为75%的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2.5 %次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75 %的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。
3.根据权利要求I所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成 成分用量大豆根总DNA50ng 20mM添加碱基片段的引物968F20 mM 引物 1378RlμL 2xPCr< Master Mix25p.LCldH2O补允个:50μPCR扩增条件为94°C预变性窗in，94°C变性lmin，52°C复性lmin，72°C延伸lmin,共30个循环，再72 °C延伸8min，4°C保温。
4.根据权利要求I所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤五中第二次PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
全文摘要
大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，涉及一种大豆内生细菌多样性的分析方法。是要解决传统培养方法不能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性的问题。方法一、大豆根表面的清理及灭菌；二、提取的大豆根的总DNA；三、大豆根总DNA的纯化；四、以大豆根总DNA为模板，进行第一次PCR扩增，纯化得产物A；五、以产物A为模板，进行第二次PCR扩增，纯化得产物B；六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，确定变性剂浓度梯度为30％～70％；七、水平电泳，电泳结束后染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法。用于分析大豆内生细菌多样性。
文档编号G01N27/447GK102943117SQ20121051996
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者孟利强, 赵晓宇, 李晶, 张淑梅, 曹旭, 姜威, 张云湖 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所