专利名称：一种免疫层析试条用封闭剂组合物以及一种免疫层析试条的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫层析技术，具体涉及一种免疫层析试条用封闭剂组合物以及一种免疫层析试条。
背景技术：
随着免疫诊断技术的发展，各种原材料以及各种检测手段的综合应用，技术越来越向小型、操作简单、快速、准确度高的方向发展。免疫层析技术是这发展当中非常重要的一个部分，它从空间、时间上改变了这一技术的发展方向，在空间上，它从以前的实验室搬到家庭，在时间上，它把几天才能够出检测结果缩短到几分钟出检测结果。因而大大推动了免疫诊断技术的快速发展。免疫层析技术是利用抗原抗体高特异性、高灵敏性的反应原理，通过高效信号标记物标记抗体(或抗原)来检测抗原(或抗原)。在技术当中一个非常重要的技术难点就是抗原(或抗体)的固定材料，从目前解决的情况来看，一般选择以下几种固定材料硝酸纤维素膜(NC膜)、尼纶膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)，因为这些膜都能够牢固的结合蛋白质，并且结合能力非常高。其中最常见的是NC膜，因为它结合蛋白质能力强，价格相对比较便宜。NC膜虽然能够强有力的吸附抗原或者抗体，但是在检测生物样本过程中，由于生物样本中存在大量的其他生物大分子，这些生物大分子也能够非特异性吸附到NC膜上，因而严重干扰抗原抗体的识别能力，减低检测灵敏度。因此，需要找到一种技术解决抗原(或抗体)固定后，其他的生物大分子不会干扰抗原抗体反应的试剂目前，有很多大量专利文献与学术文献报告过减低NC膜的背景干扰的问题，但是他们绝大部分是采用以下两种方法处理采用先在NC膜固定生物大分子，然后用有机高分子物质(如PVP、PEG、PVP)与表面活性剂结合进行封闭处理。采用先在NC膜固定生物大分子，然后用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或者各种血清蛋白(如羊血清等)单独处理或者与表面活性剂相结合处理。NC膜经过上述几种方法处理后，使原本疏水的膜变得亲水，同时生物大分子在NC 膜上的吸附能力大大降低，但是NC膜经过以上一系列处理后，也带来了很多问题如因为表面活性剂的加入使原先固定在NC膜的蛋白质位置产生改变，蛋白质线出现弥散，原先固定在NC膜上的蛋白质量降低。其次由于NC膜在浸泡、干燥过程中发生一定的变化也使试条整个性能发生改变，再次对于试条生产工艺来说，这几种处理工艺非常麻烦，不利于生产工艺的放大。因此，目前一般试条生产厂家大都选择购买经封闭处理后的NC膜，在生产试条时不需要进行额外的NC膜封闭处理。但是这种处理一般只解决了 NC膜的亲水性能，NC膜吸附蛋白质的性能几乎没有发生改变，NC膜吸附蛋白质的能力还很强，膜上还存在大量蛋白质结合位点，因此很多试条生产厂家就在层析流动组分中加入BSA、表面活性剂进行再次封闭处理，以达到降低NC膜的检测背景，但是这种处理方法并不太理想。层析试条一般是由这几部分组成样品垫、NC膜、吸水垫。当样品垫中加入被检测物时，被检测物随着溶液的流动与免疫颗粒反应，然后随着液体的流动，免疫颗粒与固定在NC膜的抗原或者抗体再反应，没有反应的颗粒最后被吸水垫收集。大多数文献报道是在样品垫中加入BSA与表面活性剂以解决降低NC膜背景高的问题，如发明人张涛(专利号 01126931. 6，专利名“应用流动封闭技术的免疫金检测试剂盒”)报告了一种封闭处理技术，他是在样品垫中加入封闭剂(封闭剂配方是脱脂奶粉、BSA、PVP、吐温20)，当加入样品时，样品垫中的封闭剂释放出来，起到封闭效果。这种封闭处理方法确实解决了胶体金层析试条上NC膜的封闭问题，但是这种方法对于乳胶颗粒的层析试条来说是不能够封闭NC膜对乳胶颗粒的非特异性吸附问题，可能是因为乳胶颗粒疏水性比胶体金颗粒疏水性更强、 颗粒粒径更大，从而导致乳胶颗粒经常在NC膜前端出现“死金”现象，因此沿用胶体金封闭处理方法并不理想。需要找到更合适的封闭试剂组份及方法来解决这个问题。同时目前还未报道过试条长期存储后的封闭剂保护问题，因为封闭剂具有生物活性，容易失活；因此需要添加一些蛋白质保护剂，从而达到试条性能的长期保存。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种能够降低试条背景的免疫层析试条用封闭剂组合物以及一种背景较低的免疫层析试条。为了解决现有技术问题，本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨
醇单油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸醚。优选的，所述第一缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、氨基丁三醇-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液、丙二酸-氢氧化钠缓冲液、顺丁烯酸-氢氧化钠缓冲液，丁二酸-氢氧化钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，3- (N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液。优选的，所述酪蛋白处理液包括酪蛋白和第二缓冲溶液混合后的溶液经高压灭菌后得到的处理液。优选的，所述第二缓冲溶液为有机酸缓冲液。优选的，所述糖类为蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麦芽糖。优选的，所述蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂在所述缓冲溶液中的质量浓度比为 (0. 01 5) (0. 1 20) (0. 05 5)。优选的，所述缓冲溶液的离子浓度为0. 01-lmol/L、pH值为4 9。本发明还提供了一种免疫层析试条，包括塑料板；设置在所述塑料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所述硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。优选的，所述酪蛋白处理液包括酪蛋白和缓冲溶液混合后的溶液经高压灭菌后得到的处理液。本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。本发明提供的封闭剂组合物中使用了酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，这些蛋白具有很好的憎水性，相对于现有技术，能够在溶胶中更好的使用，在乳液中不会随溶液的流动而使蛋白溶于水中，牢固的固定在NC膜上，降低了由于使用环境而造成的背景升高。另外，本发明提供的组合物中，还包括蛋白保护剂，使组合物中的蛋白能够保持更长久的使用，提高了组合物的使用寿命。本发明提供了一种免疫层析试条，包括塑料板；设置在所述塑料板上的吸水垫； 设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所述硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、 甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。相比较现有技术，本发明提供的免疫层析试条样品垫中含有封闭剂，所述封闭剂包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类，使试条中反应位点不变化，封闭效果好，背景低，使用寿命长。


图1、本发明提供的免疫层析试条结构示意图。
具体实施例方式为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。相比较现有技术，本发明提供的蛋白为疏水性较好的蛋白，在乳液中能够牢固的在试条位点上起到封闭作用，不会随着水的流动而发生位点位置变化或位点增多，所述蛋白选用酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白，人血清白蛋白，优选为酪蛋白或酪蛋白处理液，最优选为酪蛋白处理液。所述酪蛋白处理液的制备方法为，将酪蛋白与PH为6 7的0. lmol/L的第二缓冲溶液混合，溶解，然后经高压灭菌处理得到酪蛋白处理液。按照本发明，所述蛋白在第一缓冲溶液中的质量浓度优选为0.01^-5%,更优选为0. 04 % -1 %， 最优选为0. 2%。所述第二缓冲溶液优选为甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH值优选为6. 5。按照本发明，为了使蛋白具有更长的使用寿命，使所述组合物在长时间放置后依然具有很好的封闭效果，以及较低背景，本发明提供的组合物中增加了蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为糖类，优选为蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麦芽糖。更优选为蔗糖、海藻糖、山梨醇。最优选为蔗糖。按照本发明，所述蛋白保护剂在第一缓冲溶液中的质量浓度优选为0. 1 % -20 %，更优选为0.5^-10%,最优选为5 %。糖类都是多羟基化合物，高浓度糖可以与蛋白质、酶类等物质在高温干燥过程形成玻璃态，从而使蛋白质活性得以保护。
按照本发明，所述组合物中还包括增加蛋白与乳液混合的表面活性剂和调节封闭剂组合物PH值的第一缓冲溶液。按照本发明，所述表面活性剂优选为非离子型表面活性剂，优选为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween20)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯 (Tween80)、聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton χ 100)或聚氧乙烯月桂酸醚(Brij 35)。更优选为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯或聚氧乙烯辛基苯基醚，最优选为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。在第一缓冲溶液中的质量浓度优选为0.05^-5%,更优选为0. 1 % -2 %，最优选为0.5%所述第一缓冲溶液优选为磷酸缓冲溶液、氨基丁三醇-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、 甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液、丙二酸-氢氧化钠缓冲液、顺丁烯酸-氢氧化钠缓冲液，丁二酸-氢氧化钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，3- (N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液。更优选为磷酸缓冲液，巴比妥钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，最优选择磷酸缓冲液。所述第一缓冲溶液的PH值在4-9之间，优选为 5-8之间，最优选为6. 5，离子强度为0. 005-lmol/L,优选为0. 05-0. 5mol/L,最优为0. Imol/ L，按照本发明，将所述蛋白与蛋白保护剂混合，将表面活性剂混合在第一缓冲溶液中，然后将蛋白与蛋白保护剂均勻混合在第一缓冲溶液中，得到封闭剂组合物。本发明提供的封闭剂组合物能够在试条样品垫中使用，也可以与乳胶颗粒混合使用，用于降低免疫层析的背景。按照本发明，将封闭剂加入样品垫中，然后将NC膜贴到塑料板上，然后到喷膜机上划线，喷膜后NC膜过夜干燥，第二天组装试条，试条按照样品垫、NC膜、吸水纸的顺序黏贴到塑料板上，最后到斩切机上把试条切成试条。本发明还提供了一种免疫层析试条，包括塑料板；设置在所述塑料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所述硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。按照本发明，如图1所示，所述免疫层析试条包括样品垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4、塑料板5，将样品溶液1加入试条上，5 10分钟后得到结果，T和C线均显色为阴性、 C显色而T不显色呈阳性。以下为具体实施例1、蛋白质封闭效果的比较颗粒标记实验首先对荧光乳胶颗粒经过EDC与NHS活性，然后颗粒与抗人血清白蛋白的单克隆抗体反应，经离心、洗脱后，把标记有抗体的颗粒悬浮在以下5种不同的蛋白质封闭液中1、空白组，2、0. 5%明胶的封闭液；3、0. 5% B SA的封闭液；4、0. 5%酪蛋白的封闭液；5、0. 5%脱脂奶粉的封闭液；6、酪蛋白处理液；7、1%甲基化牛血清白蛋白。酪蛋白处理液的配制方法首先配制pH值=6. 5的0. lmol/1的甘氨酸-盐酸缓冲液，然后把酪蛋白溶解在该缓冲液中，最后经高压灭菌处理得到酪蛋白处理液。试条制作先将NC膜贴到塑料板上，然后到喷膜机上划线，喷膜后NC膜过夜干燥， 第二天组装试条，试条按照样品垫、NC膜、吸水纸的顺序黏贴到塑料板上，最后到斩切机上把试条切成4mm宽的试条。
试条检测试条分为7组，每组又分成2份，一份是阴性样本(本检测项目是尿微量白蛋白，cutoff值是20mg/l，阴性样本的白蛋白浓度是5mg/l.)；另一份是阳性样本(即白蛋白浓度为25mg/l).每组40根试条，阳性样本20根，阴性样本20根。试条检测时，先将储存在不同蛋白质封闭液中的颗粒溶液与阳性或者阴性样本按照10 1的比例混合，即最终颗粒固含浓度为0.05%。然后加入到样品垫中，每根试条溶液加入量为SOul。实验测试结果如下
[004权利要求
1.一种免疫层析试条用封闭剂组合物，其特征在于，包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸醚。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、氨基丁三醇-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液、丙二酸-氢氧化钠缓冲液、顺丁烯酸-氢氧化钠缓冲液，丁二酸-氢氧化钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，3- (N-吗啉基)丙磺酸缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述酪蛋白处理液包括酪蛋白和第二缓冲溶液混合后的溶液经高压灭菌后得到的处理液。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述第二缓冲溶液为有机酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述糖类为蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麦芽糖。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂在所述缓冲溶液中的质量浓度比为(0. 01 5) (0.1 20) (0.05 5)。
8.根据权利要求1、3、5任意一条所述的组合物，其特征在于，所述缓冲溶液的离子浓度为 0. 01-lmol/L、pH 值为 4 9。
9.一种免疫层析试条，其特征在于，包括塑料板；设置在所述塑料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所述硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。
10.根据权利要求9所述的免疫层析试条，其特征在于，所述酪蛋白处理液包括酪蛋白和缓冲溶液混合后的溶液经高压灭菌后得到的处理液。
全文摘要
本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。本发明提供的封闭剂组合物能够有效降低免疫层析试条的背景、使用寿命长，检测灵敏度高。本发明还提供了一种免疫层析试条。
文档编号G01N33/558GK102426231SQ20111027293
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者聂海龙 申请人:长沙三诺生物传感技术股份有限公司