专利名称：一种酶标记免疫电化学检测方法
技术领域：
本发明属电化学和临床化学分析领域，涉及一种酶标记免疫电化学检测方法，具体涉及一种检测过氧化物酶及其底物反应系统的电化学方法背景技术1971年Engvall等建立了酶联免疫吸附分析(ELISA)技术，用于检测生物标本中的抗体或抗原。利用过氧化物酶(HRP)作为标记物的ELISA的基本原理是，将HRP与抗体或抗原交联，得到酶结合物，它与待测物中的抗原或抗体结合，分离并弃除游离的酶结合物后，加入HRP的底物，经化学反应，形成有色的产物，用酸中止反应后，经光度计在一定波长下比色，根据吸光度的高低，与标准比较，计算待测物的量。上述技术后经不断改进和完善，现在已成为一项广泛应用的光学免疫测定技术。

发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、稳定、结构简单、低消耗、适于自动化的酶标记免疫电化学检测方法。具体涉及一种检测过氧化物酶及其底物反应系统的电化学方法。
已知技术酶标记免疫原理，HRP作用于底物的反应过程是，
式中H2O2可以是过氧化氢，也可以是过氧化氢尿素、sodiumperborate等；AH2则是一类供氢体的通式，如邻苯二胺、四甲基联苯胺、5-氨基水杨酸、邻联苯甲胺、ABTS等。
本发明利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。
本发明所述磁性微球(珠)为通用的磁珠试剂，所述底物为四甲基联苯胺(TMB)，参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂电极；电化学分析仪为上海辰华仪器公司生产的CHI 830电化学分析仪，使用3电极系统。测量时，反应液加在反应池内，参比电极和对电极插入液面下，分别连接至电化学分析仪，进行检测。
所述的反应池即电解池，采用聚苯乙烯材质制备，底部为矩形金片金电极1，经导线联至池外，是为工作电极2，反应池底面粘固铁片3，磁铁4可在需要时吸附其上，而无须另行固定。
本发明电化学检测法借助于磁性微珠将过氧化物酶(HRP)-过氧化氢(H2O2)-供氢体(H2A)反应体系浓聚于裸电极表面进行电化学检测。具有如下优点结构简单，无需光学检测系统；裸电极从理论上无使用寿命限制；检测成本可明显降低；适于检测自动化；结合微电子和微电极技术，有广阔的应用前景。


图1.电解池结构示意图，其中，1金电极，2工作电极，3铁片，4磁铁。
图2.差分脉冲伏安法扫描图其中，a、b、c、d为标准品标号。
图3.循环伏安法扫描图其中，a、b、c、d为标准品标号。
具体实施例方式
实施例1 磁珠分离的ELISA在裸电极表面的电化学测定采用瑞士ROCHE公司的“Enzymum-TestCA 72-4”试剂盒(内附标准品，由低到高共4瓶，标号分别为a、b、c、d)和“Elecsys”试剂盒中通用的磁珠(包被有链霉亲和素)试剂，和上海科华实业有限公司的肝炎标志物检测试剂盒中底物(“SUBSTRATE A”和“SUBSTRATE B”，临用前等量混合后应用)。
电化学分析仪为上海辰华仪器公司生产的CHI 830电化学分析仪，使用3电极系统。
测量时，反应液加在反应池内，参比电极和对电极插入液面下约2mm，分别连接至电化学分析仪。
参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂丝电极；电解池采用材质为厚约1mm的聚苯乙烯，底部为约0.2mm厚的矩形金片，经导线联至池外，为工作电极，反应池底下面粘固一铁片，柱形磁铁在需要时吸附其上，而无须另行固定。
取酶结合物工作液 0.700ml标准品 0.035ml磁珠悬液 0.100ml混匀，室温下反应60分钟，其间混匀1-2次。
将试管置于磁性板上，使磁珠沉积，倾去上清液，并用吸水纸吸去管口残余液滴，用含0.05％TWEEN 20的生理盐水同法洗涤磁珠5次，后用生理盐水悬浮。
用滴管将悬浮的磁珠移入电解池，将柱形磁铁置于电解池下，使磁珠沉积，吸弃生理盐水，加入底物应用液0.500ml，立即将参比电极和对电极插入液面，开始扫描测定。
测试所用的标准品浓度是a.2.1U/ml；b.20.3U/ml；c.51.8U/ml；d.94.9U/ml。用差分脉冲伏安法和循环伏安法均可明确加以检测和区分。
实验结果表明，本发明方法能实现磁珠分离的ELISA在裸电极表面的电化学测定。
权利要求
1.一种酶标记免疫电化学检测方法，其特征是利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。
2.根据权利要求1所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的方法包括下述步骤，1)取酶结合物工作液，标准品，磁珠悬液置试管，混匀，室温下反应60分钟，2)将试管置于磁性板上，使磁珠沉积，去上清，用含0.05％TWEEN20的生理盐水洗涤磁珠，后用生理盐水悬浮，3)将悬浮的磁珠移入电解池，将柱形磁铁置于电解池下，使磁珠沉积，吸弃生理盐水，加入底物应用液，参比电极和对电极插入液面，分别连接至电化学分析仪，扫描测定。
3.根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的所述磁性微球(珠)为通用的磁珠试剂。
4.根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的底物为四甲基联苯胺。
5.根据权利要求1或2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为铂电极。
6.根据权利要求2所述的酶标记免疫电化学检测方法，其特征是所述的电解池采用聚苯乙烯材质制备，底部为矩形金片金电极，经导线联至池外，为工作电极，池底面粘固铁片，磁铁可吸附其上，无须另行固定。
全文摘要
本发明属电化学和临床化学分析领域，涉及一种酶标记免疫电化学检测方法，本发明利用磁性微球(珠)分离酶标记免疫反应结合物，在裸电极表面作用于酶的底物，测定电极表面电位或电流的改变，实现生物大分子物质或半抗原的定性与定量分析。本发明具有如下优点结构简单，无需光学检测系统；裸电极从理论上无使用寿命限制；检测成本可明显降低；适于检测自动化；结合微电子和微电极技术，有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/544GK1588071SQ20041005380
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月16日 优先权日2004年8月16日
发明者于方治 申请人:上海市胸科医院