专利名称：一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法
技术领域：
本发明属于药物提取技术领域，尤其涉及一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法。
背景技术：
“肿瘤干细胞”假说是近年来提出的一种新理论，该假说认为只有很小一部分细胞具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性和恶性表型的能力。CSCs是肿瘤的起源，它决定肿瘤的发生、发展与转移，是肿瘤临床治疗中最重要的靶细胞。因此，彻底地根除恶性肿瘤需要首先消灭CSCs。总之，CSCs理论为肿瘤的药物防治研究提供了新的途径和思路。因此，靶向CSCs的新型治疗药物的研究具有重大科学意义和潜在临床应用价值。蔓荆子是用蔓荆植物(马鞭草科)果实制备的一种传统中药，亦作为民间药物使用，被认为是一种抗炎剂，在中国四川等地用于某些癌症的治疗。据报道称，蔓荆子粗提物以及活性成分紫花牡荆素能抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长。一些饮食黄酮类化合物，比如姜黄素、槲皮素与表没食子儿茶素没食子酸盐和金雀异黄素等被发现可抑制CSCs自我更新。

发明内容
本发明提供了一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，旨在从蔓荆子中提取具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用的总黄 酮。本发明的目的在于提供一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，该方法包括以下步骤步骤一，将蔓荆子粉碎成粗粉，60°C于干燥箱干燥lh，用80%乙醇提取，75°C回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I ;步骤二，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH = 3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH = 7的80%乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II;步骤三，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH = 3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH = 7的80%乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏III ；步骤四，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮。进一步，在步骤一中，用80%乙醇提取时，用量为1: 5kg/L。进一步，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末。进一步，鉴别总黄酮的方法为取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液；取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μ 1，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇(3 2 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。进一步，总黄酮含量的检测方法为称取15. Omg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取O. 2、0. 4、0. 8、1. O、1. 2ml稀释至 10ml，即成浓度分别为 3. 00,6. 00、12. 00、15. 00、18. 00ug/ml 的溶液；用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；取提取物11. Omg,用无水甲醇配制成50ml,取1. Oml,稀释至IOml,用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得。进一步，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。本发明提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法，将蔓荆子粉碎成粗粉，用80%乙醇提取，合并提取液，减压浓缩得浸膏I;将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用pH = 7的80%乙醇洗脱至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏II ;将浸膏II分散于水中，超声溶解，将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用PH = 7的80%乙醇洗脱，至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏III ;将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末，且具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用，效果明显，具有较强的推广与应用价值。


图1是本发明实施例提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法的实现流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。图1示出了本发明实施例提供的从蔓荆子中提取总黄酮的方法的实现流程。该方法包括以下步骤步骤S101，将蔓荆子粉碎成粗粉，60°C于干燥箱干燥lh，用80%乙醇提取，75°C回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I ;步骤S102，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH = 3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH = 7的80%乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II ；步骤S103，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH = 3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH = 7的80%乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏III ；
步骤S104，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮。在本发明实施例中，在步骤SlOl中，用80%乙醇提取时，用量为1: 5kg/L。在本发明实施例中，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末。在本发明实施例中，鉴别总黄酮的方法为取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液；取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μ 1，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇(3 2 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。在本发明实施例中，总黄酮含量的检测方法为称取15. Omg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取O. 2、0. 4、0. 8、1. O、1. 2ml稀释至 10ml，即成浓度分别为 3. 00,6. 00、12. 00、15. 00、18. 00ug/ml 的溶液；用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线；取提取物11. Omg,用无水甲醇配制成50ml,取1. Oml,稀释至IOml,用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得。

在本发明实施例中，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。制法取蔓荆子，粉碎成粗粉，60°C于干燥箱干燥Ih;80%乙醇提取I 5 (kg/L)，75°C回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I ;将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH = 3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min,至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点(黄酮类化合物基本吸附完全)。再用80%乙醇(pH = 7)洗脱至流出液无黄酮(方法同上)。流分合并，减压浓缩，得浸膏II ;将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH = 3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点。再用80%乙醇(PH = 7)洗脱，至流出液无黄酮(方法同上)。合并流分，减压浓缩，得浸膏III ;将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得蔓荆子总黄酮。性状本品棕褐色粉末。鉴别取本品5mg，用甲醇2ml溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(参照药典第一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5μ 1，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇(3 2 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。含量检测总黄酮1、芦丁标准曲线的建立称取15. Omg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml。分别取O. 2，O. 4，O. 8，1. 0，1. 2ml稀释至IOml,即成浓度分别为3. 00，6. 00，12. 00，15. 00，18. 00ug/ml的溶液。用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。2、测定法取提取物11. Omg,用无水甲醇配制成50ml。取1. Oml,稀释至10ml。用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算，即得。本品按干燥品计算，含总黄酮量以芦丁计，不得少于45%。1.蔓荆子总黄酮EFTF抑制鼻咽癌干细胞SP18细胞株细胞生长作用研究平皿克隆形成法人鼻咽癌干细胞SP18细胞株由中山大学肿瘤研究所建株[1°]和惠赠。用含10%小牛血清RPMI1640培养液，置37°C，5% CO2培养箱培养，常规传代，取对数生长期细胞进行实验。体外培养人鼻咽癌干细胞细胞系SP18细胞，制备单细胞悬液，调节浓度为500个/mL。每处理组的培养体系为单细胞悬液(500个/孔)1. OmL，加入不同浓度的蔓荆子总黄酮EFTF，每种药物的终浓度分别为1. O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5. 0 μ g/mL、10. Ομ g/mL，实验设空白对照组(加入等量培养基)和溶媒对照组(加入含等量O.1 % DMSO的培养基)，每组设3个孔，接种于24孔板中，倒置显微镜下观察单细胞分散程度，置CO2培养箱中培养8天。待克隆形成，且没有融合前，每孔加入甲醇O. 5mL,固定15min，吉姆萨染色10-30min。以细胞数大于50个或直径大于75 μ m为一个克隆，倒置显微镜下计数每孔克隆数。按下式计算细胞克隆形 成抑制率。克隆形成抑制率(％) = [1_(处理组集落均数/空白对照组集落均数)]X 100 %。表1-1 EFTF对人鼻咽癌干细胞SP18细胞平皿克隆形成能力的影响(η = 3，Mean土SD)
权利要求
1.一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一，将蔓荆子粉碎成粗粉，60°c于干燥箱干燥lh，用80%乙醇提取，75°C回流提取3h/次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏I ; 步骤二，将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，浓度为3mg/ml，pH = 3，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用pH = 7的80%乙醇洗脱至流出液无黄酮，流分合并，减压浓缩，得浸膏II; 步骤三，将浸膏II分散于水中，超声溶解，浓度为3mg/ml，pH = 3，再次将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，流速2ml/min，至流出液在GF254硅胶板上点样，紫外灯254nm下无斑点，再用PH = 7的80%乙醇洗脱，至流出液无黄酮，合并流分，减压浓缩，得浸膏 III; 步骤四，将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤一中，用80%乙醇提取时，用量为1 ； 5kg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，鉴别总黄酮的方法为 取总黄酮5mg，用甲醇2ml溶解，滤过所得滤液作为供试品溶液； 取紫花牡荆素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液； 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μ 1，分别点于同一用I %氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇酯-甲醇(3 2 O. 2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝乙醇溶液； 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，总黄酮含量的检测方法为 称取15. Omg芦丁对照品，用甲醇配制成100ml，分别取O. 2、0. 4、0. 8、1. O、1. 2ml稀释至10ml，即成浓度分别为 3. 00,6. 00、12. 00、15. 00、18. 00ug/ml 的溶液； 用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线； 取提取物11. Omg,用无水甲醇配制成50ml,取1. Oml,稀释至IOml,用紫外分光光度计在258nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算即得。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法从蔓荆子中提取的总黄酮具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用。
全文摘要
本发明公开了一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法，将蔓荆子粉碎成粗粉，用80％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩得浸膏I；将浸膏I分散于水中，超声溶解后加冷水稀释，将溶液过孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用pH＝7的80％乙醇洗脱至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏II；将浸膏II分散于水中，超声溶解，将配好的此溶液经大孔吸附树脂柱(AB-8)上样，再用PH＝7的80％乙醇洗脱，至流出液无黄酮，减压浓缩得浸膏III；将浸膏III搅拌均匀，减压真空干燥，碾磨成粉末，得到蔓荆子总黄酮；该方法从蔓荆子中提取的总黄酮为棕褐色粉末，且具有靶向抑制肿瘤干细胞特性作用具有较强的推广与应用价值。
文档编号G01N30/90GK103055048SQ20121059114
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月22日 优先权日2012年12月22日
发明者曹建国, 曹晓诚, 盛习锋 申请人:湖南师范大学