专利名称：可观测带荧光生物样品的非损伤微测系统的制作方法
技术领域：
本发明属于电化学技术领域，具体涉及一种改进的可检测离子/分子转运流 速和方向的光学电生理学系统，应用本发明可以观测细胞的电生理情况。
背景技术：
物质在液体环境中有从高浓度到低浓度扩散的趋势。对于带电粒子而言， 还有从高电化学电势到低电化学电势运动的趋势。
非损伤微测系统的核心是选择性离子/分子微电极，以下称离子/分子选择
电极，是由KUhtreiber和Jaffe在1990年设计的一套由计算机控制的自动定位 测量系统演变发展而成(Ktihtreiber和Jaffe在J. Cell Biol 1990， 110: 1565-1573)。离子选择电极是配合扫描离子选择电极技术(Scanning IonSelective Electrode Technique: SIET)以不接触被测材料的非损伤方式测量进出被测材料 的离子运动速率和方向。金属电极(用于测量02和11202)和碳丝电极(用于 领!l NO等)是配合扫描极谱电极技术(Scanning Polarographic Electrode Technique:SPET )以非损伤的方式测量分子进出被测材料的速率和方向。 Kochian等人在原有的<^2+选择电极的基础上，又相继开发出了lT， K+， Al3+ 和Cc^+离子选择性电极，并将其应用于玉米根和植物毒理学的研究，并为这些 电极在动物研究中的应用开辟了道路(Kochian等在Planta 1992， 188:601-610; Degenhardt等在Plant Physiology 1998， 117: 19-27; Huang等在Plant Physiology 1992， 98:230-237)。随着离子/分子选择电极种类的不断增多以及电 子线路技术和计算机硬件软件的逐步完善，非损伤微测系统逐渐被广泛应用到 基础生物学、生理学、神经生物学以及金属腐蚀研究等诸多领域。例如，选择 性微电极能用于直接并灵敏地观察植物体对矿质元素的需求，研究者可利用选 择性微电极对具有某种离子吸收特性的植物品种进行筛选，还可制定出与植物 需求相适应的环境营养水平；能及时准确地探测到的光、温、水涝、盐分引起 的植物体离子或分子信息的微小变化，成为预测植物受到逆境胁迫最直观、最 灵敏的生理指标测定方法之一；超灵敏的选择性微电极可以应用于信号传递过 程中有关离子或分子微量变化的信号探测，还可用于基因组后期研究所面临的 那些未知的或者人工表达的蛋白质功能的研究鉴定等。此外，许越等应用非损 伤微测技术采用双电极同时测量*和02，在此基础上，发现氢离子的外流和
氧分子的内流是引起碱化区的主要原因(Yue Xu等在Journal of Integrative Plant Biology 2006， 48 (7): l-5)。
但是，现有非损伤微测系统的光学成像系统无法观察生物样品发出的荧光。 该光学成像系统主要应用的是普通光学显微镜，只能观测到明场光源下样品可 见光全波段的混合光学信号，不能选择性地观测特定波长的生物荧光。然而目 前细胞及分子生物学研究中生物荧光技术，尤其是荧光染色和标记有荧光蛋白 融合基因的转基因技术应用广泛，是用于分析生物样品成分结构分布状态、转 基因状态，蛋白表达程度和蛋白定位等的有力手段。生物材料表面的离子/分子 流速方向与这些生物信息联系密切，通过对生物荧光的观察获得的信息，是研 究生物材料表面的离子/分子流速方向数据所需要的重要参考。目前尚未见结合 荧光成像技术的非损伤微测系统，这严重限制了非损伤微测系统在生物电生理 学领域中的发展。
以上问题虽然可以通过将样品在荧光显微镜下观察后再移动到非损伤系统 上进行检测而部分解决。但由于非损伤微测的微检测特性，移动后难以再次定 位到样品原发监测位置，且这种方法无法实现荧光观测和检测同步，所得的荧 光图像数据和微测数据间的相关性差，不能完全满足研究的需要。
另外，现有的非损伤微测系统对小个体生物样品(如酵母细胞)固定方法 存在不足，且不能移动样品。在浸没条件下检测，样品的固定至关重要。现有 的小个体生物样品固定方法主要是通过多聚赖氨酸处理监测容器底面或用低熔 点凝胶包裹样品。这两种方法都只能将样品固定在测量容器底面，因而带来三
个问题
1. 对电极移动操作要求高，操作不慎则电极触底损坏；
2. 信号噪音大，在检测液表面和容器底面附近检测到的信号噪音比在溶液 中检测得到的信号噪音强；
3. 样品的检测位置受限，被包埋或固定的部分电极无法检测到。 更重要的是现有的固定方法不能移动样品位置。

发明内容
为了克服现有非损伤微测系统的光学成像系统无法观察生物样品发出的荧 光的不足，本发明在现有非损伤微测系统的基础上，改进了光学成像系统，使 非损伤微测系统在测量生物材料表面离子/分子流速方向的同时，可观察生物样 品发出的荧光，以实现对被测生物材料进行筛选和状态监测的目的。
本发明解决此技术问题所米用的技术方案是 一种可观测带荧光生物样品 的非损伤微测系统，包括离子/分子活性检测系统、显微成像系统和计算机数据 处理系统，其中，显微成像系统包括明场照明器、载物台、物镜、物镜转换器、 光路切换器、目镜和数码相机，其特征在于显微成像系统中在连接物镜与光路 切换器的光路之间安装有荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器，该滤光片转 盘转换器含有激发滤光片、荧光分色镜和阻挡滤光片，荧光照明器发出的激发 光通过该滤光片转盘转换器中的激发滤光片到达荧光分色镜并反射到物镜，通 过物镜后投射到样品上，从样品激发出的荧光通过物镜和荧光分色镜后，再经 阻挡滤光片选择特定波段的荧光通过，然后经光路切换器后，到达目镜或数码 相机，从而实现将荧光显微观测模式所需部件整合入非损伤微测系统。
以下详细说明本发明的系统组成及结构关系。
上面所述的可观测带荧光生物样品的非损伤微测系统，其显微成像系统包 括明场照明器、荧光照明器、载物台、物镜、物镜转换器、荧光显微观测模式 用滤光片转盘转换器、目镜和数码相机组成，滤光片转盘转换器安装有激发滤 光片、荧光分色镜和阻挡滤光片。该显微成像系统通过光路控制实现明场显微 观测模式和荧光显微观测模式之间的切换。明场显微观测模式工作时，切断荧 光照明器提供的激发光光路，由明场照明器提供光源投射于载物台中心的样品 上，光路通过物镜转换器中的物镜，经过光路切换器后，进入目镜或数码相机。 荧光显微观测模式工作时，切断明场照明器提供的明场光路，由荧光照明器提 供激发光光源，荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器将激发滤光片、荧光分 色镜和阻挡滤光片组合切换入光路，激发滤光片控制激发光的波长范围，荧光 分色镜将激发光反射入物镜转换器中的物镜，投射于样品上，样品中的荧光基 团经激发发射出荧光，荧光经过物镜到达荧光分色镜，荧光分色镜让荧光透射 穿过后，经过阻挡滤光片，阻挡滤光片的作用在于控制穿过阻挡滤光片荧光的 波长范围，之后经过光路切换器后，进入目镜或数码相机。可观测和成像的荧 光信号范围由滤光片组中激发滤光片、荧光分色镜和阻挡滤光片的波长选择范 围共同决定，观察不同的生物荧光须使用相应波段的荧光滤光片组。
显微成像系统中数码像机与计算机数据处理系统连接。在整个非损伤测量 过程中可通过显微成像系统对图像数据进行实时监控、捕捉和储存。其中图像 数据包括明场模式下被测生物材料和离子/分子选择电极的图像信息以及荧光 模式下生物材料的荧光图像信息。
上面所述的离子/分子活性检测系统包括离子/分子活性检测单元、电极三 维移动系统、离子/分子活性信号放大系统。离子/分子活性检测单元包括检测
容器、液体介质、被测材料、参比电极及离子/分子选择电极。检测容器放置在 显微成像系统的载物台上，被测材料、参比电极以及离子/分子选择电极置于检 测容器中的液体介质中。离子/分子选择电极安装于电极三维移动系统上，电极 信号线与检测信号放大系统连接，参比电极接地。测量时调整载物台使被测材 料置于光路中观测视野内，离子/分子电极要求近距离测量被测材料，最好距被
测材料5-35微米。计算机数据处理系统通过三维移动系统的控制部分操作三维 步进电机对离子/分子选择电极的三维位置进行调整，离子/分子选择电极三维 位置的调整也可以手动实现。三维移动系统固定在显微成像系统载物台的一侧。 离子/分子活性信号放大系统包括前置放大器和差分放大器，离子/分子检测信 号由离子/分子选择电极输入到前置放大器，经与之连接的差分放大器处理后输 出到计算机数据处理系统。
所述计算机数据处理系统包括数据处理软件和计算机平台。在计算机的支 持下，数据处理软件可接受来自显微成像系统的图像数据和来自检测信号放大 器的离子/分子检测信号，并实现两类信号的采集、整合、显示和储存。计算机 系统通过并行接口与电极三维移动系统连接，可采用编程的方式实现离子/分子 选择电极的三维移动，以便实时、动态地对被测材料进行测量。
本发明的有益效果是，将非损伤微测系统和荧光显微装置有机结合，可选 择性地观测特定波长的生物样品发出的荧光，荧光观测成像与离子/分子活性检
测同步。可通过荧光观测对带有荧光的生物样品进行鉴别；配合荧光蛋白融合 技术，可研究特定蛋白在材料中的表达、分布等与材料表面离子/分子流速方向 的关系；保持原有非损伤微测技术在生物学应用中十分重要的非损伤性；所采 用的荧光观测技术不对生物材料造成损伤，也不对所研究的生物学反应过程产 生影响。
在上述技术方案的基础上，为了克服该技术方案对样品尤其是对于小个体 生物样品(如酵母细胞)能固定而不能移动的不足，在样品固定方式上加入了 光钳技术的改进，使荧光非损伤微测系统在识别生物样品荧光信号实现材料选 择的基础上，能对小个体的特定样品完成分选，进行固定或精确移动。
进一步的改进方案是所述的可观测带荧光生物样品的非损伤微测系统， 在显微成像系统中在连接物镜与荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器的光路 之间安装有光钳工作模式用滤光片转盘转换器，滤光片转盘转换器含有光钳分 色镜，激光发射器发射的激光经过光学耦合器到达光钳工作模式用滤光片转盘 转换器中的光钳分色镜并反射到物镜，通过物镜后聚焦在样品池中形成光阱， 从而实现将光钳工作模式所需部件整合入非损伤微测系统。
上述技术方案的光钳系统包括激光器(激光发射器)、扩束光路(光学耦合 器)、光钳分色镜和高倍物镜。由激光器发射的激光束，通过光学耦合光路扩束 整形，光钳分色镜将长波长的激光反射入物镜转换器中的物镜，激光经过物镜 聚焦在样品池中形成光阱。装有生物微粒或悬浮细胞液的检测容器置于载物台 上。容器中的微粒可被光阱捕获并被操控精确移动。其中高倍物镜为100倍物 镜，用于汇聚光钳激光。光钳控制的材料微粒的大小由光钳力的大小决定，最 大为微米级。光钳力的大小为皮牛级，由激光强度决定。
针对进一步改进后的本发明，其有益效果是将非损伤微测系统和光钳装置 有机结合，可选择性地将小个体生物样品悬浮固定于噪音较小的检测液中间或 将其精确移动到特定检测位置。光钳操作与荧光观测成像、离子/分子活性检测 同步，可通过荧光观测对带有荧光的生物样品进行分选，继续保持原有非损伤 微测技术在生物学应用中十分重要的非损伤性，所采用的光钳技术未见对生物 材料造成损伤。
需要说明的是在现有非损伤微测系统的基础上，显微成像系统中在连接物 镜与光路切换器的光路之间只安装有光钳工作模式用滤光片转盘转换器，滤光 片转盘转换器含有光钳分色镜，激光发射器发射的激光经过光学耦合器到达光 钳工作模式用滤光片转盘转换器中的光钳分色镜并反射到物镜，通过物镜后聚 焦在样品池中形成光阱，从而实现将光钳工作模式所需部件整合入现有非损伤 微测系统，这样对现有非损伤微测系统的改进方案也有重要的应用价值。


图l是本发明的系统组成示意图，图中l-l为明场照明器，l-2为荧光照 明器，1_3、 l-4为滤光片转盘转换器，l-5为激发滤光片，l-6为荧光分色镜， l-7为阻挡滤光片，l-8为物镜转换器，l-9为物镜，l-10为光路切换器，1-11 为目镜，l-12为CCD数码相机，2-l为激光发射器，2-2为光学耦合器，2-3为 光钳分色镜，3-1为检测容器，3-2为测试液，3-3为样品，3-4为参比电极，3-5 为离子/分子选择微电极，3-6为前置放大器，3-7为差分放大器，4-l为计算机 系统，4-2为数据处理软件，5-1为电极三维移动系统，5-5为载物台二维移动 系统，5-2、 5-3、 5-4为电极三维移动系统5-l的三个步进电机，5-6、 5-7为载 物台二维移动系统5-5的两个步进电机，0-l为载物台，0-2、 0-3为扩展平台， 0-4、 0-5为多向节，0-6为参比电极支架。
图2是应用本发明对带有GFP标记的转基因拟南芥的根毛表面氢流的检测 结果。A:转基因拟南芥根部荧光图像，绿色表示外源基因表达位置；B:转基
因拟南芥根部明视场图像，示电极检测位置；C:转基因拟南芥根毛尖部在不 同离子处理下的氢电极测量数据，正值表示外流，负值表示内流，所示数据为 三次重复。
图3是应用本发明对带有GFP标记的转基因烟草悬浮细胞表面氢流的检测 结果。A:转35S-Mc/i r基因BY-2悬浮细胞荧光图像，绿色表示外源基因表达 位置；B:转35S-M:/i r基因BY-2悬浮细胞明视场图像，示电极检测位置(1， 近核)；C:转35S-Mv/及r基因BY-2悬浮细胞和野生型(WT)在缺铁(-Fe) 和加铁(+Fe， FeS04 7H20 27.8mg/L)处理下的氢电极测量数据;正值表示外 流，负值表示内流；l表示近核，2表示远核，所示数据为三次重复。
图4是应用本发明对带有GFP标记的转基因酵母的光钳移动和表面氢流的 检测结果。A、 B、 C:通过GFP荧光鉴别转化的酵母，并用光钳移动酵母细胞。 A-l， B-l， C-l表示光钳操纵酵母细胞到指定位置的过程的明场图像；A-2， B-2， C-2分别是A-1， B-l， C-l的局部放大图;A-3， B-3， C-3分别是A-2, B-2， C-2的荧光图像，示捕获的带有荧光的转基因酵母细胞。D:100倍油镜下 选择性氢电极对酵母细胞氢离子流速的检测的明场图像。El、 E2:不同铁浓度 下氢电极测试酵母细胞氢离子流速变化经过软件分析的数据结果，白点表示转 Mx/W7iC^P基因酵母氢流数据，黑点表示转空质粒酵母的氢流数据。
具体实施例方式
实例一可观测、分选带荧光生物样品的非损伤微测系统
图1所示实施例为结合有荧光装置和光钳装置的非损伤微测系统，可用于 对转化带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的生物样品迸行荧光识别和对酵母细胞 进行光钳固定和移动。
其中明场照明器l-l、荧光照明器l-2、载物台0-l、物镜转换器l-8、滤光 片转盘转换器1-3、滤光片转盘转换器1-4、目镜1-11等结构由倒置荧光显微镜 商业产品生产厂家提供。物镜转换器1-8中安装有100倍物镜用以汇聚光钳激 光光束。滤光片转盘转换器1-3中安装有:激发滤色片1-5波长为450-490纳米， 限制激发光波长于此范围之内，荧光分色镜1-6波长为505纳米，能反射激发 光透射荧光，阻挡滤色片l-7波长为520纳米带通型滤色片，用于特异性地接 收GFP的荧光信号。数码相机1-12通过端口与显微镜连接，光路切换器1-10 用于控制光路到达目镜或者数码相机。数码相机1-12数据线与计算机系统4-1 的图像捕捉卡串口连接。
倒置荧光显微镜载物台0-1左侧通过扩展平台0-2固定参比电极支架0-6， 参比电极3-4通过多向节0-4固定在参比电极支架0-6上，参比电极3-4接地。 载物台0-1的右侧通过扩展平台0-3安装电极三维移动系统5-1和载物台二维移 动系统5-5，离子/分子选择电极3-5连同前置放大器3-6通过多向节0-5固定在 电极三维移动系统5-l的支臂上。三个步进电机5-2\5-3\5-4按三维的方向为电 极三维移动系统提供移动能力，进而调节电极位置。前置放大器3-6和步进电 机5-2\5-3\5-4接地，减少信号噪音。离子/分子选择电极信号通过前置放大器 3-6送入差分放大器3-7，再送到计算机系统4-1 。
固定光学耦合器2-2于激光发射器2-1的光路上，滤光片转盘转换器1-4 中安装光钳分色镜2-3。安装步进电机5-6\5-7于载物台二维移动系统5-5上， 控制载物台移动亦即控制光钳移动。
控制信号线由计算机系统4-l分别连到步进电机5-2\5-3\5-4\5-6\5-7，传递 移动指令，控制步进电机的运动。
数据处理软件安装于计算机内，接收来自数码相机1-12的图像数据和来自 差分放大器3-7的离子/分子检测数据，通过对话窗展示数据图表与图像信息， 并接收操作者的指令。
实施例二应用本发明于转基因植物材料的检测
1. 转基因植物材料
GFP融合蛋白转基因拟南芥萌发5天的幼苗
2. 通过荧光显微镜对材料进行筛选和图像捕捉
在明场下用10倍镜或40倍镜下观察到清晰转基因植物的根、根尖、和根 毛。再转为蓝色激发光激发样品，观察和捕获具有绿色荧光表达的转基因材料。 最后使用软件抓拍图像。
3. 非损伤微测
包括玻璃电极拉制、分子/离子电极缓冲液灌制、LIX充制、离子/分子电 极银丝氯化、分子/离子电极静态校正以及实验样品的检测。实验检测的部位 根毛区(如图2)。
4. 数据的统计、分析和图像处理
利用非损伤微测系统专用数据处理软件MageFlux进行数据处理，以及 Photoshop软件进行图片着色。
实施例三本发明用于转基因烟草悬浮细胞的检测
1. 转基因烟草悬浮细胞的培养与固定
将经过抗性筛选的转基因烟草悬浮细胞每周用无菌改良MS液体培养基按 1:10的比例继代一次，继代后3-4天可用于检测。改良MS培养基为新添加了 KH2PO430mg/L、 2， 4-D0.6mg/L、 VBl 0.5mg/L的MS培养基。测试时，使用 1%低熔点胶固定转基因烟草悬浮细胞于测试容器中。
2. 通过荧光显微镜对材料进行筛选和图像捕捉
在明场下用10倍镜或40倍镜下观察到清晰转基因烟草悬浮细胞。再转为 蓝色激发光激发样品，观察表达绿色荧光的转基因烟草悬浮细胞作为捕获对象。 最后使用软件抓拍图像。
3. 非损伤微测
包括玻璃电极拉制、分子/离子电极缓冲液灌制、LIX充制、离子/分子电 极银丝氯化、分子/离子电极静态校正以及实验样品的检测。实验检测的部位 远离细胞核的部位以及靠近细胞核的部位(如图3所示1， 2两位点)。
4. 数据的统计、分析和图像处理
利用非损伤微测系统专用数据处理软件MageFlux进行数据处理，以及 Photoshop软件进行图片着色。
实施例四本发明用于转基因酵母的检测
(1) 酵母材料选用转pYES2.0Mjc/i r-GF户基因的酵母(^ccAaramycas Cere由'ae)为实验材料。
(2) 样品制备
酵母细胞在以半乳糖为碳源的SC液体培养基中28"C诱导过夜，使菌体达 到对数生长期。在2ml的1/8SC培养基加入5ul菌液，移液器轻轻吹打，是酵 母细胞悬浮于培养皿中。
(3) 光钳捕获酵母
在明场下用100倍油镜观察到清晰酵母细胞后，转为蓝色荧光激发，观察 表达绿色荧光的酵母细胞作为捕获对象。用光钳捕获单个上述酵母细胞，固定 到合适位置。重复上述捕获过程，在该位置固定5个细胞。
(4) 玻璃电极测试结果
使用非损伤微测系统(配有软件用于系统操作和数据处理)。 玻璃电极的制备取玻璃电极，电解液(Backfilling solution)如氢电极为
15mMNaC140mMKH2PO4，液态氢离子交换剂(LIX)，按照玻璃微电极制备方
法进行操作。 玻璃电极的校正如对氢电极的校正，选用两个pH值的盐酸溶液，通过
软件绘制曲线得到电极的Nernst Slope值。
样品的测定选择发绿色荧光的转基因酵母为实验材料，机械操作将玻璃 微电极与样品置于同一平面，打开计算机三维移动控制系统对微电极进行位置 上的控制，利用Excel将结果数据转为CSV码。
数据分析利用非损伤微测系统专用数据处理软件MageFkix进行数据处理。
图4可观测、分选带荧光生物样品的非损伤微测系统应用于转基因酵母的 检测。
权利要求
1.一种可观测带荧光生物样品的非损伤微测系统，包括离子/分子活性检测系统、显微成像系统和计算机数据处理系统，其中，显微成像系统包括明场照明器[1-1]、载物台[O-1]、物镜[1-9]、物镜转换器[1-8]、光路切换器[1-10]、目镜[1-11]和数码相机[1-12]，其特征在于显微成像系统中在连接物镜[1-9]与光路切换器[1-10]的光路之间安装有荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器[1-3]，滤光片转盘转换器[1-3]含有激发滤光片[1-5]、荧光分色镜[1-6]和阻挡滤光片[1-7]，荧光照明器[1-2]发出的激发光通过滤光片转盘转换器[1-3]中的激发滤光片[1-5]到达荧光分色镜[1-6]并反射到物镜[1-9]，通过物镜[1-9]后投射到样品[3-3]上，从样品[3-3]激发出的荧光通过物镜[1-9]和荧光分色镜[1-6]后，再经阻挡滤光片[1-7]选择特定波段的荧光通过，然后经光路切换器[1-10]后，到达目镜[1-11]或数码相机[1-12]，从而实现将荧光显微观测模式所需部件整合入非损伤微测系统。
2. 如权利要求1所述的可观测带荧光生物样品的非损伤微测系统，其特征 在于显微成像系统中在连接物镜[l-9]与荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器 [1-3]的光路之间安装有光钳工作模式用滤光片转盘转换器[1-4]，滤光片转盘转 换器[1-4]含有光钳分色镜[2-3]，激光发射器[2-l]发射的激光经过光学耦合器 [2-2]到达滤光片转盘转换器[1-4]中的光钳分色镜[2-3]并反射到物镜[1-9]，通过 物镜[l-9]后聚焦在样品池中形成光阱，而实现将光钳工作模式所需部件整合入 非损伤微测系统。
全文摘要
为了克服现有非损伤微测系统的光学成像系统无法观察生物样品发出的荧光的不足，本发明在现有非损伤微测系统的基础上，改进了光学成像系统，使非损伤微测系统在测量生物材料表面离子/分子流速方向的同时，可观察生物样品发出的荧光，以实现对被测生物材料进行筛选和状态监测的目的。本发明属于电化学技术领域，包括离子/分子活性检测系统、显微成像系统和计算机数据处理系统，其中，显微成像系统包括明场照明器、载物台、物镜、物镜转换器、光路切换器、目镜和数码相机，其特征在于显微成像系统中在连接物镜与光路切换器的光路之间安装有荧光显微观测模式用滤光片转盘转换器，该滤光片转盘转换器含有激发滤光片、荧光分色镜和阻挡滤光片。
文档编号G01N21/64GK101363839SQ20081022223
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者印莉萍, 鹏 张, 茜 房, 光 杨, 赵伟忠, 郭家峰, 思 靳 申请人:首都师范大学