专利名称：基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法
技术领域：
本发明属于生物传感器领域，涉及一种凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法。
背景技术：
生物/化学传感器件往往需要检测浓度低而噪音大的生物或者化学物质，因此其检测灵敏度及检测准确性一直是其发展及应用的瓶颈。针对生物/化学传感器件的这些特点人们目前开发了具有较高灵敏度的基于荧光、吸收光在内的光学信号检测的生物/化学传感器件及阻抗、电流在内的电学信号检测的生物/化学传感器件。其中光学信号由于直观、易得、灵敏及适用范围广而占据了生物/化学传感器件信号检测的大半部分。但是在实际应用中生物/化学传感器件的噪音问题却仍然是影响其检测性能提高的主要因素。例如在生物芯片中人们发现构成生物芯片的一种基底材料-玻璃或者高分子材料，往往存在荧光信号并影响检测时样品所发射的荧光信号。这种基底材料上的荧光信号即基底噪音将影响所检测物质的检测限及准确性。为此人们不得不选取低噪音信号的材料以改善生物/化学传感器件的检测性能。事实上，人们已经为生物芯片研制了专门的低荧光噪音玻璃材料。但是这往往意味着成本的上升及可选取材料的减少，而且低噪音材料构建的生物/化学传感器件仍然存在基底少量背景噪音的干扰。最近人们的研究表明许多具有凸型结构的纳米材料往往具有较为优良的检测灵敏度。例如人们在硅基底上生长氧化锌纳米杆并将其用于核酸及蛋白质的检测中就获得了较高的灵敏度。而我们的研究还表明不仅仅凸型纳米结构材料，而且几乎所有凸型结构材料只要能够利用其凸型界面以聚集待测物目标分子并转化为相应的检测信号就能够借助其凹凸型边界对待测物目标分子的聚集所导致的放大作用而提高检测的灵敏度。如图1所示即使是在抗原浓度为O. lng/ml时利用荧光标记抗体进行检测时在凸型字符编码聚丙烯酰胺不倒翁型微载体的凸型字符边界处仍然能够观测到足够强度的荧光，而在其周围的荧光强度则很低。但是在检测中，一个不容忽视的问题是即使聚丙烯酰胺水凝胶也有一定强度的荧光背景即基底噪音。这在很大程度上干扰了其待测物目标分子的检测。因此目前迫切需要新的检测信号提取技术以进一步改善基于光学信号检测的凹凸结构生物/化学传感器件的检测性能。如图2所示，对于表面起作用的凸型结构生物/化学传感器件而言，在凸型图案边界处由于待测物目标分子的聚集其单位面积检测信号为单位面积内的基底噪音信号和聚集的大量待测物目标分子检测信号之和；而在凸型图案周围其单位面积的检测信号则为单位面积内的基底噪音信号与少量待测物目标分子检测信号之和，则凸型图案边界处的单位面积检测信号与凸型图案周围单位面积的检测信号之差即差值信号就是只与待测物目标分子浓度相关的信号。此时基底噪音就被扣除了。因此绘制不同待测物目标分子浓度与差值信号的工作曲线，在检测未知待测物时通过插值法即可获悉相较于传统不扣除基底噪音信号方法更为准确且灵敏的未知待测物中目标分子的浓度。目前对于待测物目标分子光学检测信号的获取方法包括荧光光谱法、吸收光谱法等。这些方法虽然检测精度较高较准确，但是由于需要繁琐的检测操作，因此限制其在包括生物芯片等高通量检测的许多领域的应用。而另外一方面，随着显微成像技术的发展，待测物目标分子的光学检测信号可以转化为图像信号，即图像信号的灰度值可以反映待测物目标分子的包括荧光信号、光吸收信号等的光学检测信号。

发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种能够有效扣除凸型图案生物/化学传感器件基底的噪音信号并凸显凸型图案边界对检测信号的放大作用，有利于改善凸型图案生物/化学传感器件检测性能的基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法。技术方案本发明的基于凸型图案生物/化学传感器件的光学信号提取方法，包括以下步骤a)通过成像技术将凸型图案生物/化学传感器件的光学检测信号转换为图像信号;b)从步骤a)获取的图像信号中，分别提取凸型图案的凸型结构边界处的单位面积灰度值及其周围区域的单位面积灰度值，凸型图案的凸起边界周围区域为凸型图案所在平面上不包含凸起边界的区域；c)求得步骤b)中获得的凸型图案的凸型结构边界处的单位面积灰度值与凸起边界周围区域的单位面积灰度值的差值，作为待测物目标分子光学检测信号。本发明的步骤a)中，将凸型图案生物化学传感器件的检测信号转换为图像信号，是指通过成像设备获取凸型图案生物化学传感器件的图像然后从图像中提取包括单位面积灰度值在内的强度信号。本发明的步骤a)中，成像技术为各种显微镜拍照、扫描仪拍照或照相机拍照，成像设备包括光学显微镜、突光显微镜、红外显微镜、扫描仪或照相机。本发明的步骤b)中，提取凸型图案的凸起边界处的单位面积灰度值和凸起边界周围区域的单位面积灰度值的具体方法为分别从凸起边界处和凸起边界周围区域选定至少一个选定区域，然后通过计算机图像处理软件提取选定区域的灰度值和面积，转化为单位面积灰度值；如果凸起边界处或周围区域的选定区域为多个，则求取多个选定区域的单位面积灰度值的平均值，作为凸起边界处或周围区域的单位面积灰度值；如果凸起边界处或周围区域的选定区域为一个，则直接将选定区域的单位面积灰度值作为凸起边界处或周围区域的单位面积灰度值。有益效果本发明与现有技术相比，具有以下优点本申请首次将凸型图案生物/化学传感器件的光学检测信号图像化后将图像凸型结构边界处的单位面积灰度值及其周围区域的单位面积灰度值的差值作为待测物目标分子的光学检测信号。该方法能够有效扣除凸型图案生物/化学传感器件基底的噪音信号并凸显凸型图案边界对检测信号的放大作用，因此有利于改善凸型图案生物/化学传感器件的检测性能。为了进一步发展凸型图案生物/化学传感器件，本申请首次提出将凸型图案生物/化学传感器件的待测物目标分子光学检测信号通过显微成像技术转换为图像，然后提取图像凸型边界处的单位面积灰度值及其周围区域的单位面积灰度值，并进一步通过差值法获取凸型图案边界处检测信号与其周围检测信号的差值作为待测物目标分子光学检测信号以用于待测物目标分子的检测。该方法具有操作方便，适用范围广，检测性能优越等特在传感敏感材料固定至凸型图案边界区域及凸型图案周围区域后进行基于光学信号的生物/化学检测并以图像的结果呈现，然后将凸型图案边界处的图像信号与凸型图案周围区域的图像信号相减获取与待测物浓度相关的信号。该方法不仅能够有效扣除生物/化学传感器件的噪音信号，而且能够有效凸显凸型图案边界处传感敏感材料聚集所导致的信号放大作用，因此是改进基于光学信号检测的生物/化学传感器件检测性能的有效手段。


图1为凸型字母E不倒翁微载体俯视示意图。图2为凸型字符编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体上的免疫检测效果示意图A为凸型结构边界处；bl、b2为凸型结构周围区域；c为荧光标记抗原-抗体复合物。，

图3为通过夹心法进行荧光标记免疫分析凸型字母E不倒翁微载体的荧光显微示意图。图4为通过夹心法进行Cy3标记免疫分析凸型字母编码不倒翁聚丙烯酰胺微载体上抗原(人IgG)浓度对数与单位面积荧光强度关系图。其中单位面积荧光强度由实验所得荧光照片选定区域经图像处理提取灰度强度作为荧光强度而得到。夹心法免疫分析采用O. 1% (v/v)戊二醛PBS缓冲液孵育6h、60 μ g/mL羊抗人IgG的PBS缓冲液孵育5h、IOOng/mL人IgG的PBS缓冲液孵育时间2h、10 μ g/mL的Cy3标记羊抗人IgG的PBS缓冲液孵育Ih0□为Image Pro提取微载体平面全区域单位面积灰度值法，其拟合直线斜率为O. 8 'A为Image Pro提取包含整个凸型字符区域作为凸起边界处的单位面积灰度值法，其拟合直线斜率为5. 8 ;〇为Image J提取凸型字符边界区域50个像素点作为凸起边界处的单位面积灰度值，其拟合直线斜率为7. 3 ；图5为通过夹心法进行胶体金标记免疫分析凸型字母不倒翁聚丙烯酰胺微载体上不同浓度抗原(人IgG)对数与单位面积光强度关系图。其中单位面积光强度由实验所得光学照片选定区域经图像处理提取灰度强度作为光强度而得到。□为Image Pro提取凸型字符区域单位面积灰度值作为凸起边界处的单位面积灰度值，其拟合直线斜率为3 ;〇为Image J提取凸型字符边界区域100个像素点的单位面积灰度值作为凸起边界处的单位面积灰度值，其拟合直线斜率为5. 6 ;夹心法免疫分析采用O. 1%(ν/ν)的戊二醛PBS缓冲液孵育6h、60 μ g/mL羊抗人IgG的PBS缓冲液孵育5h、100ng/mL人IgG的PBS缓冲液孵育2h、20 μ g/mL的金标记羊抗人IgG的PBS缓冲液中孵育lh。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。图1给出了凸型字符E编码不倒翁微载体的俯视示意图。图2给出了凸型字符编码不倒翁微载体免疫检测效果示意图。在凸型结构边界a处，由于凸型结构中所含有的荧光标记或者其它光学标记的抗原-抗体复合物c的量远远超过凸型结构周围bl及b2区域近似单层光标记抗原-抗体复合物c的量，结果在凸型结构边界a处的光强度远远超过凸型结构周围bl及b2区域的光强度。由此得到的通过夹心法进行光标记免疫分析凸型字符E编码不倒翁微载体的荧光显微示意图3。虽然凸型字符周围的平面上也有微弱的光信号，但凸型字符边界处的光强度远远超过了其周围的光强度。下面以荧光强度为例分析不同的图像处理方法所获得的光强度信号及噪音情况。由于荧光显微照片上的灰度值反映了其荧光强度，因此微载体表面平均单位面积突光强度公式(公式I)为I 全区平=[(Ia+IN)*2Aa+ (Ib+IN)* (2Abl+Ab2) ]/ (2Aa+2Abl+Ab2)----公式 I式中Ia及Ib分别是a区及b区的荧光强度，In为背景荧光强度或者噪音，Aa、Abl及Ab2分别是区域a、bl及b2的面积。公式I给出的单位面积荧光强度是凸型图案编码不倒翁微载体平面所有荧光及背景噪音信号的累加，由于除了凸型字符界面a处具有较高的单位面积荧光强度外，凸型字符周围bl及凸型字符表面b2处的单位面积荧光强度较弱，结果公式I无法凸显凸型字符界面处的高单位面积荧光强度，而且背景荧光信号也没有去除。而当提取凸型字符表面选定a处及b2处与凸型字符周围bl处单位面积荧光强度的差值以进行定量分析时，其单位面积荧光强度公式(公式2)为I 字符平=[(Ia+IN)*2Aa+ (Ib+IN) *Ab2]/(2Aa+Ab2)- (Ib+IN) *2Abl/2Abl——公式2公式2通过提取包含凸起边界及凸型字符作为凸型字符边界处与凸型字符周围区域单位面积荧光强度的差值不仅有效扣除了背景荧光信号In，而且凸型字符界面处高单位面积荧光强度在有效荧光 强度中的比重有了较大的提升。需要指出的是这里字符表面选定区域可以是b2区的全部也可以是其部分，其效果类似，但其中a区即高荧光强度区在其中占比不同，贡献大小会有差异。对于提取凸型字符编码凸型边界区域即a处与凸型字符周围即bl处单位面积荧光强度的差值以进行定量分析时，其单位面积荧光强度公式(公式3)为I 字边平=[(工已+In) *2Aa]/2Aa_ (Ib+IN) *2Abl/2Abl=Ia_Ib ----公式 3此时，凸型字符界面处高单位面积荧光强度的组分在有效荧光强度中的比重进一步提高。这里凸型字符编码凸型边界区域为选择凸型字符边界处一定面积的像素点。凸型图案的凸起边界处为凸型图案所在平面上包含凸起边界的区域，而凸型图案的凸起边界周围区域为凸型图案所在平面上凸起边界区域外的其它区域；下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例一通过夹心法用凸型字母编码不倒翁聚丙烯酰胺微载体在O. 1% (v/v)戊二醛孵育6h以固定戍二醒,随后用60 μ g/mL羊抗人IgG孵育5h以获得固定了一抗的微载体。上述固定一抗的微载体分别在不同浓度抗原(人IgG)A)0ng/mL ；B)0.1ng/mL ；C) Ing/mL ；D) IOng/mL ；E) lOOng/mL ；F) lOOOng/mL的PBS缓冲液中孵育2h进行抗原-抗体反应后，用10 μ g/mL的Cy3标记羊抗人IgG孵育Ih以进行Cy3标记免疫分析。随后反应过的微载体通过荧光显微镜在放大倍率为40倍的情况下拍照。所得荧光照片通过图像处理软件提取反映微载体表面荧光强度的单位面积灰度值。首先通过Image Pro选取微载体上平面获得反映其荧光强度的灰度值及面积从而提取微载体上平面的单位面积灰度值，其值表示为Image Pro全区法。其次通过Image Pro软件选取包含微载体上平面凸型字符边界的凸型字符获得反映其荧光强度的灰度值及面积且另外再选取凸型字符外不包含凸型字符边界的区域获得其灰度值及面积从而提取微载体上凸型字符选定区域单位面积灰度值与凸型字符周围区域单位面积灰度值的差值，其值表示为Image Pro区提取法。最后采用Image J软件在微载体上凸型字符边界区域选取20个包含50个像素的点获得其灰度值及面积以提取单位面积灰度值，另外在不包含凸型字符边界的凸型字符周围区域选取20个包含50个像素的点获得其灰度值及面积以提取单位面积灰度值，然后将凸型字符边界区域提取的单位面积灰度值扣除凸型字符周围区域提取的单位面积灰度值并表示为Image J点提取法。将在不同浓度抗原条件下双夹心免疫反应所获得荧光标记微载体通过上述三种方法分别提取反映其荧光强度的单位面积灰度值并将单位面积灰度值对抗原浓度作图得到相应微载体上全微载体平面、微载体图案编码区域及微载体图案编码界面处的信号对所检测抗原浓度的关系示于图4。从中可以看到由于后两种方法扣除了背景荧光噪音的干扰，突出了与检测相关的有效荧光强度，因此其工作曲线的斜率分别为Λ标志I 的5. 8及〇标志I ￥ 的7. 3均远远高于基于全微载体荧光强度得到的□标志的工作曲线斜率O. 8。当然由于I￥a〒提取的荧光强度信号更突出凸型字符边界处荧光分子的聚集所表现的放大作用而其工作曲线的斜率大于I提取的工作曲线的斜率。众所周知，免疫检测分析浓度工作曲线的斜率越大就意味着其检测灵敏度越高，而其检测的准确性也就越好。因此突出提取凸型图案边界处的荧光检测信号不仅可以有效去除微载体背景荧光噪音的干扰，而且能够突出凸型图案编码不倒翁微载体凸型边界的信号放大作用而提高免疫检测分析工作曲线的斜率，从而提高其检测灵敏度及检测的准确性。实施例二

图5是通过夹心法进行胶体金标记免疫分析凸型字母不倒翁聚丙烯酰胺微载体上不同浓度抗原(人IgG)以及对照组(兔IgG)的反射显微成像照片A)0ng/mL ；B)0. lng/mL ；C) Ing/mL ；D) lOng/mL ；E) lOOng/mL ；F) lOOOng/mL ； ( X40), 0. 1% (v/v)戍二醒孵育 6h、60 μ g/mL羊抗人IgG孵育5h、lOOng/mL人IgG孵育时间2h、金标记羊抗人IgG孵育Ih后采用Image Pro软件分别提取不同抗原浓度条件下微载体上凸型字符选定区域单位面积灰度值与凸型字符周围区域单位面积灰度值的差值即与抗原浓度对数作图得到以□标志的直线及采用Image J软件分别提取不同抗原浓度条件下微载体上凸型字符边界区域单位面积灰度值与凸型字符周围区域单位面积灰度值的差值即I〒与抗原浓度对数作图得到以〇标志的直线。从中可以看到基于〇标志的工作曲线的斜率为5. 6，而基于□标志I 的工作曲线的斜率则只有3。因此突出提取凸型字符边界处的反射光信号同样能够提高相关生物检测的灵敏度及准确性。
权利要求
1.ー种的基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 a)通过成像技术将凸型图案生物化学传感器件的光学检测信号转换为图像信号； b)从所述步骤a)获取的图像信号中，分别提取凸型图案的凸起边界处的単位面积灰度值和凸起边界周围区域的単位面积灰度值，所述凸型图案的凸起边界周围区域为凸型图案所在平面上不包含凸起边界的区域； c)求得所述步骤b)中获得的凸型图案的凸型结构边界处的单位面积灰度值与凸起边界周围区域的単位面积灰度值的差值，作为待测物目标分子光学检测信号。
2.根据权利要求1所述的基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法，其特征在于，所述步骤a)中，将凸型图案生物化学传感器件的检测信号转换为图像信号，是指通过成像设备获取凸型图案生物化学传感器件的图像，然后从图像中提取包括単位面积灰度值在内的強度信号。
3.根据权利要求2所述的基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法，其特征在于，所述步骤a)中，成像技术为各种显微镜拍照、扫描仪拍照或照相机拍照，成像设备包括光学显微镜、突光显微镜、红外显微镜、扫描仪或照相机。
4.根据权利要求1或2所述的基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法，其特征在于，所述步骤b)中，提取凸型图案的凸起边界处的単位面积灰度值和凸起边界周围区域的単位面积灰度值的具体方法为分别从凸起边界处和凸起边界周围区域选定至少ー个选定区域，然后通过计算机图像处理软件提取选定区域的灰度值和面积，转化为单位面积灰度值； 如果凸起边界处或周围区域的选定区域为多个，则求取多个选定区域的単位面积灰度值的平均值，作为凸起边界处或周围区域的単位面积灰度值； 如果凸起边界处或周围区域的选定区域为ー个，则直接将选定区域的単位面积灰度值作为凸起边界处或周围区域的単位面积灰度值。
全文摘要
本发明公开了一种基于凸型图案生物化学传感器件的信号提取方法，首次将凸型图案生物化学传感器件的光学检测信号图像化后将包含图像凸型结构边界处的单位面积灰度值及其周围区域的单位面积灰度值的差值作为待测物目标分子的光学检测信号。本发明方法能够有效扣除凸型图案生物/化学传感器件基底的噪音信号并凸显凸型图案边界对检测信号的放大作用，因此有利于改善凸型图案生物/化学传感器件的检测性能。
文档编号G01N21/64GK103048303SQ20121055940
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者张继中 申请人:东南大学