专利名称：测量溶液中颗粒迁移率的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明公开了可以测量经受施加电场的溶液中带电颗粒的运动的新的方法和装置。虽然本发明说明书的大部分自始至终将涉及大分子，但是本发明更一般地包括所有类型的小颗粒，所述小颗粒包括乳状液、病毒、纳米颗粒、脂质体、大离子以及其大小可以介于半纳米和数千纳米之间的任何其它溶液组分。因此，无论什么时候使用术语“分子”、“大分子”或“大离子”，都应该理解它们包括所有前述的溶液带有(solution-borne)的物体。
背景技术：
电泳淌度是直接可测量的，并且是最广泛使用的表征溶液中分子电荷的参量，或者关于这些溶液中任何其它存在颗粒的参量。一旦测量，电泳淌度可以反过来用于测定由这种分子携带的有效电荷^以及其所谓的ζ电势ζ。在紧密结合颗粒的离子基团和不与颗粒一起运动的周围溶液的基团之间的界面限定了流体剪切力平面。ζ电势表示存在于该剪切力平面的静电势。本发明的基本目的是提供通过其可以测量溶液中的分子和颗粒的电泳淌度、有效电荷和ζ电势的改进的方法。电泳是在电场的影响下的大离子的迁移。通过迁移大离子获得的稳态的电泳速度 Ve与施加的电场成线性比例。当施加电场时，分子的速度基本上总是处于平衡状态。在电泳淌度情况下，可以通过测量电泳速度并且除以施加的电场来测量比例常数。本发明的一个目的是提供能够比迄今可能的更准确地测量溶液中颗粒的电泳速度的改进的装置。已经发展了几种技术并且可以用于测量迁移率。这些技术当中有界面移动法、微电泳以及光散射法诸如动态光散射外差法(heterodynedynamic light scattering)、DLS、 激光多普勒电泳、LDE和光散射相分析(phase analysis light scattering)PALS。界面移动方法应用专门的池(cell)以在大分子溶液和缓冲液之间建立两个清楚的界面。在施加电场下的界面的平移提供测定迁移率的定量方法。微电泳基于用放大光学系统直接观察的单独的颗粒的电泳运动。然而，微电泳限于半径远大于约IOOnm的颗粒的迁移率的测量。 也已经发展了用于测量电泳的光散射技术。从运动中的颗粒散射的光携带关于这种运动的信息，并且由其可以确定它们的电泳淌度。现在考虑用于测量电泳淌度的这些测量技术中最重要的PLAS。单色光的光束——通常来自激光源——照射暴露于施加电场、带有颗粒的液体样品。散射的一些光被聚集并且与一部分未散射的入射光合并。换句话说，散射信号与入射光相干地合并以产生外差信号。通常使用单模光纤实现两个光束的这种合并以保证两个光束之间的良好对准 (校直，alignment)。这种技术生成具有高对比度的边缘，但是导致相对低强度的合并光束， 因为每个组成光束的大部分的能量不再属于没有被光纤支持的模。本发明的另一个目的是在自由空间中合并这些光束，产生更大能量的相干光束，以及相应简化的检测器系统。为了测量合并光束的波动和从其衍生散射颗粒的电泳淌度的测量，合并光束之一涉及首先从摆镜(oscillating mirror)反射。这使得检测的条纹获得强度强度调制 (intensity modulation)，即使在不存在电泳运动的情况下。由此，产生于施加电场的施加的电场运动产生了允许明确确定迁移率信号的的频率漂移。然而，实际的考虑，如由Robert G.W.Brown 在"Homodyne Optical Fiber Dynamic Light Scattering，“ Appl. Opt. 40, 4004-4010 (2001)中所讨论的那些，要求两个合并光束的相对强度必须进行调节，使得两者的比例小于约30。本发明的另一个目的是消除调节光束的相对强度的需要， 允许该比例大于甚至100 1，从而利用称为相干放大的作用，这将在标题为发明详述的部分中更详细地描述。因为传统的PALS测量的合并光束强度比例被限制到相对小的范围，产生的信号的检测由此需要使用光电倍增管PMT或者雪崩光电二极管APD。这些检测器是昂贵的，并且由于它们疏忽地暴露于环境室内光线或其他外来的来源而被严重损坏或者甚至毁坏。本发明的另一个重要目的是消除这些昂贵的元件，同时提供不能够被外来光源损坏的检测装置。因为PMT和APD设备具有非常有限的动态范围，所以两个光束的光强度和比例必须进行连续地调节，以将检测器保持在它们的线性范围内。可选地，必须校正非线性作用。本发明的目的是具有宽的线性应答的检测装置，使得这种调节和模建是不必要的。本发明的另一个目的是快速地测量分子种类的迁移率而没有对被测量的分子产生破坏。本发明进一步和特别重要的目的是测量其有效大小完全在约5nm的PALS限值之下的分子的迁移率。本发明的更另一个目的是增加可能延伸到较低浓度和大小的测量的线性范围。

发明内容
这种PALS技术的创新实施常规地开始于分裂激光的相干光束以产生两个光束——参比光束和样品光束。将参比光束引至调制器，调制器在其上施加(impress)随时间变化的相位调制。该光束随后扩展和成形，使得它完全地照射检测器阵列。样品光束被聚焦进入并穿过包含流体样品的池，所述流体样品包含其迁移率(或电泳淌度)待测量的分子的悬浮液。池内的电极将随时间变化电场施加到被照射的样品。现在包含关于分子运动信息的传输样品光束与一部分被样品散射的光一起被透镜准直。该样品光束与参比光束合并以在检测器阵列上形成干涉散斑图样。选择阵列，以使每个元件覆盖散斑图样的一个或多个相干区以及覆盖窄范围的散射角，所述散射角由准直透镜的焦距确定。由于参比光束是相位调制的，所以每个检测器元件记录具有由相位调制器设定的频率的随时间变化信号。每个检测器元件的电信号被放大并且通过在该频率的带通滤波器过滤。阵列上的一个元件——正向监测器——检测未散射样品光束和参比光束的干涉。正向监测器测量被施加 (impress)于参比光束上的准确的相位调制。该信号然后用于解调对应于不同散射角的信号。在正向监测器和每个检测器之间的相差决定累积的光学相位，并且由此决定样品的迁移率。本测量技术赋予的最重要益处是每个检测器元件提供独立的、同时的测量。因为迁移率测定的精确性随着使用的检测器的数量而提高，因此，具有大量元件的阵列是优选的。 因此，该技术称为大规模并行光散射相分析(massively parallel phase analysis light scattering)MP-PALS。通过平均元件数量，取得规定的精确性所需要的时间随着元件的数量相反地减少，使得能够测量非常小的颗粒诸如蛋白质。另外，与MP-PALS相关的测量时间减少降低了对脆弱的生物学样品的损害，同时最小化电极的电化学降解。


图1显示光散射的相图。沿着X-轴的电场E被施加以驱动电泳。图2显示所测量的由以下引起的光学相位(a)仅颗粒扩散，(b)电泳和扩散，和 (c)在施加的电场的多个循环中平均的电泳和扩散，证明电泳分量占优势，而扩散分量是可以忽略的。样品是用于电泳淌度的NIST标准参比材料，SRM 1980。图3表示在其反馈回路中具有用于电流到电压转化的电阻器&和随后的在心用于模拟耦合的带通滤波器的互跨阻抗放大器。图4显示通过自由空间光学系统和光检测器阵列实现的MP-PALS装置。图5是改进的PALS系统的一个实施方式的测量池的详细视图。图6图解图4中显示的本发明MP-PALS装置的可选实施方式，在所述MP-PALS装置中使用两个光学检测器阵列。图7显示所测量的由以下引起的光学相位(a)仅颗粒扩散，(b)电泳和扩散，和 (c)在施加电场的多个循环中平均的电泳和扩散，证明电泳分量占优势，而扩散分量是可以忽略的。样品为在用磷酸滴定至PH3. 4的IOmM NaCl, ImM磷酸盐缓冲液中的1. Omg/ml的牛血清白蛋白。测量的迁移率是+2. 26 μ m 'cm/V 秒，与如由Menon和Zydney在“Measurement of Protein Charge and Ion Binding Using Capillary Electrophoresis,"(Anal. Chem.， V 70，pp 1581-1584(1998))中报道的通过毛细管电泳测量的值保持良好的一致。
具体实施例方式电泳是在电场的影响下的大离子的迁移。对于小于约200V/cm的场强度，所给予的迁移大离子的稳态电泳速度\与施加的电场E成线性比例，即Ve = μ E (1)其中μ是电泳淌度，或者速度/单位电场。达到稳态电泳速度的时间范围粗略地为m/f，其中m是大离子的质量，相关摩擦力f是6 π nrh, η是溶剂动态粘度，并且是大离子的流体动力学半径。例如，水溶液中的牛血清白蛋白BSA的分子具有大约0. 2nsec的 m/f。因此，当施加场时，分子速度总是有效地处于平衡状态。然后通过测量电泳速度并且除以施加的电场可以测定电泳淌度。已经导出使μ、&和ζ联系的数种关系，但是它们中没有一个是精确到足以在所有情况下可应用。各个近似值和参数诸如德拜长度(Debye length)、溶液离子强度、介电常数、粘度、颗粒尺寸和大离子表面传导都促成了复杂性。而且，非理想性(non-ideality)表明获得μ和ζ之间的精确分析表达式是艰难的任务，如果不是不可能的话。一种这样的非理想性称为电泳效应,其由C. Tanford在Physical Chemistry of Macromolecules中描述，由此大离子/颗粒不可避免地被通常由电解质提供的低分子量的抗衡离子和同离子包围。过量的抗衡离子存在于每个大离子/颗粒附近。驱动大离子的电场也以相反方向作用于这些抗衡离子。运动中的溶剂化抗衡离子拖着溶剂与它们一起，而溶剂反过来作用于大离子。净作用(net effect)是阻滞大离子运动的次级力。另一个重要的非理想性是离子弛豫(ion relaxation)，其中在大离子周围的同离子和抗衡离子的分配平衡的扰动由驱动大离子运动的恰好的电场产生。已经发展了用于测量迁移率的数种技术。最早中的一种称为界面移动法，其由R. A. Alberty 在"An Introduction to Electrophoresis，，，in J. Chem. Educ.，25，426， 619(1948)中描述。该方法使用U-型蒂塞利乌斯电泳池(Tiselius cell)以在大分子溶液和合适的缓冲液之间建立两个清楚的界面。大分子溶液在测量之前通常用缓冲液透析。在施加电场下的(扩散-扩大(diffusion-broadened))界面的平移提供测定迁移率的定量方法。虽然界面移动法的执行非常有助于蛋白质和胶态悬浮知识，但是它与多种实验困难相关，所述实验困难诸如焦耳热、电渗透、不同的升和降部分(dissimilar ascending and descending limbs)和导致pH和大离子迁移率变化的整个界面的缓冲离子浓度的不可避免的改变。这由 V. P. Dole 在 J.Am. Chem. Soc.，67，1119 (1945)中讨论。专门发展用于非常大颗粒的另一种技术是基于使用放大光学系统直接观察单独颗粒的电泳运动的微电泳。这由Α. V. Delgado等人在J. Colloid Interface Sci.，309， 203 (2007)的文章“Measurement and Interpretation of Electrokinetic Phenomena，，中描述。然而，该技术被其光学分辨率限制并且不能够测量半径比IOOnm小得多的颗粒的迁移率。另一缺点是只有有限数量的颗粒被测量，因此该技术具有不佳的统计学精确性。另外，存在基于颗粒如何被识别和跟踪的选择性偏差(selection bias)。测量通常花费数分钟或甚至数小时来完成。结果，焦耳热、样品降解和电渗头可能提出严峻的挑战。自从二十世纪七十年代早期，已经发展了用于测量电泳的各种光散射技术。由运动颗粒散射光是多普勒频移的，并且携带关于它们运动的信息。图1显示光散射相位图， 其中入射光被散射体积之内的颗粒1散射为具有散射角θ s的新方向。定义为Cls = I^ktl 的散射矢量表示散射和入射光的波矢量之间的差。方向在图1中示出，并且量值是|qs| = 4πη η(θ3/2)/λ，其中n是溶液的折射率和λ是真空中的光的波长。沿着X-轴的电场E产生电泳速度^= μΕ。散射光的光学相位与散射颗粒的位置相关。只考虑电泳运动，在时间O和稍后的At之间的光学相位差是Δ C^s = qs· \ At，其中是由于电泳的颗粒的位移。在一些简单的代数运算之后，可以获得多普勒频移= dcts/dt = μ ZJir^sinOjE/X。一般而言，颗粒的运动可以可以是集体的(由于流体流动、电泳等等)和扩散的(由于布朗运动)。扩散分量——在性质上是随机的——随着时间平均至零，而如果足够的测量信息是可利用以平均出扩散分量至零，那么集体的分量可以被显示。 如果测量由于施加电场的每个单位时间的平均光学相位偏移diA/i，那么可以测定电泳淌度μ。图2图解假定足够的测量时间，与颗粒扩散相关的光学相位如何平均至零。图 2(a)显示由于单独的颗粒扩散的测量的光学相位。相位测量每2毫秒获取并归一化至 sin θ s。样品是由美国国家标准及技术研究所(National Institute of Standards & Technology) (NIST)确认的电泳淌度标准参比材料SRM 1980。它由电子显微镜测定的 60nmX20nm的平均大小的针状颗粒组成。如所见，这种扩散分量实际上是随机的，并且由于颗粒扩散的相应的相位偏移(Phase wandering)在几秒的数量级上平均至零。根据斯托克斯-爱因斯坦(Mokes-Einstein)方程，扩散常数与流体动力学半径成反比，因此颗粒越小，平均扩散分量花费的时间越长。图2(b)图示当施加10Hz、具有18V/cm大小的方波电场来驱动电泳时的测量的光学相位。按比例绘制的偏移电场(scaled and offset electric field)在光学相位下作图用于视觉参考。这里，光学相位由电泳和扩散分量组成。清楚地看出，当电场转换极性时，电泳分量颠倒其方向，而扩散分量则保持独立于电场并且随机地进行。在图( 中，每单位电场的光学相位变化在电场的多个循环中平均，然后对于电场的正电和负电部分都拟合为直线。由于扩散分量在数秒内平均，从拟合直线的斜率容易地获得电泳淌度。SRM1980的迁移率计算为+2. 57ym· cm/V · sec，非常好地在NIST确认值的误差2. 53士0. 12μπι · cm/V · sec内。该迁移率在小于三秒内准确地测定。这种测量可以用在660nm工作的激光进行，但是可以使用任何波长。一般而言，可以以两种不同方式进行DLS测量零差和外差法。术语外差和外差法在文献中常常不一致地使用。为了本公开的目的，我们将它们定义如下i)零差模式，其中只有从颗粒自身散射的光被混合，和ii)外差模式，其中由颗粒散射的光与一些未散射的光混合，该未散射的光通常称为本机振荡光(local oscillator).为了理解这两个模式之间的差别，我们考虑了在检测器生成的光电流i(t)
权利要求
1.测量样品溶液的等分试样中颗粒的电泳淌度的装置，包括A)产生相干单色光光束的装置；B)将所述相干单色光光束分割为以下光束的光学装置1)将通过所述样品的样品光束，和2)参比光束；C)由以下组成的非传导性样品池1)容纳所述样品等分试样的槽，2)电极，在所述电极之间电压可以施加在其中包含的所述样品等分试样上，和3)在所述槽中的光学窗口，通过该光学窗口a)所述样品光束可以进入所述槽并且由其中包含的所述等分试样中的颗粒散射，b)所述样品光束和由所述样品等分试样中的所述颗粒散射的一部分光可以离开所述样品池；D)使离开所述样品池的未散射的所述样品光束和由所述颗粒散射并离开所述样品池的所述一部分所述样品光束光聚集和准直的光学装置；E)相对于所述样品光束的光学相位调制所述参比光束的光学相位的装置；F)合并所述参比光束与由所述颗粒散射的所述准直部分的光而形成第三相干光束的、 在自由空间中的光学装置；G)光检测器元件阵列，所述第三相干光束入射在其上，每个所述检测器元件由此产生随时间变化的信号；和H)电子装置，其处理接收自每个所述光检测器元件的所述随时间变化的信号，将所述信号转化成数字表示，并将生成的数字信号传输到计算机装置以由此计算所述电泳淌度。
2.权利要求1所述的装置，其中所述调制所述参比光束的光学相位的装置包括驱动后向反射装置的压电致动器。
3.权利要求2所述的装置，其中所述后向反射装置是直角棱镜。
4.权利要求2所述的装置，其中所述后向反射装置由反射表面彼此互相垂直的两个镜组成。
5.权利要求3所述的装置，其中所述直角棱镜的斜表面是减反射涂布的。
6.权利要求1所述的装置，其中所述光检测器元件是光电二极管。
7.权利要求1所述的装置，其中所述光检测器元件阵列是一维的。
8.权利要求1所述的装置，其中所述光检测器元件阵列是二维的。
9.权利要求1所述的装置，其中所述样品池槽包含输入和输出流装置，由此所述样品等分试样可以注入所述槽中和从所述槽中去除。
10.权利要求1所述的装置，其中所述样品池是可互换单元。
11.权利要求10所述的装置，其中所述可互换样品池单元是一次性的。
12.权利要求1所述的装置，其包括在与所述样品光束重新合并之前使所述参比光束准直的装置。
13.权利要求12所述的装置，其中所述使所述参比光束准直的装置包括发散透镜和会聚透镜。
14.权利要求1所述的装置，其中所述使所述样品光束聚集和准直的装置包括会聚透镜。
15.权利要求1所述的装置，其中所述单色相干光光束由激光器产生。
16.权利要求1所述的装置，其中所述样品光束聚焦在所述样品池的中心。
17.权利要求1所述的装置，其中所述样品光束的未散射部分通过中性密度滤光器衰减。
18.权利要求17所述的装置，其中所述样品光束的所述衰减的、未散射部分入射在所述光检测器阵列的单个元件上，由此提供样品光束监测器。
19.权利要求1所述的装置，还包括与所述电极接触、使所述样品池的温度能够控制的装置。
20.权利要求1所述的装置，其中分割所述相干单色光光束成为所述参比和样品光束的所述光学装置包括分光器。
21.权利要求1所述的装置，其中合并所述参比光束与由所述颗粒散射的所述准直部分的光、在自由空间中的所述光学装置包括分光器。
22.权利要求1所述的装置，其中使离开所述样品池的未散射的所述样品光束和由所述颗粒散射并离开所述样品池的所述一部分所述样品光束光聚集和准直的所述光学装置包括非球面透镜。
23.权利要求1所述的装置，还包括使所述参比光束在与所述样品光束重新合并之前成形以允许最佳利用所述光检测器元件阵列的光学装置。
24.权利要求21所述的装置，还包括第二光检测器元件阵列，被所述分光器反射的所述第三相干光束的部分入射在所述第二光检测器元件阵列上。
25.测量样品溶液中颗粒的电泳淌度的方法，包括以下步骤A)将所述样品溶液的等分试样装入样品池，所述样品池包括a.容纳所述样品等分试样的槽，b.电极，在所述电极之间电压可以施加在其中包含的所述样品等分试样上，和c.光束可以通过的、所述槽中的光学窗口；B)提供生成相干单色光光束的装置；C)提供将所述相干单色光光束分割成为以下光束的装置a.将通过所述样品池的样品光束，和b.参比光束；D)提供相对于所述样品光束的光学相位调制所述参比光束的光学相位的装置；E)提供使离开所述样品池的未散射的所述样品光束和由所述样品池中所述样品等分试样散射的所述部分所述样品光束光聚集和准直的装置；F)提供合并所述参比光束与由所述样品等分试样散射的所述准直部分光而形成第三光束的装置；G)提供在所述第三光束的路径中放置的多个光检测器元件中的每一个处测量所述第三光束的光强度值的装置；H)提供将在每个光检测器元件处测量的所述光强度值转化为数字表示的装置；I)提供将生成的数字信号传输到计算机装置的装置；J)提供处理所述数字信号的装置，由此获得所述溶液中所述颗粒的所述电泳淌度。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述调制所述参比光束的光学相位的装置包括驱动后向反射装置的压电致动器。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述后向反射装置是直角棱镜。
28.根据权利要求沈所述的方法，其中所述后向反射装置由反射表面彼此互相垂直的两个镜组成。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述直角棱镜的斜表面是减反射涂布的。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述光检测器元件是光电二极管。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述多个光检测器元件以一维阵列排列。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述多个光检测器元件以二维阵列排列。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述样品池在被放入所述相干单色光光束的路径中之前是可移除和装填的。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述可移除的样品池是一次性的。
35.根据权利要求25所述的方法，还包括提供在与所述样品光束重新合并之前使所述参比光束准直的装置的步骤。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述使所述参比光束准直的装置包括发散透镜和会聚透镜。
37.根据权利要求25所述的方法，其中所述使所述样品光束聚集和准直的装置包括会聚透镜。
38.根据权利要求25所述的方法，其中所述单色相干光束光由激光器产生。
39.根据权利要求25所述的方法，还包括提供在所述样品池的中心处聚焦所述样品光束的装置的步骤。
40.根据权利要求25所述的方法，还包括提供通过中性密度滤光器衰减所述样品光束的未散射部分的装置的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述样品光束的所述衰减的未散射部分入射在所述多个光检测器的单个元件上，由此提供监测所述样品光束的装置。
42.根据权利要求25所述的方法，还包括提供与所述电极接触的温度控制装置的步骤，使得所述样品池的温度能够控制。
43.根据权利要求25所述的方法，其中所述分割所述相干单色光光束成为所述参比和样品光束的装置包括分光器。
44.根据权利要求25所述的方法，其中所述合并所述参比光束与由所述样品等分试样散射的所述准直部分的光的装置包括分光器。
45.根据权利要求25所述的方法，其中所述使离开所述样品池的未散射的所述样品光束和由所述样品池中所述样品等分试样散射的所述部分所述样品光束光聚集和准直的装置包括非球面透镜。
46.根据权利要求25所述的方法，还包括提供使所述参比光束在与所述样品光束重新合并之前成形以允许最佳利用所述多个光检测器元件的光学装置的步骤。
47.根据权利要求44所述的方法，还包括提供第二多个光检测器元件的步骤，被所述分光器反射的所述第三相干光束的部分入射在所述第二多个光检测器元件上。
全文摘要
本发明的名称是测量溶液中颗粒迁移率的方法和装置。公开了用于测量溶液中颗粒和分子的电泳淌度的方法和装置。颗粒样品放置在包含施加交流电场的两个电极的池中。单色光光束穿过样品。当被颗粒散射的光离开池时，其与未散射的光束一起被聚集和准直。光束在自由空间中与相位调制的参比光束合并。干涉形成频率调制的散斑图样，其通过光检测器阵列检测。每个阵列元件聚集窄范围的界限分明的散射角。来自每一个的信号进行解调，以提取光学相位信息，提供散射颗粒的电泳淌度的第一原理性测量。每个检测器元件提供同时的独立测量。这种固有的平行性极大地增加了在给定时间可利用的信息量。
文档编号G01N15/00GK102192867SQ20111005093
公开日2011年9月21日 申请日期2011年2月25日 优先权日2010年2月26日
发明者H-T·谢, S·P·特雷奥夫 申请人:怀亚特技术公司