专利名称：免疫结合直接法或免疫沉淀分离法测定脂蛋白残粒中胆固醇浓度的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度的方法，具体的涉及采用免疫结合直接法或免疫沉淀分离法来测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度，作为临床判断动脉粥样硬化性疾病和冠心病以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病程度及疗效评估、预后判断的参考依据。
背景技术：
脂蛋白残粒(remnant lipoprotein，RLP)又称富含甘油三酯(triglyceride，TG)脂蛋白残粒(TRL)，是乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)经脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)水解逐渐失去甘油三酯、磷脂、载脂蛋白A(apoprotein A，apoA)和apoC后，转变成的富含胆固醇、胆固醇脂和apoE的较小颗粒。
近年来，随着对脂蛋白残粒的深入了解，RLP测定的临床意义日趋受重视。大量研究表明，RLP浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样硬化相关的疾病(如2型糖尿病、III型高脂血症和慢性肾功能衰竭及肥胖患者)中显著增加。另外，从人动脉粥样斑块中分离的脂蛋白在结构上与富含TG脂蛋白残粒相似。因此，血浆脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronary heart disease，CHD)以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。所以，准确、快速测定RLP非常重要。
然而，现有技术中测定RLP的传统方法多用超速离心法和凝胶电泳法。脂蛋白残粒是一组在大小、密度、电泳迁移率、化学组成及受体识别等方面呈高度异质性的颗粒，现有的分离方法主要是根据其不同的物理和化学特征来测定脂蛋白残粒。超速离心是脂蛋白分离的参考方法，先前常用LDL(1.006<d>11.009kg/L或Sv12~20)反映残粒状态，后来有学者提出Sv12~60的脂蛋白反映残粒状态比Sv12~20的脂蛋白好，但是在此范围的脂蛋白包括LDL(1.006<d>11.009kg/L或Sv12~20)和介于d＜1.006kg/L组分中的小VLDL颗粒，因此，此法并不能作为分离脂蛋白残粒的参考方法；而聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)法根据分子大小来分离脂蛋白，用LDL来反映脂蛋白残粒状态，包括大小在VLDL和LDL的任何脂蛋白颗粒。但是，此两种方法因需特殊仪器，费时或操作繁琐，均难于在普通实验室开展。
因此，需要一种简单、廉价、快速的检测血清或血浆中脂蛋白残粒胆固醇的方法。

发明内容
本发明满足了上述要求，提供了两种快速准确检测血清或血浆中脂蛋白残粒的方法。具体地，本发明采用免疫结合直接法或免疫沉淀分离法分离脂蛋白残粒，从而快速准确地检测血清或血浆中脂蛋白残粒。
本发明的检测方法包括a)将试剂I与样品混合，以使试剂I中的抗体与样品充分反应；b)用本领域公知的方法检测所得溶液中的胆固醇浓度，即为脂蛋白残粒浓度其中，该试剂I包括ApoB100抗体、ApoA I抗体，以及任选的促进剂、TRIS-HCL缓冲液、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。样品是血清或血浆。
任选地，在步骤b)之前，可以对待检测血清或血浆加ApoB100、ApoA I抗体，包括多克隆抗体和/或单克隆抗体充分反应后进行离心，取上清液。
公知地，ApoB100抗体含有ApoB48和ApoB52两个亚基，因此，ApoB48抗体或ApoB52抗体也可以用于本发明或代替ApoB100来实施本发明。
特别地，本发明提供了两种用于分离脂蛋白残粒的方法，以快速准确地检测血清或血浆中脂蛋白残粒，该方法包括方法一将试剂I直接与样品混合，任选反应时间，加入试剂II。用胆固醇酶法测定样品中胆固醇浓度，即为脂蛋白残粒浓度。方法二样品经离心分离后，将试剂I与离心后的上清液混合，任选反应时间，加入试剂II。用胆固醇酶法测定样品中胆固醇浓度，即为脂蛋白残粒浓度。
本发明的检测方法能快速准确地检测血清或血浆中脂蛋白残粒，作为临床判断动脉粥样硬化性疾病和冠心病以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病程度及疗效评估、预后判断的参考依据。
因此，本发明的一方面，提供了分离脂蛋白残粒的方法，其特征在于采用了免疫分离方法。本发明的另一方面，提供了一种用于分离脂蛋白残粒的免疫结合直接方法，该方法包括将一定量试剂I与检测的样品混合，混匀并反应完全后进行测定。
在上述方法中，所述试剂I含有ApoB100抗体与ApoA I抗体。所述样品是血清或血浆，更进一步地是人血清或血浆。如上所述，可以用ApoB48和/或ApoB52来代替ApoB100或与ApoB100一起来实施本发明。
试剂I中的抗体的是用来结合血清或血浆样品中的相应抗原，因此，可以理解，这些抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。在一些优选具体实施方案中，所述抗体是兔或羊抗人多克隆抗体或单克隆抗体。
因此，本发明提供了两种分离脂蛋白残粒的方法，方法一将一定量的含有兔或羊抗人ApoB100多克隆抗体或单克隆抗体、兔或羊抗人ApoA I多克隆抗体或单克隆抗体的试剂I与待检测的样品混合，混匀后在37℃中放置5-10分钟，让ApoB100、ApoA I抗体和相应抗原充分结合；方法二将样品与抗体完全反应后进行离心。其中，该样品是血清或血浆，离心是以4000转/分离心。
可选择地，上述试剂I还含有促进剂。可选择地，该促进剂是聚乙二醇500-20000，优选聚乙二醇6000。
一般地，加入的试剂I的量根据所测样品量不同而不同。在一些具体实施方案中，加入的试剂I的量足以去除样品中所有的ApoB100抗原与ApoA I抗原。本领域的普通技术人员可以用各种公知的方法检测样品中的抗原是否被完全结合。另外，向本发明的方法中加入促进剂可以促进混合物反应的快速进行，一般地，其所加入的量为使所述反应在可控范围内的任何量，在一些具体实施方案中，用ApoB48和/或52代替ApoB100，加入的促进剂的量为0.5-4.0g/L；优选地为2.0g/L。
因此，本发明的另一方面，提供了一种快速分离脂蛋白残粒的免疫结合直接法，该方法包括将足量含有ApoB100抗体、ApoAI抗体和促进剂的试剂I与检测的样品混合，混匀后在37℃中放置5-10分钟，让ApoB100、ApoA I抗原和抗体充分结合；反应完全后进行测定。其中，该样品是血清或血浆，该促进剂是聚乙二醇6000。ApoB100抗体选自兔或羊抗人ApoB100多克隆抗体或单克隆抗体，ApoA I抗体选自兔或羊抗人ApoA I多克隆抗体或单克隆抗体，这些抗体可以用常规免疫方法获得(1、童明庆，孙南雄，主译.实用免疫化学.南京南京出版社，1990.42-59.2、陶义训，主编.免疫学和免疫学检验.第二版.北京人民卫生出版社，1997.96-116.3、梁国栋，主编.最新分子生物学实验技术.北京科学出版社，2001.62-100.)。
更进一步地，上述试剂I还含有Tris-HCL缓冲液、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。在一具体实施方案中，试剂I中的Tris-HCL缓冲液的浓度为40-60mmol/L；胆固醇酯酶的浓度为45-75U/L；胆固醇氧化酶的浓度为45-75U/L；过氧化物酶的浓度为＞150U/L，优选为150U/L-250U/L。在另一优选具体实施方案中，试剂I中的Tris-HCL缓冲液的浓度为50mmol/L，胆固醇酯酶的浓度为60U/L，胆固醇氧化酶的浓度为60U/L，过氧化物酶的浓度为150mmol/L。
在上述方法中，将试剂I与样品混匀，去除了样品中含ApoB100的几乎所有的低密度脂蛋白(LDL)和多数VLDL及含ApoA I的几乎所有的高密度脂蛋白(HDL)，剩下的是未结合的部分，主要是CM残粒和较小的VLDL残粒，总称RLP。经测定，上清液中是该未结合的CM残粒和较小的VLDL残粒，即RLP。
RLP的浓度主要是依据脂蛋白残粒表面和载脂蛋白来分离测定。因此，本发明的另一方面，还提供了两种测定脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)的方法，该方法包括用胆固醇酶法测定上述未结合的CM残粒和较小的VLDL残粒部分的胆固醇的浓度，该浓度即是RLP的浓度。
所述的胆固醇酶法测定是本领域公知的，如化学法包括抽提法和直接测定法。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法和三氯化铁-硫酸反应法(Zak法)，其中Zak法具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法。另外，另一种公知的胆固醇检测方法是酶法测定，该方法敏感特异快速，并能自动化分析，已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局(NBS)出品纯度达99.8％，是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。
优选地，本发明采用酶法测定法来检测胆固醇的浓度。其反应原理是胆固醇酯在脂蛋白酯酶的作用下水结成胆固醇和脂肪酸，胆固醇再经胆固醇氧化酶氧化成胆甾-4-烯-3-酮和H2O2，分别定量氧气的消耗或者H2O2的生成量，或者胆甾-4-烯-3-酮的生成量，作为胆固醇的定量依据。特定地，本发明采用Allain等的方法(Nakajima K，Saito T，Tamura A，et al.Cholesterol in Remnant-like lipoproteins in human serum usingmonoclonal anti apo B-100 and anti apo A-I immunoaffinity mixed gels.Clin Chim Acta，1993，223(1-2)53-71.)，该方法是基于如下反应
其中，LPL是胆固醇酯酶，CO是胆固醇氧化酶，POD是过氧化物酶。
上述反应生成的醌亚胺色素为红色，其与样品中的胆固醇浓度成正比，可在505-550nm波长出进行吸收光度测定，从而计算出胆固醇的浓度。
明显地，为了测定样品中的脂蛋白残粒的浓度，必须向用上述分离方法分离的RLP部分(或离心后的上清液)中加入试剂II，该试剂II含有过氧化物酶和4-氨基安替比林。可选择地，在试剂I不含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，试剂II还含有含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。
在一些具体实施方案中，试剂II中的过氧化物酶的浓度为≥150U/L，4-氨基安替比林的浓度为0.05-0.20mmol/L。在优选的具体实施方案中，试剂II中的过氧化物酶的浓度为150U/L，4-氨基安替比林的浓度为0.06mmol/L。
因此，本发明提供了两种测定血清或血浆样品中的RLP的方法，该方法包括a)将试剂I与样品混合，以使试剂I中的抗体与样品充分反应；b)用本领域公知的方法检测所得溶液中的胆固醇浓度。
任选地，在进行步骤b)之前，可以将待检测血清或血浆与试剂I充分反应后的混合物离心，取血清或血浆上清液。
因此，更具体地，本发明提供了两种测定血清或血浆样品中的脂蛋白残粒的方法，该方法包括a)取一定量的ApoB100抗体与ApoA I抗体，任选的促进剂，任选的TRIS-HCL缓冲液，任选的胆固醇酯酶，任选的胆固醇氧化酶和任选的过氧化物酶混合液与待检样品混合，混匀后在37℃中放置5-10分钟，以使ApoB100、ApoA I抗原和抗体充分结合；b)任选地，取一定量的ApoB100抗体、ApoA I抗体、任选的促进剂与待检样品混合，混匀后在37℃中放置30分钟后，用4000转/分离心10分种，取上清液；c)用胆固醇酶法试剂测定所得溶液中的胆固醇浓度。
更具体地，上述方法的步骤c)包括向上清液中加入试剂II，该试剂II含有过氧化物酶、4-氨基安替比林和任选的胆固醇酯酶和任选的胆固醇氧化酶；反应完全后，在505-550nm处进行吸收光度测定，从而计算出胆固醇的浓度。
实验表明，用免疫结合直接法或免疫沉淀分离法分离的脂蛋白残粒的量能够代表TRL中潜在致动脉粥样硬化的脂蛋白，同时RLP也显示具有致动脉粥样硬化脂蛋白残粒的生物学特征，即抑制内皮依赖性血管舒张、增强血小板聚集和不经修饰可被巨噬细胞摄取等。另外，本发明的方法可以直接在样品溶液中进行，而省去离心等步骤，从而简化了步骤，利于操作。
具体实施例方式
实施例1 用免疫结合直接法检测RLP使用试剂I和试剂II，试剂I含有50mmol/L Tris-HDL缓冲液、60U/L胆固醇脂酶、60U/L胆固醇氧化酶、150mmol/L过氧化物酶、2g/L聚乙二醇6000、11.3mL兔抗人ApoB100抗血清、7.5mL兔抗人ApoA I抗血清，试剂II含有150mmol/L过氧化物酶、0.06mmol/L 4-氨基安替比林和50mmol/L Tris-HDL缓冲液。将试剂I和II的各组分按照其组分含量加入到缓冲液中，混匀，过滤掉沉淀，将所得到的溶液在4℃下保存备用。
从受试个体中取出24uL血清或血浆，将225uL试剂I加入到血清或血浆中，混合均匀，37℃下放置5分钟。让ApoB100、ApoA I抗原与抗体充分结合。在722型分光光度计上，用505nm波长，1cm光径比色皿，以蒸馏水校零，测定其吸光度值A1。
随后，再向其中加入75uL试剂II，37℃保温5分钟，在722型分光光度计上，用505nm波长，1cm光径比色皿，以蒸馏水校零，测定其吸光度值A2。
以已知浓度c.f.a.s.胆固醇校准品为校准液，取24uL按照上述相同的步骤得到光吸收值A1’和A2’。
根据公式胆固醇浓度(mmol/L)＝(A2-A1)/A2’-A1’)×校准液浓度(mmol/L)。
实施例2 用免疫沉淀分离法检测RLP使用113uL兔抗人ApoB100抗血清、71uL兔抗人ApoA I抗血清与30uL血清或血浆放置在室温或37℃混匀30分钟，4000转/分离心取上清液，将所得到的上清液保存备用。
取出24uL上清液，将225uL试剂I加入到上清液中，混合均匀，37℃下放置5分钟。在722型分光光度计上，用505nm波长，1cm光径比色皿，以蒸馏水校零，测定其吸光度值A1。
随后，向其中加入75uL试剂II，37℃保温5分钟，在722型分光光度计上，用505nm波长，1cm光径比色皿，以蒸馏水校零，测定其吸光度值A2。
以已知浓度c.f.a.s.胆固醇校准品为校准液，取24uL按照上述相同的步骤得到光吸收值A1’和A2’。
根据公式胆固醇浓度(mmol/L)＝(A2-A1)/A2’-A1’)×校准液浓度(mmol/L)。
实施例3本发明检测方法的线性、反应进程、精度、回收率和干扰性试验一、线性分析取一低值标本(RLP-C为0.08mmol/L)和一高值标本(RLP-C为2.00mmol/L)等量混匀后制备中值标本的RLP-C为1.04mmol/L，中值标本分别与高、低值标本等量混匀又制备两个水平标本的RLP-C，分别为1.52mmol/L和0.56mmol/L。5个不同水平的标本分别用两种清除法按由高到低的顺序分别用实施例1的方法测定4次，按NCCLS EP6-P文件进行线性分析。结果线性回归分析方程为Y＝0.986X+0.019，r＝0.992，表明该法在2.00mmol/L以内线性关系良好。
二、批内精度取高、中、低值3个不同水平RLP-C(0.50mmol/L、0.20mmol/L和0.08mmol/L)样品，按照实施例1的方法进行测量，其重复次数为20次。按美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for ClinicalLaboratory Standards，NCCLS)EP5-T2文件进行精密度评价。三浓度水平的批内CV分别为1.76％、2.64％和3.76％三、批间精度取高、中、低值3个不同水平RLP-C(0.50mmol/L、.0.20mmol/L和0.08mmol/L)样品，按照实施例1的方法进行测量。每天上下午各测定1次，连续测定10天，第次测定均作双份，按美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)EP5-T2文件进行精密度评价。三浓度水平的批间CV分别为2.99％、3.14％和3.81％。
四、干扰试验取一份混合血清(RLP-C为0.22mmol/L)分别加入不同浓度血红蛋白(以Hb浓度表示)、胆红素、抗坏血酸和脂肪乳剂(以TG浓度表示)，LDL(以LDL-C表示)和HDL(以HDL-C表示)，按照实施例1的方法分别测定RLP-C，结果显示，TG＜15.3mmol/L、Hb＜5g/L、LDL-C＜7.0mmol/L、HDL-C＜3.0mmol/L、胆红素＜342μmol/L、抗坏血酸＜150mmol/L时对方法无显著干扰。
实施例4 本发明方法的临床应用效果应用实施例1的测定方法测定了200例正常人以及60例冠心病、102例2型糖尿病、40例III型高脂蛋白血症患者血浆RLP-C水平。正常组、冠心病组、2型糖尿病组、III型高脂蛋白血症组血浆RLP-C分别为(0.18±0.08)mmol/L、(0.403±0.331)mmol/L、(0.38±0.21)mmol/L、(0.91±0.58)mmol/L，冠心病组、2型糖尿病组、III型高脂蛋白血症组均显著高于对归组，差异有显著意义，P均小于0.001。正常组RLP-C浓度有显著年龄和性别差异，55岁以下同年龄组男女参考值具有显著区别，其中男性参考值各年龄组无显著区别，而女性各年龄组有显著区别；55岁以上同年龄组男女参考值无显著区别。
权利要求
1.测定血清或血浆样品中的脂蛋白残粒的方法，该方法包括步骤a)将一定量的含有ApoB100抗体和ApoA I抗体的试剂I与样品混合，以使试剂I中的抗体与样品中的相应抗原充分反应，得到反应完全的溶液；b)用胆固醇酶法检测所得溶液中的胆固醇浓度，即为脂蛋白残粒浓度
2.如权利要求1的方法，其中在使用胆固醇酶法检测之前将所述反应完全的溶液离心，得上清液。
3.如权利要求1的方法，其中的ApoB100抗体可以用ApoB52抗体或ApoB48抗体代替。
4.如权利要求1、2或3的方法，其中所述的抗体选自兔或羊抗人多克隆抗体或单克隆抗体。
5.如权利要求1、2或3的方法，其中所述的试剂I还含有促进剂。
6.如权利要求4的方法，其中所述的促进剂是聚乙二醇6000。
7.如权利要求1、2或3的方法，其中步骤c)包括向上清液中加入一定量的试剂II进行反应，该试剂II含有过氧化物酶、4-氨基安替比林、任选的胆固醇酯酶和任选的胆固醇氧化酶；反应完全后，在505-550nm处进行吸光度测定，从而计算出胆固醇的浓度。
8.如权利要求1、2或3的方法，其中所述的试剂I还含有胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶。
9.如权利要求8的方法，其中步骤c)包括向上清液中加入一定量的试剂II进行反应，该试剂II含有过氧化物酶和4-氨基安替比林；反应完全后，在505-550nm处进行吸收光度测定，从而计算出胆固醇的浓度。
10.分离血清或血浆样品中的脂蛋白残粒的免疫沉淀分离方法，该方法包括将含有ApoB100抗体与ApoA I抗体的试剂I与该样品混合，混匀并反应完全后进行测定。
11.如权利要求10的方法，其中的ApoB100抗体可以用ApoB52抗体或ApoB48抗体代替。
12.如权利要求10或11的方法，其中所述的抗体选自兔或羊抗人单或多克隆抗体。
13.如权利要求10的方法，其中所述的试剂I还含有促进剂。
14.如权利要求13的方法，其中所述的促进剂是聚乙二醇6000。
15.如权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述的试剂I还含有胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶。
16.测定血清或血浆样品中的脂蛋白残粒的方法，该方法包括步骤a)取一定量的ApoB100抗体和ApoA I抗体，任选的加速促进剂，任选的TRIS-HCL缓冲液，任选的胆固醇酯酶，任选的胆固醇氧化酶和任选的过氧化物酶混合液与待检样品混合，混匀后在37℃中放置5-10分钟，以使ApoB100、ApoA I抗原和抗体充分结合；b)任选地，取一定量ApoB100抗体和ApoA I抗体与待检品混合，混匀后在37℃放置30分钟，4000转/分离心10分种后，取待检样品上清液c)用胆固醇酶法试剂测定所得溶液中的胆固醇浓度，即为脂蛋白残粒浓度。
全文摘要
本发明涉及测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度的方法，具体地涉及采用免疫结合直接法或免疫沉淀分离法来测定血清或血浆中脂蛋白残粒(RLP)浓度，作为临床判断动脉粥样硬化性疾病和冠心病以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病程度及疗效评估、预后判断的参考依据。
文档编号G01N33/68GK1880956SQ20061002392
公开日2006年12月20日 申请日期2006年2月17日 优先权日2006年2月17日
发明者刘颖冰, 朱剑锋, 刘颖成, 刘中令 申请人:上海北加生化试剂有限公司, 刘颖冰, 朱剑锋, 刘颖成, 刘中令