专利名称：一种造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法
技术领域：
本发明涉及石蜡切片的制作技术领域，具体涉及一种造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法。
背景技术：
珊瑚礁生态系统是地球上生产力最高的生态系统之一，为四分之一的海洋生物提供了栖息场所，在海洋生态系统中不可替代。由于全球气候变化，海洋污染加剧，过渡的海洋渔业破坏及敌害生物的大规模爆发，世界范围内珊瑚礁发生迅速退化，世界珊瑚礁面积急剧较少。因此，在珊瑚礁生态系统的研究中，珊瑚礁生态系统的重建和人工修复是该生态领域的研究热点。造礁石珊瑚作为形成珊瑚礁生态系统的主要造礁生物和三维结构构建者，造礁石珊瑚的增殖在珊瑚礁生态系统重建和修复过程中扮演着极为重要的角色。造礁石珊瑚增殖方式有性繁殖和无性繁殖，造礁石珊瑚的有性繁殖方式为主要繁殖方式。造礁石珊瑚的有性繁殖主要方式为排放精卵进行体外受精，但是造礁珊瑚排卵周期长(1年左右)，排放精卵时间短(1周以内)，并在不同海域排卵时间存在明显差异。因此，预测造礁珊瑚排卵时间是珊瑚礁生态系统重建和人工修复的重要基础性工作。准确了解造礁珊瑚卵母细胞的发育状态，是进行保护和恢复珊瑚礁生态系统的重要科学依据。国际常规监测造礁石珊瑚卵母细胞发育程度方法是水下取造礁石珊瑚断枝，依据其断面卵母细胞发育的颜色和大小判断卵母细胞发育的程度，从而推断其排卵时间。该方法在浪大流急等海况时整个水下操作过程会十分困难。水下操作者的经验不同，在进行造礁石珊瑚卵母细胞发育程度判断时会存在各种差异，最终造成预测造礁石珊瑚排卵时间的不准确。同时也易由于水下亮度和海水折射等不确定因素影响水下操作者对造礁石珊瑚卵母细胞颜色的判断，最终影响对造礁石珊瑚排卵时间的预测。

发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种利用石蜡切片技术研究造礁石珊瑚卵母细胞发育过程并检测造礁石珊瑚卵母细胞发育程度的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，包括如下步骤(1)在海底采集含有造礁石珊瑚卵母细胞的健康珊瑚；(2)固定；(3)脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼；(4)脱去组织中的水分；(5)将组织透明化；(6)将石蜡浸入组织为切片做准备；(7)切片并修正；(8) 将切片固定在载玻片上；(9)脱去切片上的石蜡；(10)染色；(11)脱水、封片。作为一种优选方案，步骤(1)中所述造礁石珊瑚为直径大于20cm的珊瑚块，健康程度较好，且无发白变色现象。作为一种优选方案，步骤(2)中所述固定是用浓度为3. 5^4. 5%的海水甲醛固定。作为一种优选方案，步骤(3)中所述脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼是将固定完成的造礁石珊瑚样品用纯水冲洗数次，然后用45飞5%的甲酸溶液脱钙，脱钙时间为对、他。作为一种优选方案，步骤(4)中所述脱去组织中的水分是用乙醇按照从低浓度到高浓度的顺序进行脱水，依次为50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水乙醇，每次IH使用乙醇是因为乙醇既能与水相混合，又能与有机溶剂相溶；用梯度酒精脱水时为了减少生物组织的急剧收缩的问题。如果不能一次性完成整个脱水步骤，可以将样品暂时保存在70%的乙醇中。作为一种优选方案，由于无水乙醇不能与石蜡相溶，所以需要能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液置换出生物组织中的乙醇，使组织透明，所以步骤(5)中将组织透明化是将组织在1:1的乙醇和二甲苯预混液中浸渍广2h，再将组织放入100% 二甲苯中浸渍25 35min。作为一种优选方案，步骤(6)用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡(溶点和二甲苯的等量混合液浸渍广2h，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍池左右，浸蜡应在高于石蜡熔点57飞0°C左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中(摆好在蜡中的位置)，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。作为一种优选方案，步骤(7)将包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为7、微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔活牙签轻托轻放在纸上。作为一种优选方案，步骤(8)用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带(连续切片)或用刀片断开成单个蜡片于温水(45°C左右)中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45°C温箱中干燥，也可在37°C 温箱中干燥，但需适当延长时间。作为一种优选方案，干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。 步骤(9 )用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。作为一种优选方案，染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。步骤(10)使用苏木精和伊红进行染色。苏木精和伊红染色(H-E染色)是一种经典的染色，也可使用其他染色方法，但是H-E染色试剂较易获得，染色方法经典常用，对于一般操作人员来讲是一种简便易学的染色方法。作为一种优选方案，染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在 95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量(广2滴)中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本专利为提出一个较新的检测造礁石珊瑚卵母细胞发育程度方法，较原有的通过水下观察造礁石珊瑚断面方法检测造礁石珊瑚卵母细胞发育程度更为精确和科学。比传统技术对观察者要求较低，不需要丰富的潜水和观测成熟度的经验，并且可以制作永久切片的技术为以后检测造礁石珊瑚卵母细胞发育程度提供参照和依据。


图1为佳丽鹿角珊瑚卵母细胞发育的显微镜图，其中，广3是佳丽鹿角珊瑚无性繁殖时内部结构(2006年8月20日)；4 6是佳丽鹿角珊瑚III时相的卵母细胞(2007年1月 20日);7、是佳丽鹿角珊瑚IV时相的卵母细胞(2007年4月20日);N:细胞核；0:卵母细胞；M:隔膜。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1
(1)在鹿回头半岛海底采集含有造礁石珊瑚卵母细胞的健康佳丽鹿角珊瑚断枝3cm， 佳丽鹿角珊瑚个体直径大于20cm，采集样品时间为2007年1月至5月间；
(2)将采集含有卵母细胞的佳丽鹿角珊瑚用4%海水甲醛溶液固定M小时；
(3)使用纯水洗去残留了海水甲醛溶液，再使用50%甲酸溶液脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼，36小时；
(4)脱去组织中的水分是用乙醇按照从低浓度到高浓度的顺序进行脱水，依次为50% 乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水乙醇，每次2h ； (5)将组织透明化是将组织在1:1的乙醇和二甲苯预混液中浸渍1. 5h，再将组织放入100% 二甲苯中浸渍30min。；
(6)将石蜡浸入组织为切片做准备，石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡(溶点和二甲苯的等量混合液浸渍1.证，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍池左右，浸蜡应在高于石蜡熔点57飞0°C左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中(摆好在蜡中的位置)，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀；
(7)将包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔活牙签轻托轻放在纸上；
(8)用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带(连续切片)或用刀片断开成单个蜡片于温水(45°C左右)中展平后，捞至玻片上铺正， 或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45°C温箱中干燥，也可在37°C温箱中干燥，但需适当延长时间；
(9)脱去切片上的石蜡用二甲苯脱蜡，再逐级经依次为无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、 80%乙醇、75%乙醇和50%乙醇，纯水，每次2h ；
(10)使用苏木精和伊红对样品进行染色。苏木精和伊红染色(H-E染色)；
(11)脱水、封片在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量(Γ2滴)中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本。
权利要求
1.一种造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于包括如下步骤(1)在海底采集含有造礁石珊瑚卵母细胞的健康珊瑚；(2)固定；(3)脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼；(4)脱去组织中的水分；(5)将组织透明化；(6)将石蜡浸入组织为切片做准备；(7)切片并修正；(8)将切片固定在载玻片上；(9)脱去切片上的石蜡；(10)染色；(11)脱水、封片。
2.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(1)中所述造礁石珊瑚为直径大于20cm的珊瑚块，且无发白变色现象。
3.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(2)中所述固定是用浓度为3.5^4. 5%的海水甲醛固定。
4.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(3)中所述脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼是用45飞5%的甲酸溶液脱钙，脱钙时间为M、8h。
5.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(4)中所述脱去组织中的水分是用乙醇按照从低浓度到高浓度的顺序进行脱水，依次为50% 乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水乙醇，每次IH
6.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(5)中将组织透明化是将组织在1:1的乙醇和二甲苯预混液中浸渍广2h，再将组织放入 100% 二甲苯中浸渍25 35min。
7.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(8)所述将切片固定在载玻片上是先在载玻片上涂抹蛋白甘油，再将切片放在载玻片上铺正，干燥。
8.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(9)所述脱去切片上的石蜡是用二甲苯脱蜡。
9.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(10)所述染色时使用苏木精和伊红进行染色。
10.根据权利要求1所述造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法，其特征在于步骤(11)所述脱水是用梯度酒精进行脱水；所述封片是用中性树脂进行封片。
全文摘要
本发明一种造礁石珊瑚卵母细胞石蜡切片的制作方法。本发明所述方法步骤如下(1)在海底采集含有造礁石珊瑚卵母细胞的健康珊瑚；(2)固定；(3)脱去造礁石珊瑚的钙质骨骼；(4)脱去组织中的水分；(5)将组织透明化；(6)将石蜡浸入组织为切片做准备；(7)修正切片；(8)将切片固定在载玻片上；(9)脱去切片上的石蜡；(10)染色；(11)脱水、封片。本发明针对造礁石珊瑚石灰质骨骼的特点，应用甲酸脱钙等方法解决了造礁石珊瑚石灰质骨骼不适合石蜡切片的问题，从而为研究造礁石珊瑚卵母细胞发育与预测造礁石珊瑚排卵时间提供准确的技术支持。
文档编号G01N1/28GK102313660SQ20111021058
公开日2012年1月11日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者周国伟, 尤丰, 李元超, 杨剑辉, 练健生, 黄晖 申请人:中国科学院南海海洋研究所