专利名称：：基于静电纺纤维膜的安培酶电极及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及安培酶电极及制备方法，尤其涉及一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极及其制备方法。
背景技术：
：生物传感器主要由两部分构成，即生物敏感膜(又称为分子识别元件)和换能器。被分析物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别、发生生化反应后，所产生的信息被相应的物理或化学换能器转换成可定量处理的电信号，再经检测仪器放大并输出，便可得知待测物浓度。其中生物敏感膜是生物传感器的关键部分，是生物传感器进行选择性检测的基础，决定了传感器的功能与质量，其所含生物组分可以是酶、细菌、酵母、抗体/抗原、脂质体、类脂质体和受体以及它们的不同组合。基于氧化还原酶的电化学传感器一直是生物传感器研究的主流。将酶固定于电极表面，可有效提高电极的pH和储存稳定性，并实现电极的反复使用。固定化酶的性能在很大程度上依赖于载体的性质，如化学组成和微观结构。就微观结构而言，静电纺纳米纤维膜是一种较为理想的酶固定化载体。极大的比表面积、高孔隙率和通孔结构可使纳米纤维膜具有高载酶量和低底物扩散阻力，从而具有较高的固定化酶活性。许多研究者已经尝试将酶固定于静电纺纤维膜上(H.画F.Jia，G.-Y.Zhu，B.Vugrinovich."Enzyme-carryingpolymericnanofiberspreparedviaelectrospinningforuseasuniquebiocatalysts",Biotechnol.Prog.2002，18:1027-1032;T.E.Herricks，S,H.Kim，J.-B.Kim."Directfabricationofenzyme-carryingpolymernanofibersbyelectrospinning",J.Mater.Chem.，2005,15:324.1—3245;Y.-H.Wang,Y.-L.Hsieh."Enzymeimmobilizationtoultra-finecellulosefibersviaamphiphilicpolyethyleneglycolspacers",J.Polym.Sci.PartA:Polym.Chem.，2004,42:42894299;L,L.Wu,X,Y.Yuan,J.Sheng."ImmobilizationofcellulaseinnanofibrousPVAmembranesbyelectrospinning",J.Membr.Sci.,2005，250:167-173)。静电紡纤维膜也被用于制备生物传感器(CN1737560A;K.Sawicka,RGouma,S.Simon.Sens."Electrospunbiocompositenanofibersforureabiosensing"，Sens.ActuatorB-Chem.，2005,108:585-588)。但由于所使用的聚合物为水溶性，纤维膜可能会发生溶胀，从而造成酶的流失，因此电极的稳定性会受到限制。选用水不溶性的聚合物纤维膜可有效地解决这一问题。载体的载酶量是影响传感器响应强度和线性检测范围的重要因素之一。纤维膜虽具有较大的比表面积，但共价法固定酶量仍受纤维表面的反应位点数量限制，单位质量酶膜的活性不高。Kim等将酶聚集体概念引入到纤维表面的酶固定化中，结果表明，其总活性为单层固定化酶膜的1.9倍(B.-C.Kim，S.Nair，J.Kim，J.醫H.Kwak,J.W.Grate，S.H.Kim，M.-B.Gu."Preparationofbiocatalyticnanofiberswithhighactivityandstabilityviaenzymeaggregatecoatingonpolymernanofibers",Nanotechnology，2005,16:MM-MS^o
发明内容本发明的目的是针对传统的固定化酶电极响应低、线性检测范围窄和稳定性不高等缺点，提供一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极及其制备方法。基于静电纺纤维膜的安培酶电极包括基底电极，在基底电极上设有活化层，特征是1)活化层为丙烯腈共聚物纳米纤维膜和共价固定的氧化还原酶聚集体；2)丙烯腈共聚物纳米纤维膜由静电纺丝法制备；3)丙烯腈共聚物中，共聚单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸缩水甘油酯，共聚单体占丙烯腈共聚物摩尔百分数为5%20%，丙烯腈共聚物的粘均分子量为3万10万。所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法包括如下步骤1)将丙烯腈共聚物溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%10%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为520毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为312毫克/毫升，在4°C25°C下振荡活化210小时，然后用缓冲溶液洗涤35次；将活化的电极表面浸入含有110毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4°C25。C下振荡反应324小时后，向氧化还原酶溶液中加入双功能试剂，继续在4。C25。C下反应324小时，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4T下保存待用。基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法包括如下步骤1)将丙烯腈共聚物溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%10%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有110毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4°<:25°(:下振荡反应324小时后，向氧化还原酶溶液中加入双功能试剂，继续在4°C25°C下反应324小时，得到含有马来酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。所述的双功能试剂为l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或戊二醛，l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在酶溶液中的初始浓度为0.12毫克/毫升，戊二醛在酶溶液中的初始体积浓度为0.11%。本发明与现有技术相比具有的有益效果1)所选用的聚合物容易获得，且含有反应性基团；2)酶电极制备方法简单，电极表面的纤维层含有反应性基团，便于酶固定化；3)纤维膜极高的比表面积、高孔隙率、通孔结构和酶的特定固定化方式使得电极具有高的载酶效率和酶活性，从而提高了电极响应，加宽了电极的线性检测范围；同时，电极具有较高的储存稳定性、pH稳定性，可被反复使用810次；4)可适用于制备多种氧化还原酶电极。具体实施例方式以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。实施例11)将丙烯腈共聚物(粘均分子量10万，共聚单体摩尔百分数为5%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极为接收板，当电压为10千伏、挤出速率为0.5毫升/小时、接收距离为10厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续2小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基6碳二亚胺盐酸盐的浓度为5毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为3毫克/毫升，在25。C下振荡活化2小时，然后用缓冲溶液洗涤3次；将活化的电极表面浸入含有1毫克/毫升过氧化氢酶的缓冲溶液，在25°C下振荡反应3小时后，向过氧化氢酶溶液中加入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其在酶溶液的初始浓度为0.1毫克/毫升，继续在4°C下反应3小时，得到含有丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例21)将丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以金电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在25°C下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10亳克/毫升葡萄糖氧化酶酶的缓冲溶液，在4°C下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其在酶溶液中的初始浓度为2.0毫克/毫升，继续在4。C下反应24小时，得到含有甲基丙烯酸的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。实施例31)将丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以玻碳电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在4°<:下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4°C下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入戊二醛，其在酶溶液中的初始体积浓度为0.1%，继续在4°(:下反应24小时，得到含有衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例41)将丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以玻碳电极为接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为20毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为12毫克/毫升，在4T下振荡活化10小时，然后用缓冲溶液洗涤5次；将活化的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4°C下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入戊二醛，其在酶溶液中的初始体积浓度为1%，继续在4°C下反应24小时，得到含有衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例5以辣根过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例6以细胞色素代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例7以胆固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例8以乙醇脱氢酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例9以漆酶葡萄糖氧化酶，其余与实施例4相同。实施例101)将丙烯腈共聚物溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极为接收板，当电压为10千伏、挤出速率为0.5毫升/小时、接收距离为10厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续2小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有1毫克/毫升过氧化氢酶的缓冲溶液，在25°C下振荡反应3小时后，向过氧化氢酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其在酶溶液中的初始浓度为0.1毫克/毫升，继续在4。C下反应3小时，得到含有马来酸酐的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例111)将丙烯腈共聚物(粘均分子量10万，共聚单体摩尔百分数为5%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以金电极接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有10亳克/亳升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4。C下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其在酶溶液中的初始浓度为2毫克/毫升，继续在4°C下反应24小时，得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。实施例121)将丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以金电极接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在40C下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入戊二醛，其在酶溶液中的初始浓度为0.1%，继续在4。C下反应24小时，得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，4T下保存待用。实施例131)将丙烯腈共聚物(粘均分子量3万，共聚单体摩尔百分数为20%)溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为10%的丙烯腈共聚物溶液；以玻碳电极接收板，当电压为20千伏、挤出速率为3.0毫升/小时、接收距离为20厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续10小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的缓冲溶液，在4T下振荡反应24小时后，向葡萄糖氧化酶溶液中加入戊二醛，其在酶溶液中的初始浓度为1%，继续在4°C下反应24小时，得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，4eC下保存待用。实施例14以辣根过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例11相同。实施例15以细胞色素代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例11相同。实施例16以胆固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例11相同。实施例17以乙醇脱氢酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例ll相同。实施例18以漆酶葡萄糖氧化酶，其余与实施例ll相同。本发明部分实例制备的葡萄糖氧化酶电极参数见表1。表1制备的葡萄糖氧化酶电极参数<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极，包括基底电极，在基底电极上设有活化层，其特征是1)活化层为丙烯腈共聚物纳米纤维膜和共价固定的氧化还原酶聚集体；2)丙烯腈共聚物纳米纤维膜由静电纺丝法制备；3)丙烯腈共聚物中，共聚单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸缩水甘油酯，共聚单体占丙烯腈共聚物摩尔百分数为5％～20％，丙烯腈共聚物的粘均分子量为3万～10万。2.如权利要求1所述的一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极，其特征在于所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。3.—种如权利要求1所述的基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将丙烯腈共聚物溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%10%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为520毫克/毫升，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为320毫克/毫升，在4。C25。C下振荡活化210小时，然后用缓冲溶液洗涤35次；将活化的电极表面浸入含有110毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4。C25。C下振荡反应324小时后，向氧化还原酶溶液中加入双功能试剂，继续在4°025°<:下反应324小时，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纤维表面固定酶的电极，4。C下保存待用。4.一种如权利要求1所述的基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将丙烯腈共聚物溶解于二甲基甲酰胺中，配制成质量分数为3%10%的丙烯腈共聚物溶液；以铂电极、金电极或玻碳电极为接收板，当电压为1020千伏、挤出速率为0.53.0毫升/小时、接收距离为1020厘米时收集纤维膜，纺丝时间持续210小时，得到沉积有纳米纤维膜的电极；2)将沉积有纳米纤维膜的电极表面浸入含有110毫克/毫升氧化还原酶的缓冲溶液，在4°C25°C下振荡反应324小时后，向氧化还原酶溶液中加入双功能试剂，继续在4°C25°C下反应324小时，得到含有马来酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纤维表面固定酶的电极，4°C下保存待用。5.如权利要求3或4所述的一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法，其特征在于所述的氧化还原酶为过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇脱氢酶或漆酶。6.如权利要求3或4所述的一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极的制备方法，其特征在于所述的双功能试剂为l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或戊二醛，l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在酶溶液中的初始浓度为0.12毫克/毫升，戊二醛在酶溶液中的初始体积浓度为0.11%。全文摘要本发明公开了一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极及其制备方法。以二甲基甲酰胺为溶剂，铂电极、金电极、玻碳电极或碳糊电极为接受电极，丙烯腈共聚物为原料，通过静电纺丝法在电极表面沉积共聚物纤维膜层。先通过共价法在纤维表面构建单层的氧化还原酶，然后向酶溶液中加双功能试剂，使酶聚集体共价固定于电极表面的酶膜。本发明中，纤维膜极大的比表面积、高孔隙率和这种独特的酶固定化方法电化学酶电极具有响应强度大、稳定性高和线性检测范围宽等特点。该酶电极制备方法简单，可反复使用和长期保存，适合批量化生产。文档编号G01N27/327GK101290301SQ200810061689公开日2008年10月22日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者徐志康,王振刚,黄小军申请人:浙江大学