专利名称：一种常见蛋白质的免疫质谱试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质检测技术领域，特别涉及基于抗体与质谱技术用于对生物样品中蛋白质分析的试剂盒制备方法。
背景技术：
不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用抗体和质谱联合可克服这一技术缺点。免疫质谱(IMS)的概念是利用磁珠等将血清样本中的相关蛋白质固定在磁珠表面的特异性抗体上，通过洗提液获取目的蛋白质并点样于钢芯片上，由蛋白指纹图谱仪 (质谱仪)以图谱形式读取钢芯片上的样本所含蛋白信息(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007,27 ) :134-142)。传统用于蛋白质检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术。ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法，因而无法直接鉴定抗原的变异。举例讲，β 2微球蛋白的检测试剂盒制备方法为先将抗β 2微球蛋白抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)， 然后将含β 2微球蛋白的样品(如血清)，加至这个已标有抗β 2微球蛋白抗体的容器中； 这样，β 2微球蛋白就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质。再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗β 2微球蛋白抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出β 2微球蛋白的总含量。这种方法学的缺点是无法测出β2微球蛋白的变异(如β2微球蛋白的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，β 2微球蛋白被甲基，酰基等修饰，β 2微球蛋白的异构体)。即通常被用于传统检测β2微球蛋白试验是检测所谓的总β2微球蛋白，而不是β2微球蛋白变异或β2微球蛋白亚单位等浓度。传统β2微球蛋白检测试剂盒无法同时检测差别性的 β 2微球蛋白异构体。目前在进行蛋白质质谱分析时还缺乏标准化、优化的免疫质谱试剂盒。在临床工作中发现有相当比例的蛋白异构体无法检测，这对于患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。

发明内容
科学上把含有6. 02Xl(f3个微粒的集体作为一个单位，叫摩尔或摩。摩尔是表示物质的量(符号是η)的单位，简称为摩，单位符号是moleOiiol)。Imol的碳原子含 6. 02 Xl(f3个碳原子，质量为12g。Imol的硫原子含6. 02 X IOm个硫原子，质量为32g，同理，1摩任何原子的质量都是以克为单位，数值上等于该种原子的相对原子质量。同样我们可以推算出，1摩任何物质的质量，都是以克为单位，数值上等于该种物质的分子量。水的分子量是18，Imol的质量为18g，含6. 02 X IO23个水分子。通常把Imol物质的质量，叫做该物质的摩尔质量(符号是M)，摩尔质量的单位是克/摩(符号是“g/mol”)例如，水的摩尔质量为18g/mol，写成M(H2O) = 18g/mol。等质量(或重量)的不同的原子或分子，其摩任数不同；如12g的碳原子和12g的硫原子的摩任数不同。等摩任的不同的原子或分子， 其数量相同；如Imol的碳原子和Imol的硫原子的原子数量相同，均为6.原子。
本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测九种蛋白质(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、0 2微球蛋白、转铁蛋白、补体03^或1^6、hCG-α、hCG-β、载脂蛋白C亚基标志物)的免疫质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为早期检测疾病提供了新的途径，并为进一步发现新的标志提供了基础。常见蛋白质的免疫质谱试剂盒(蛋白指纹法)采用磁珠-多种已知等摩尔抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体 C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、载脂蛋白C亚基的抗体)特异性结合血清中的疾病相关标志物 (转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、 载脂蛋白C亚基)；用等摩尔抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠用比等重量或等量(如等Pg)抗体组(转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、 或hCG、hCG-a、hCG-β、载脂蛋白C亚基的抗体)标记的磁珠更好。等摩尔抗体的结合蛋白质或抗原的位点是一致的或相等的；而等重量(如等Pg)抗体，由于每种或每个抗体的重量不同，故等重量抗体(如每种抗体糖基化的量不同、故重量不同)结合蛋白质或抗原的位点数不一定相等的，造成结合力不均勻。本试剂盒适用于常见心血管疾病、异位妊娠等高危人群的筛查、对无症状人群进行普查、预测预后和追踪疾病的复发；可作为常见心血管疾病、异位妊娠等早期辅助诊断、预测预后和追踪疾病的复发。本发明提出的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括—小管含质控品，含九种等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、载脂蛋白C亚基的质谱标准化质控血清(浆)，10 30μ 1 ；一小管含等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG- α、hCG- β、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠30 50 μ 1 ；一小管粘合液300 500 μ 1，该粘合液为50 IOOmM PBS, ρΗ值为7. 0 7. 4 ；一小管清洗液10 50 μ 1，该清洗液为dH20溶液；一小管洗提液10 50 μ 1，该洗提液为1 5%三氟乙酸的水溶液；一小管稳定剂(能量吸收分子饱和溶液)5 10 μ 1，该溶液由能量吸收分子溶解在含30 60%乙腈和0. 5 1 %三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4 8°C冷藏盒中。本发明提出的上述试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)质谱标准化质控血清(浆)的制备将男性、女性等量的0型血清(浆)稀释在缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10 30 μ 1 小管中；加入等摩尔九种标准蛋白质转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a , hCG- β、载脂蛋白C亚基；2)制备含九种等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG-α、hCG-β、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠将转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、0 2微球蛋白、转铁蛋白、补体03￡1、或1^6、1^6-(1 ,hCG-β、载脂蛋白C亚基免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备； 将购买的蛋白A-磁珠(Protein A-磁珠)或蛋白G-磁珠(Protein G-磁珠)30 50 μ 1 标记上等摩尔的抗体；3)将购买的 50 IOOmM PBS (Phosphate-Buffered Saline)，pH 值为 7. 0 7. 4 缓冲液、1 5%三氟乙酸的洗脱液分别分装成300 500 μ 1小管和10 50 μ 1小管；4)将能量吸收分子溶解30 60%乙腈和0. 5 1 %三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5 10 μ 1小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；5)将上述分装好的各小管置于4 8°C冷藏箱中。本发明还提出所述的试剂盒对常见心血管疾病、异位妊娠等高危人群的筛查的应用。所述的检测试剂盒对常见心血管疾病、异位妊娠等高危人群判断为
[002权利要求
1.一种检测常见蛋白质的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括一小管含质控品，含九种等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、载脂蛋白C亚基等标准蛋白质的质谱标准化质控血清 (浆)，10 30 μ 1 ；一小管含等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体 C3a、或hCG、hCG- α、hCG- β、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠30 50 μ 1 ；一小管粘合液300 500 μ 1，该粘合液为50 IOOmM PBS, ρΗ值为7. 0 7. 4 ；一小管清洗液10 50 μ 1，该清洗液为dH20溶液；一小管洗提液10 50 μ 1，该洗提液为1 5%三氟乙酸的水溶液；一小管稳定剂(能量吸收分子饱和溶液)5 10 μ 1，该溶液由能量吸收分子溶解在含 30 60%乙腈和0. 5 三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4 8°C冷藏盒中。
2.如权利要求1所述的免疫质谱试剂盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种。
3.一种制备如权利要求1所述的免疫质谱试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)质谱标准化质控血清(浆)的制备将男性、女性等量的0型血清(浆)稀释在缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10 30 μ 1 小管中；加入等摩尔九种标准转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2微球蛋白、转铁蛋白、补体 〇3&、或1^6、1^6-0 , hCG- β、载脂蛋白C亚基；2)制备含九种等摩尔转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、 或hCG、hCG_a、hCG_i3、载脂蛋白C亚基抗体的磁珠将转甲状腺素蛋白、载脂蛋白Α、β 2 微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG_a ,hCG-β、载脂蛋白C亚基免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的蛋白A-磁珠(Protein A-磁珠)或蛋白G-磁珠(Protein G-磁珠)30 50 μ 1标记上等摩尔的抗体；3)将购买的50 IOOmM PBS (Phosphate-Buffered Saline)，pH 值为 7· 0 7· 4 缓冲液、1 5%三氟乙酸的洗脱液分别分装成300 500 μ 1小管和10 50 μ 1小管；4)将能量吸收分子溶解30 60%乙腈和0.5 三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5 10 μ 1小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、 二羟基苯甲酸之中的任一种；5)将上述分装好的各小管置于4 8°C冷藏箱中。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁珠可用C8及C18疏水基质、WCX基质、或IMAC基质之中的任一种。
5.一种如权利要求1所述免疫质谱试剂盒对离体生物样品(包含，但不限于体液、血液、尿液等)的应用。
全文摘要
本发明涉及一种常见蛋白质的免疫质谱试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测技术领域，该试剂盒包括一小管含等摩尔标准蛋白质的质控品；一小管含等摩尔标记的转甲状腺素蛋白、载脂蛋白A、β2微球蛋白、转铁蛋白、补体C3a、或hCG、hCG-α、hCG-β、载脂蛋白C亚基的抗体的磁珠；一小管粘合液；一小管清洗液；一小管洗提液；一小管稳定剂；上述各小管置于4～8℃冷藏盒中。本发明可用于体外生物样品检测和预后判断的免疫质谱试剂盒。本方法比等重量标记抗体的免疫质谱试剂盒更准确、更优化。
文档编号G01N33/68GK102375063SQ201010259888
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者许洋 申请人:湖州赛尔迪生物医药科技有限公司