专利名称：一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法
一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法技术领域
一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，属于分析化学领域，同时也涉及水环境污染物的检测技术领域。本发明设计先将样品氧化后经氯甲酸甲酯甲酯化反应，最后由氯仿萃取，对微囊藻毒素的总量进行测定。
背景技术：
微囊藻毒素是一类具有生物活性的环状七肽毒素，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用，它不仅对水生生物产生毒害作用，还可能通过饮用水和食物链的生物富集危害人类健康。世界各地由藻毒素引起的鸟类、鱼类、家畜中毒事件频繁发生，流行病学调查显示，在我国原发性肝癌与饮用水水源中微囊藻毒素的高本底含量相关。因此，世界卫生组织推荐的饮用水中藻毒素以MC-LR代表的标准值为1. 0 μ g/L。藻毒素毒性与MC-LR毒性相似，藻毒素种类繁多，已发现超过七十种。
目前微囊藻毒素的检测方法很多，化学分析检测包括薄层色谱法(TLC)，气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC-MQ，免疫检测有酶联免疫测定法 (ELISA)及生物化学检测有蛋白磷酸酶抑制法。然而受到商品化标准品的限制，微囊藻毒素的定量检测往往限于常见三种MC-LR、MC-RR、MC-YR，不能真实地反映出微囊藻毒素总量。 MMPB方法主要基于MC的氨基酸残基Adda的特殊化学性质，可以有效提供所有类型MC (包括结合和非结合)的总量，MMPB未在自然环境中发现，因而可用于定量检测MC。特别在毒性实验中，可以获得更加全面重要的信息。此前，藻毒素总量的测定是在一定条件下，MC分子中的共轭双键氧化生成MMPB，采用液相色谱法检测水中MMPB的含量，或将MMPB衍生化用气相色谱法检测，存在检测灵敏度不够的缺点。本发明主要提供了一种检测MMPB的新方法，较之前的方法操作更便捷。
微囊藻毒素总量测定，采用氯甲酸甲酯对氧化产物甲酯化后进行气相色谱-质谱联用分析的方法尚未见文献报道。发明内容
本发明的目的在于提供了一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，首先浓缩样品并调节PH值至8. 5-9. 5，经高锰酸钾溶液氧化，用亚硫酸氢钠粉末终止反应并酸化，将氧化产物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)加入甲醇，以吡啶作为催化剂经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作为内标物，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的MMPB进行检测。该方法能够有效检测微囊藻毒素的总量 (以MMPB计)，具有良好的灵敏度和重现性，得到的结果令人满意。
本发明的技术方案一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，加入内标的样品经高锰酸钾与高碘酸钠氧化溶液氧化后终止反应，氧化产物经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的MMPB进行检测。步骤为A、取IOOmL水样，加入100μL含1. 0μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40°C下减压浓缩至IOmL ；B、取上述浓缩液0.50-2. 00 mL,用0. 50mol/L K2C03水溶液调节pH值至8. 5-9. 5 ；C、加入25_50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和饱和 NaIO4 水溶液，反应 60-120min ；D、加少量NaHSO3粉末终止反应后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL ；E、取0.5mL上述浓缩液，加入200 μ L甲醇和50 μ L吡啶，摇勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振荡Imin ；最后加入200 μ L氯仿，剧烈振荡后静置5 min,溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为气相色谱条件色谱柱DB-WAX石英弹性毛细管色谱柱，30mX0. 25mmX0. 25μπι ；载气He，纯度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流进样，进样量1 μ L ；进样口温度260°C;柱初始温度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；质谱条件EI源；离子源温度200°C ；传输线温度250°C ；发射电流200 μ A ；检测器电压350V ；电子能量70eV ；选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子定性；根据峰面积计算微囊藻毒素总量(以MMPB计)的浓度。
MMPB和内标物4-苯基丁酸甲酯化产物的保留时间及监测离子见下表化合物保留时间(min)定量离子定性离子丽PB7. 891311904-苯基丁酸6. 95146178MMPB的质量浓度χ(μ g/L)为横坐标，MMPB与内标4-苯基丁酸甲酯化产物的选择离子色谱峰响应面积的比值y为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线为Y=6. 2401Χ+0. 1106。在 2. 0-200 μ g/L范围内线性关系良好，可以满足定量分析要求，方法的检出限(S/N=3)为 0. 56 μ g/L。
本发明的有益效果本发明本方法较以往MC总量测定方法，较大缩短了检测的时间，且检出限和灵敏度更好。在甲酯化的部分，省去了萃取步骤，不仅是方法简单而且减小了实验误差。且相对于用臭氧在_78°C氧化MC的方法而言，本文的反应均在室温下进行，更有利于推广到实际环境监测中MC的总量检测。


图1天然水样加标处理后得到MMPB与内标甲酯化产物的选择离子色谱图。
具体实施方式
实施例1 1、取IOOmL水样，加入100μ L含1 μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40°C下减压浓缩至IOmL ；2、取上述浓缩液0.50mL,用0. 5 mol/L K2CO3水溶液调节pH值至8. 5 ；3、加入25μ L的0. 025 mol/L KMnO4和饱和NaIO4水溶液，反应60min ；4、加少量NaHSO3粉末终止反应后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL ；5、取0. 5mL上述浓缩液，加入200 μ L甲醇和100 μ L吡啶，摇勻后加入50 μ L氯甲酸甲酯，振荡Imin ；最后加入200 μ L氯仿，剧烈振荡后静置5 min,溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为气相色谱条件色谱柱DB-WAX石英弹性毛细管色谱柱，30mX0. 25mmX0. 25μ m ；载气He，纯度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流进样，进样量1 μ L ；进样口温度260°C;柱初始温度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；质谱条件EI源；离子源温度200°C ；传输线温度250°C ；发射电流200 μ A ；检测器电压350V ；电子能量70eV ；选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子定性；根据峰面积计算微囊藻毒素总量的浓度。
6、标准曲线的绘制，以内标法进行定量测定。
7、样品及回收率的测定采集水样，按以上步骤1-4用高锰酸钾氧化，按步骤5进行甲酯化后，进行气相色谱-质谱联用仪检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到水样中微囊藻毒素的总量。
采用相同水样IOOmL加入2. OmL含250 μ g/L MC-LR水溶液，并按照下式进行回收率计算。
R= (C-C0) XlOOXk / (2. OX 1(Γ3Χ250) X 100%R-回收率，%C-添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，yg/L； Co"未添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，Ug/L； k~等物质量的藻毒素与MMPB换算系数，以4. 34计； 本方法的平均回收率70. 1% 实施例2 1、取IOOmL水样，加入100μ L含1 μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40°C下减压浓缩至IOmL ；2、取上述浓缩液1.00 mL，用0. 5 mol/L K2CO3水溶液调节pH至9. 0 ；3、加入50μ L的0. 025 mol/L KMnO4和饱和NaIO4水溶液，反应80min ；4、加少量NaHSO3粉末终止反应后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL ；5、取0.5mL上述浓缩液，加入100 μ L甲醇和50 μ L吡啶，摇勻；加入100 μ L氯甲酸甲酯，振荡Imin ；最后加入200 μ L氯仿，剧烈振荡后静置5 min,溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为采用GC-MS法检测条件及标准曲线同实施例1。
6、样品及回收率的测定采集水样，按以上步骤1-4用高锰酸钾氧化，按步骤5进行甲酯化后，进行气相色谱-质谱联用仪检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到水样中微囊藻毒素的总量。
采用相同水样IOOmL加入2. OmL含250 μ g/L MC-RR水溶液，并按照下式进行回收率计算。
R= ^C-C0) XlOOXk / (2. OX 1(Γ3Χ250) X 100%R-回收率，%C-添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，yg/L； Co"未添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，Ug/L； k~等物质量的藻毒素与MMPB换算系数，以4. 34计； 本方法的平均回收率75. 3% 实施例3 1、取IOOmL水样，加入100μ L含1 μ g/mL4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40°C下减压浓缩至IOmL ；2、取上述浓缩液2.00 mL，用0. 5 mol/L K2CO3水溶液调节pH至9. 5 ；3、加入50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和饱和 NaIO4 水溶液，反应 120min ；4、加少量NaHSO3粉末终止反应后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL ；5、取0.5mL上述浓缩液，加入IOOyL甲醇和50 μ L吡啶，摇勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振荡Imin ；最后加入200 μ L氯仿，剧烈振荡后静置5 min,溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为采用GC-MS法检测条件及标准曲线同实施例1。
6、样品及回收率的测定采集水样，按以上步骤1-4用高锰酸钾氧化，按步骤5进行甲酯化后，进行气相色谱-质谱联用仪检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到水样中微囊藻毒素的总量。
采用相同水样IOOmL依次加入1. OmL含250 μ g/L MC-LR水溶液和3. OmL含 250yg/L MC-RR，并按照下式进行回收率计算。
R= (C-C0) XkXlOO/ (1. 0X IO-3X250+3. 0X IO-3X250) X 100%R-回收率，%C-添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，μ g/L； Co"未添加标准溶液水样的藻毒素含量(以MMPB计)，μ g/L； k~等物质量的藻毒素与MMPB换算系数，以4. 34计； 本方法的平均回收率79. 6%上述实施例仅供说明发明之用，而不是对本发明的限定，任何对本发明简单变化后的方案均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，其特征在于加入内标的样品经氧化后加入甲醇，在吡啶催化下，经氯甲酸甲酯甲酯化反应后，用氯仿萃取， 氯仿层直接用于气相色谱-质谱分析；该方法依次包括以下步骤A、取IOOmL水样，加入IOOyL含1μ g/mL 4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40°C下减压浓缩至IOmL ；B、取上述浓缩液0.50-2. 00 mL,用0. 5 mol/L K2CO3水溶液调节pH值至8. 5-9. 5 ；C、加入25_50 μ L 的 0. 025 mol/L KMnO4 和饱和 NaIO4 水溶液，反应 60-120min ；D、加少量NaHSO3粉末终止反应后，用10mol/L H2SO4溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL ；E、取0.5mL上述浓缩液，加入200μ L甲醇和50 μ L吡啶，摇勻；加入50 μ L氯甲酸甲酯，振荡Imin ；最后加入200 μ L氯仿，剧烈振荡后静置5 min,溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为气相色谱条件色谱柱DB-WAX石英弹性毛细管色谱柱，30mX0. 25mmX0. 25μ m ；载气He，纯度彡99. 999% ；流速lmL/min ；不分流进样，进样量1 μ L ；进样口温度260°C;柱初始温度 100°C，以 15°C /min 升至 230°C，保持 ^iin ；质谱条件EI源；离子源温度200°C ；传输线温度250°C ；发射电流200 μ A ；检测器电压350V ；电子能量70eV ；选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子定性；根据峰面积计算微囊藻毒素总量以MMPB计的浓度。
2.根据权利要求1所述水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，其特征在于进行检测的水体为自然水体或饮用水。
全文摘要
本发明提供了一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，属于分析化学领域，同时也涉及水环境污染物的检测技术领域。本发明步骤包括浓缩样品并调节pH值至8.5-9.5，经高锰酸钾溶液氧化，用亚硫酸氢钠粉末终止反应后酸化，将氧化产物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)加入甲醇，以吡啶作为催化剂经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作为内标物，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的MMPB进行检测。该方法能够有效检测微囊藻毒素的总量，具有良好的灵敏度和重现性，得到的结果令人满意。
文档编号G01N30/02GK102520086SQ201110419988
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者吴胜芳, 宋启军, 徐夏叶, 武铄, 王利平, 虞锐鹏, 陶冠军 申请人:江南大学