专利名称：分析结合相互作用的方法
分析结合相互作用的方法
1.导言
配体与其同源结合配偶体的结合相互作用对于许多化学和生物过程
是关键的。例如，生物大分子之间的相互作用，诸如在蛋白和DNA之间或在一种蛋白与另一种蛋白之间的相互作用，形成控制细胞发育和细胞活性的关键调控网络。对于一些结合相互作用，诸如在配体与其相对应的细胞受体之间的相互作用，由于受体占据的时间可以调节相对应的生物反应的强度，所以需要确定在所述受体与配体之间的相互作用的强度。更复杂的结合相互作用，诸如结合位点之间的协同性，可以精确地调节相继发生的生物事件。例如，噬菌体X的溶解和溶原期之间的确定部分取决于人阻抑蛋白"的活性，c/协同性结合三重阻抑蛋白结合位点。因为cl阻抑蛋白与其操纵子位点结合的协同性质，在阻抑蛋白水平上的较小变化可能引
发噬菌体从溶原模式进入溶解模式，反之亦然。因此，理解复合物结合现象，诸如协同和别构结合相互作用，可以辅助研究生物系统怎样调节某些过程。
可以利用许多不同的方法来确定相互作用的分子之间的结合特征。一种常见的基于溶液的方法是平衡透析，其是通过对受体不能渗透但对配体能渗透的膜将受体成分截留的一种技术。标记的配体用来确定在不同配体浓度下与受体结合的配体的量，其可以为估算平衡结合常数、关于该配体的相互作用位点的数目、以及存在或不存在协同相互作用提供充分的信息。研究结合相互作用的其它方法包括层析和沉降分析。层析方法检验当混合物在层析介质(例如，分子筛)中分离时相互作用混合物的洗脱行为，而沉降分析检验当经受高离心力时混合物的平衡沉降行为。在一些情形中，光谱技术提供另一种分析方法，在光谱技术中，游离和结合成分的吸附和/或放射特征是可区分的。使用光谱技术的实例是用于检测一种多核苷酸与另一种多核苷酸退火/变性的增色性改变，以及在附着到相互作用的分子上的供体和受体发色团之间的荧光共振能量跃迁(FRET)。尽管前述技术可以产生分子间相互作用的有效测量，但是这些技术可能需要显著量的用于分析的样品，其可能不适合研究这样的相互作用，即其中结合和受体成分是不容易利用的或其中必须评估大量的结合相互作用。光谱技术还限于具有必要的光谱特征的分子。如果光谱技术使用可检测的标记，则相互作用成分必须进行适当的标记，如果被标记的成分的结合活性对所述修饰是敏感的，那么这可能是成问题的。
确定两个相互作用的分子之间的结合特征的更灵敏的技术利用将一个相互作用的分子附着到表面上，并且检测与配体和表面结合分子的结合有关的信号。尽管配体或受体可以用可检测的标记进行标记，以用于检测结合的复合物，但是在结合事件的检测依赖于表面物质的可测量性质的改变的情形中，可能要避免标记。这样的性质的实例特别包括，金层的循环偏振光的反射(即，表面等离子体共振)或电极表面的电传导性(参见，
例如Myszka, D.， 2000,酶学方法(A/"/zoA五"矽mo/.) 323:325-340)。
尽管分析表面上的结合相互作用是灵敏的技术，并且可以简化对结合参数的测量，并且在适当时，避免使用可检测的标记，但是对结合事件的表面影响可能使结合相互作用的分析复杂化。例如，如果相对于结合速率，配体向表面的质量转移是缓慢的，则可能发生在溶液中观察到的关于典型结合特征的背离。此外，结合的受体可能影响与配体的相互作用的动力学，因为它不能自由地扩散，由此添加了偏离溶液行为的另一个因素。
因此，需要找到有效用于检验结合相互作用的备选技术，该备选技术避免使用标记，并且避免表面结合作用同时保持高灵敏性。
2.详述
应该理解，下述详述只是示例性的和解释性的，并且不限制本发明内容。在本发明内容中，除非另外特别指明，单数的使用包括复数。此外，除非另外指明，"或者"的使用意指"和减"。类似地，"包含("comprise,""comprises," "comprising"), 包括("include," "includes,"禾口"including，，)"可以互换，并且不意欲是限制性的。
还应该理解，当许多实施方案的描述使用术语"包括"时，本领域技术人员应该理解，在某些特殊情形中，实施方案可以备选地使用"基本
5由……组成"或"由……组成"的语言进行描述。
本文所用的部分标题只是组织的目的，并不被解释为限制所述的主题。
2.1结合相互作用和用于分析结合相互作用的方法
技术领域：
本发明内容提供分析至少两种成分在溶液中的结合相互作用的方法。 本发明的方法是基于检测和区分结合混合物中的各种成分的能力，其通过 将混合物通过检测区并且定量在所述混合物中存在的各种未结合的和结 合的形式来进行。在本发明的实施方案中，检测区是孔或通道部分，相互 作用的成分通过其进行转移。基于所述未结合的和结合的成分的可检测特 征的区别，可以确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数目。这种 测量为评估结合相互作用的多种参数提供充分的信息，结合相互作用的参 数诸如平衡结合常数、缔合和解离速率、以及在受体成分上的多个位点之 间的相互作用。因为结合相互作用是在溶液中而不是在表面上进行，该方 法避免了与在表面上进行的结合反应有关的复杂性。
通常，分析结合相互作用的方法包括使一种或多种结合成分和受体成 分在溶液中接触，其中未结合的和任何结合的成分能够通过孔转移。在形 成复合物后，混合物中的成分通过适当尺寸的孔转移，并且使用适当的检 测技术进行检测，如下文进一步所述。在不同实施方案中，孔包括用于检 测通过该孔转移的成分的检测区。如果与每种成分相关的检测的信号模式 与关于所述结合混合物中其它成分所观察到的信号模式是可区分的，则可 以对混合物中不同的成分进行定量。反映结合相互作用的不同参数可以通 过确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数目而进行估算。
当用于本发明时，"结合相互作用"是指在一个成分和另一个成分之间 的任何物理缔合。相互作用可以包括共价相互作用和非共价相互作用。非 共价相互作用可以特别包括疏水相互作用，偶极-偶极相互作用，范德华力, 氢键键合，离子相互作用，以及它们的组合。相互作用成分可以是任何分 子或组合物。"特异性"结合相互作用是指结合成分对受体分子上固定特 异性相互作用位点的结合，以致所述相互作用表现出可饱和的结合行为。 通常，相互作用位点被50%饱和的结合成分的浓度称为平衡结合常数Keq。
6平衡结合常数的倒数是平衡解离常数(K^或Kds)。关于特异性相互作用的
Kds可以在约10—2M或更低,约10—4m或更低，10—7m或更低，或10—^m或 更低，或约10—"m或更低。除了特异性结合相互作用之外， 一些结合相互 作用本质上是非特异性的。当用于本发明时,"非特异性"相互作用是指这 样的结合相互作用，即，其中结合成分与受体成分的结合与结合成分的浓 度成线性比例，并且因此在观察到特异性结合位点的饱和的条件下不显示 出可饱和的结合。结合相互作用可以包括特异性和非特异性相互作用的混 合。
术语"结合成分"是指能够与处于结合相互作用中的受体成分缔合的 任何化合物或组合物。所述结合成分可以包括，通过举例而非限制的方式， 小的有机分子配体；多肽和多肽类似物；核碱基(nucleobase)聚合物，诸如 多核苷酸和多核苷酸类似物；碳水化合物，诸如单糖，寡糖，和多糖；以 及脂质和相关的脂肪酸。在一些实施方案中，所述结合成分可以是单个的 分子，诸如单个的蛋白或寡核苷酸，或包括一起形成结合成分的分子的复 合物。结合成分复合物的实例特别包括蛋白-蛋白，小分子-蛋白，碳水化 合物-蛋白，蛋白-多核苷酸，和小分子-核碱基聚合物复合物。例如，已知 DNA结合蛋白二聚体化以形成能够结合多核苷酸上的特异性序列的活性 DNA结合复合物。
术语"受体成分"是指能够与处于结合相互作用中的结合成分缔合的 任何化合物或组合物。所述受体成分可以包括小的有机分子；多肽和多肽 类似物；核碱基聚合物，诸如多核苷酸和多核苷酸类似物；碳水化合物， 诸如单糖，寡糖，和多糖；以及脂质和相关的脂肪酸。在一些实施方案中, 所述受体成分可以是单个的分子，诸如单个的蛋白或寡核苷酸，或包括一 起形成受体成分的分子的复合物。受体成分复合物的实例特别包括蛋白-蛋白，小分子-蛋白，碳水化合物-蛋白，蛋白-多核苷酸，和小分子-多核苷 酸复合物。例如，雌激素受体包括a和卩亚基的二聚体，并且因此可以形 成不同的受体亚型，其包括oux， PP和(xP二聚体。不同的结合和受体成分 在下文描述。
术语"相互作用位点"是指在受体成分上能够与结合成分相互作用的 任何位点。在一些实施方案中，所述相互作用位点可以在受体成分的表面
7上、或内部部分，对溶液是可及的或不可及的。尽管在一些实施方案中， 结合相互作用使所述相互作用位点对溶液可及性成为必要的，但是不可及 的相互作用位点可以通过其它结合成分(例如，别构化合物)的作用而变 得对溶液是可及的。相互作用位点可以存在于单个受体成分上，或者通过 形成受体成分复合物而产生。在不同实施方案中，在受体成分上存在的相 互作用位点的数目可以是一个或多于一个，如下文进一步所述。
应该理解，将一种成分描述为结合或受体成分不是意欲限制，因为在 一些情形中，结合成分可以描述为受体成分，并且反之亦然。
当结合成分与受体成分接触时，混合物可以包括未结合的成分，并且 当结合相互作用发生时，包括结合的成分。"未结合的成分"是指不与其 它成分结合的结合成分或受体成分。因此，未结合的成分是自由存在于溶 液中的结合成分和受体成分。"结合的成分"是指与受体成分物理相互作 用或缔合由此采用复合物形式的结合成分。
已经表征和描述了不同类型的结合相互作用。在结合成分(L)和受体成 分(M)之间的结合相互作用，其中在所述受体成分上存在单一的相互作用 位点，可以通过下述反应描述
在上述结合相互作用中，M和丄表示未结合的成分，而7kfc表示结合 的成分。对于该反应的平衡结合常数表示为
^ 岡 《岡丄]
解离常数，即Kds，是Keq的倒数。对于具有单个相互作用位点的受 体成分，饱和分数Y，是被结合成分饱和的受体成分的分数
F二
8饱和分数可以关于解离常数表示如下
y 二
必
因此，确定结合的成分的浓度或未结合的结合成分和/或未结合的受体 成分的浓度可以为确定关于包括单个相互作用位点的结合相互作用的解
离常数提供充分的信息。这种反应类型通常叫作朗缪尔等温线(Z^"gm^ ^oAem7)。当受体成分被结合成分半饱和时，结合成分的浓度等于解离常 数Kds。
对于在受体成分上存在多于一个相互作用位点并且相互作用位点不 影响在其它相互作用位点的结合的结合相互作用，结合相互作用可以关于 v进行描述，其表示每摩尔受体成分结合的结合成分摩尔数。对于具有n个 数目的相互作用位点、每个位点具有相同Kds的受体成分，结合相互作用可 以总结为下述
v二啦]
上述方程不解释其中第一结合成分与受体成分的一个位点的结合改 变第二结合成分与第二相互作用位点的结合的相互作用。在相互作用位点 之间的这样的联系特别包括协同相互作用和别构调控。当用于本发明时, "协同相互作用"和"别构调控"是指第一结合成分与在受体成分上的第一 相互作用位点的结合和其对第二结合成分与第二相互作用位点的结合的 影响。协同相互作用是特有的别构调控形式，并且是指受体成分对结合成 分的亲和力的改变，其中亲和力的改变取决于已经与受体成分结合的结合 成分的数量。在第一结合成分的结合导致第二相互作用位点对与第二结合 成分结合的更高的亲和力的情形中，存在正向协同性。当第一结合成分的 结合导致第二相互作用位点对与第二结合成分结合的更低的亲和力的情 形中，存在负向协同作用。在一些实施方案中，协同相互作用可以表示为
下述反应其中"是在受体成分M上的相互作用位点的数目。对于该反应的平均平衡 结合常数为
f [司
对于其中存在无限的协同性的反应，v值，即每摩尔受体成分的结合 的结合成分摩尔数，可以表示如下
由于饱和分数y为r=v/ ，所以上式减少为
其中a^ = 如上所示，前述方程基于无穷大的协同性。对于较少1 同性的系统，结合相互作用可以经验性地描述如下
l
^ ，'
l+，
其中^叫作希尔系数。希尔系数描述协同的程度，其中i的值表示无协同
性，并且n (结合的配体的总数)的"j直表示无穷大的协同性。>1的 值表示负向协同性，而<1的"j直表示正向协同性。
如由不同结合相互作用的描述所提议的，结合参数可以通过确定按受 体成分数目计的结合的结合成分的数目而获得。这可以通过确定反应混合 物中未结合的配体、未结合的受体成分、和/或结合的成分的浓度而进行。 在一些实施方案中，确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数目在 不同浓度的结合成分和受体成分下进行。在其它实施方案中，确定按受体 成分的数目计的结合的结合成分的数目在不同浓度的结合成分和恒定(即，相同)浓度的受体成分下进行。例如，可以向系统中加入增加浓度 的结合成分，以确定平衡结合常数。低浓度处于K&范围内，而高浓度要 高得多，并且接近结合位点的饱和。因此，结合浓度测量的范围通常跨越 几个数量级。在反应中使用不同浓度的一种成分的示例性确定K&的方法 表示为下述方程
如上，/"vl^/是在不同浓度的结合成分/X/r和在固定浓度的受体成分 /"M^下的结合成分的浓度。通过确定在不同浓度的[L]下按受体成分的数 目计的结合的结合成分的数目，可以测量结合的成分[ML]的浓度，由此允 许计算KA。
在一些实施方案中，结合动力学，诸如缔合速率常数^J和解离速率 常数化^也可以利用本发明的方法检验。例如，结合反应的缔合阶段可以 通过可以快速混合结合成分和受体成分进行估算，诸如通过将所述成分分 别注射到具有检测区的处于流体交换的混合室中进行。然后，将所述混合 物通过孔和检测区转移，以确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的 数目。计数在获得平衡之前随时间形成的复合物的数目，可以用来确定缔 合速率常数。对于包括具有单个相互作用位点的受体成分的反应，缔合动 力学可以表示为
其中《—MZ7/A是作为时间的函数的结合的成分的数目的变化。在时间f， /7W/表示为/M^/ — /MZ/。然后，缔合速率可以表示如下
W/p^/—卿；-
测量从混合到接近或达到平衡值[ML]的点所需要的时间可以用来确 定缔合速率常数。为了简化所述测量并且减少解离的影响，测量可以在可 以忽略解离诸如在形成显著量的[ML]复合物之前的条件下进行。在M和L
ii表示不相同的成分的情形中，确定缔合速率常数可以通过下述进行简化:(1)混合M和L，并且估算在不同浓度的M和L下的初始速率，(2)在其
中[M] = [L]的条件下进行实验，由此模拟同源二聚体化反应，或(3)测量在[L]处于大量过剩的[M]中以致[L]不随时间显著改变的情形中的速率。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用来确定解离速率常数。例如，可以将结合成分和受体成分混合，以允许结合相互作用发生，然后迅速稀释使得结合的结合成分从所述受体成分解离。在其中可以忽略缔合反应的条件下进行实验，诸如在解离的复合物的显著再缔合之前或者在最终稀释
的浓度远低于Keq的条件下测量解离反应，速率方程简化为下述
同样地，作为时间的函数的每数目受体成分结合的结合成分的数目的减少可以用于估算解离速率常数。其它确定速率常数的方法对于熟练的技术人员是显而易见的，并且不限于本发明公开的实施方案。
按照上述，许多结合相互作用可以利用本发明所述的方法进行分析。在一些实施方案中，该方法可以用来检验这样的结合相互作用，即，其中受体成分具有单个相互作用位点(即，当"=1时的相互作用位点的数目")，其基本方程已经在上文描述过。在其它实施方案中，结合相互作用可以包括其中相互作用位点数目"大于1的受体成分。在一些实施方案中，
被检验的结合相互作用可以包括其中相互作用位点数目n是2或更多，4或更多，8或更多，10或更多，以及20或更多的受体成分。在一些实施方案中，结合相互作用可以包括其中相互作用位点n数目大于20的受体成分，诸如小分子与聚合物的结合，例如，嵌入剂与多核苷酸的相互作用。在一些实施方案中，结合相互作用可以包括具有2-10的相互作用位点数目n的受体成分。
在其中相互作用位点数目大于1的一些实施方案中，每个相互作用位点可以包括相等的平衡结合常数。在其中相互作用位点数目大于1的其它实施方案中，至少两个相互作用位点可以包括不同的平衡结合常数。这些相互作用的实例特别包括别构调控的酶和蛋白。在一些情形中，所有的相互作用位点可以具有不同的平衡结合常数，特别是在包括协同相互作用的系统中。在许多生物结合相互作用中观察到协同相互作用，诸如例如，血
红蛋白与其同源配体氧的结合，以及人噬菌体C/阻抑蛋白与其操纵位点的
妙A^口 口 。
在其中受体成分包括多于一个相互作用位点的一些实施方案中，受体成分可以包括至少第一和第二相互作用位点，其中所述第一和第二相互作用位点是不同的。不同的相互作用位点是指，当与第二结合成分的相互作用相比较时，受体成分的与第一结合成分相互作用的不同部分。受体成分包括不同相互作用位点的实施方案特别包括，别构调控的蛋白和结合调控配体以与另一个结合成分结合的蛋白。这种结合类型的许多实例对于熟练的技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，该方法可以用于检验其中结合成分和受体成分是相同成分的结合相互作用。这些结合相互作用是同源结合相互作用。同源相互作用的实例包括，通过举例的方式而不是限制，蛋白亚基的二聚体化或回文多核苷酸序列的退火。
在其它实施方案中，该方法可以用于检验其中结合成分和受体成分不同的结合相互作用。这些结合相互作用是多相或异质相互作用。这种类型的示例性结合相互作用包括，例如，蛋白-DNA相互作用，蛋白-小分子相互作用，DNA-小分子相互作用，和非回文DNA序列的退火。
在一些实施方案中，该方法可以用于检验其中结合成分包括至少第一
和第二结合成分的结合相互作用，其中所述第一和第二结合成分是不同
的。在各种实施方案中，所述不同的第一和第二结合成分可以结合相同的
结合位点、重叠的结合位点或非重叠的结合位点。
在其中第一和第二结合成分的结合发生在相同的或重叠的相互作用
位点的实施方案中，所述第一和第二结合成分可以竞争性结合受体成分。当用于本发明时，"竞争性结合"是指这样的至少第一和第二结合成分，其中它们相对应的相互作用位点重叠，以致第二结合成分的结合干扰第一结合成分的结合。增加一种竞争性结合成分的浓度，消弱或消除另一种竞争性结合成分的结合。例如，在酶-底物相互作用的情形中，竞争性抑制剂与酶的活性位点结合，并且抑制底物的结合。然而，增加底物浓度，竞争超过竞争性抑制剂，以致酶参数最大酶速率^不受影响，而对于底物的表观亲和力^ 依赖于竞争性抑制剂的浓度受到影响。
在一些实施方案中，第一和第二结合成分可以非竞争性地结合受体成分。当用于本发明时，"非竞争性结合"是指以除了竞争性方式之外的方式结合受体成分的至少第一和第二结合成分。通常，在非竞争性相互作用中，第一结合成分在不与第二结合成分的相互作用位点重叠的相互作用位点处结合，以致第二结合成分的结合不直接妨碍第一结合成分的结合。因此，第二结合成分的结合对第一结合成分的结合的任何影响是通过除了直接妨碍第一结合成分的结合的机制进行的。例如，在酶-底物相互作用的情形中，非竞争性抑制剂与除了该酶的活性位点之外的位点结合。同样地，增加底物浓度可能不会稍微影响在非竞争性抑制剂存在下所示的酶参数
非竞争性结合包括混合型相互作用，其中第一和第二结合成分与具有竞争性和非竞争性结合特征的受体成分结合，并且还包括无竞争性结合相互作用，其中第二结合成分在不与第一结合成分的结合重叠的相互作用位点结合，但是仅在当第一相互作用位点被第一结合成分占据时与第二相互作用位点结合。例如，在酶-底物相互作用的情形中，无竞争性抑制剂通常与酶-底物复合物结合，由此增加表观底物亲和力K^ (即，底物或产物保持与酶更长久地结合)，同时减少最大酶活性^。
在一些实施方案中，结合成分包括与受体成分结合的激动剂。"激动剂"是指与受体成分结合并且能够引发与其结合的受体成分的生理作用的物质。因此，激动剂的结合产生生物作用，而下文所述的拮抗剂阻断激动剂的作用。例如，许多药物通过与同源受体成分结合并且激活正常由内源结合成分引发的信号转导系统而模拟内源结合成分的作用。
在一些实施方案中，结合成分包括与受体成分结合的拮抗剂。"拮抗剂"是指与受体成分结合并且能够抑制或消弱与其结合的受体成分的生理作用的物质。许多药物通过阻断内源性受体激动剂诸如例如激素和神经递质的作用而起作用。药物动力学拮抗剂是指改变细胞或生物体与另一种药物反应的方式的药物。与受体的激动剂竞争的拮抗剂是竞争性拮抗剂，而
14通过其它方式拮抗的拮抗剂是非竞争性拮抗剂。
在一些实施方案中，结合成分包括逆激动剂。"逆激动剂"是指与受体成分的激动剂相同的受体成分相互作用位点结合但是行使相反的生物或药理作用的结合成分。逆激动剂的特征是受到还阻断激动剂活性的拮抗剂的抑制。
应该理解，除了明确描述的那些以外的结合相互作用也可以利用本发明的方法进行检验。该方法用于这样的结合相互作用对熟练的技术人员是显而易见的。
2.2检测未结合的和结合的成分
在本发明所述的方法中，为了确定每数目受体成分的结合的结合成分的数目，将混合物中未结合的和结合的成分通过孔转移。术语"孔"是指限制结合和受体成分通过的任何受限或限制的体积。孔包括缝隙、洞和通道。通道特别包括槽、沟槽、或是混合物中的成分通过以在检测区进行检测的任何管道。孔或通道的尺寸可以取决于所用的检测模式。然而，孔的尺寸至少是这样的，其允许未结合的和结合的成分转移进行检测。因此，
在一些实施方案中，孔或通道可以是纳米孔，其具有约100nm或更小，约50nm或更小，约20nm或更小，约10nm或更小，约5 nm或更小，或约2nm或更小，到约0.5nm直径或通道尺寸。在一些实施方案中，孔是足以限制单个结合成分、受体成分和/或结合的成分通过孔转移的尺寸。
术语"转移"是指成分通过孔运动以进行在检测区内的检测。在一些实施方案中，转移是受引导的转移，其中施加力，使成分优先以特定的方向运动。所述力可以是任何力，诸如电测梯度、压力梯度、浓度梯度、温度梯度、渗透梯度、或可以将混合物中的成分定向转移通过孔的任何其它适当的力。在下文中进一步描述定向转移的许多模式。
术语"检测区"是指在其中检测未结合的和/或结合的成分的区域。检测区可以在孔内，并置在孔上，在孔入口或出口处，或通过孔的部分或完整的孔存在。各种构型取决于检测结合混合物中的成分所用的检测模式。当通过孔转移时，未结合的和任何结合的成分在检测区检查，以检测与所述未结合的和结合的成分相关的可检测性质。适当的检测模式包括，通过
15举例的方式并且不限制，电流阻断、电子隧道电流、电荷-诱导的场效应、 和/或孔通过时间，如下文进一步所述。
未结合的和结合的成分的可检测性质的检测产生鉴定被检测的成分 的信号模式。这种与被检测的成分相关的信号模式可以与一组参照信号模 式比较，以辅助测量的信号模式与混合物中特异性成分的相关性。可以通 过独立分析结合成分和受体成分，然后作为混合物以确定与结合反应中每 个成分相关的特征或识别标志信号模式，而获得参照信号模式。
可以使用能够对于每种未结合的成分(例如，结合和受体成分)以及 每种结合的成分产生可区分的信号模式的各种检测模式。在受体成分包括 多于一个相互作用位点的情形中，可以选择这样的检测模式，其可以对于 每种结合的成分产生不同的信号模式，例如具有一个结合的结合成分的受 体成分，和具有两个结合的结合成分的受体成分。此外，取决于检测的灵 敏性，与第二相互作用位点的结合相比较时，产生的信号模式可以允许区 分与第一相互作用位点的结合。在一些实施方案中这可能是可行的，其中 第一结合成分与第二结合成分不同，以致可以区分独立的结合成分以及其 中结合成分都结合在受体成分上的复合物。然而，应该理解，结合相互作 用的分析不必要求区分每种未结合的成分或结合的成分。例如，对于包括 对相同结合成分具有两个相互作用位点的受体的相互作用，平均平衡结合 常数可以通过确定结合的成分的总数目而获得，不需要区分每种结合的成 分。
许多检测模式适用于本发明的方法。在一些实施方案中，可检测的性 质是被转移的成分对孔的电性质的影响。孔电性质特别包括电流振幅、电 阻、持续时间和频率。检测孔电性质的装置典型地包括结合在薄膜或膜中
的孑L，其中所述薄膜或膜分隔顺式室(cis chamber)和反式室(trans chamber),
其通过导电桥连接。待分析的混合物放置在处于水溶液中的孔的顺式一 侧，其典型地包括一种或多种溶解的盐诸如氯化钾。利用放置在顺式和反 式侧的电极穿过孔应用电场可以用于引导所述成分通过孔的转移。所述成 分的尺寸和几何形状可以影响离子通过孔的迁移，由此改变孔的电性质。 在适当的时间频率检测电流，以获得充分的数据点，来检测电流信号模式。 然后，可以将产生的信号模式与一组参照模式比较，以鉴定被检测的成分。电流振幅、电流持续时间和电流量级的变化定义混合物中特定成分的信号
模式。测量孔的电流性质，诸如通过局部夹钳技术(patch clamp techniques) 测量，在许多参考文献中描述，例如，在Hille,B,2001,可激发的膜的离 子通道(Aw (7/2<3朋6& Mem6ra腦)，第3版，Sinauer Associates,
公司，Sunderland, MA中。
在一些实施方案中，被检测的性质是电子的量子隧道。量子隧道是经 由离子量子波性质通过经典-禁阻能态跃迁的量子-机制作用。电子通道通 常发生在供体和受体之间存在电子运动的电势障碍的情形中。为了检测电 子隧道，将显微制造的电极末端放置在距离待检测的成分约2纳米处。在 适当的分离距离处，电子沿着末端和成分之间的区域通过隧道，并且如果 在末端和成分之间施加电压，则净电子流(即，隧道电流)沿着处于电压 偏向的方向的缝隙流动。在装置使用测量隧道电流的检测电极的情形中， 电极可以靠近转移成分放置，以便在检测电极和被转移的混合物成分之间 存在电子隧道。如下文进一步讨论，电极相对于转移方向的排列可以规定 被检测的电子隧道的类型。
在一些实施方案中，结合相互作用的分析可以包括检测通过转移成分 发生的电流(例如，纵向沿着核酸链)(Murphy等，1994,美国国家科学院 学报(尸rac淑"cad6W园)91(12):53 15-9)。对于这样的电子隧道的检 测，检测电极纵向放置在转移方向上，以便在与转移方向平行的电极之间 存在缝隙。在不同的实施方案中，检测电极可以放置在分隔孔的两侧的层 (例如，膜)的相对的侧面上，而在其它实施方案中，检测电极可以放置 在分隔孔的两侧的层内。
电子隧道的另一种模式是穿过所述成分发生，即，以横穿通过孔转移 方向的方向发生。在化学组成、水合结构、与带电荷离子的相互作用、成 分中的化学基团的空间方向中的差别可以改变横向电子转移特征，并且由 此为区分结合混合物中一种成分与另一种成分提供基础。对于检测横穿孔 的电子隧道(例如，横穿延伸的核酸链)，检测电极可以被放置在纳米孔 的一侧，以检查被转移的成分。对于横向检测，检测电极的末端可以被定 为检查单一成分的尺寸。在其它实施方案中，检测电极的尺寸可以安排为 检查更多或多于一种成分。例如，对于多核苷酸的检测，电极可以定为这样的尺寸，以检查约2个或更多，约5个或更多，约10个或更多，或约20 个或更多碱基，这取决于检测和区分所述多核苷酸与在结合混合物中的其 它成分所需要的分辨率。
在一些实施方案中，检测技术可以基于镜像电荷-诱导的场，如在美
国专利号6,413,792和美国公布的申请号2003/0211502中所述，其内容通 过引用结合于此。基于电荷诱导的场进行检测的半导体装置还在这些参考 文献中描述。在来源区和排出区之间施加电压导致电流从来源向排出的流 动，如果在该半导体中形成电流通道的话。因为结合混合物中的每种成分 可以具有缔合的电荷，则成分通过半导体孔的通过可以诱导内衬孔的半导 体材料的导电性的改变，由此诱导特异性量级和波形的电流。因为在电荷、 电荷分布和分子尺寸的差别，不同量级和波形的电流可以由不同成分产 生。在美国专利号6,413,792中公开的实施方案中，成分通过p-型硅层形 成的孔而通过。成分的转移可以通过与移动成分通过其它类型的通道所用 的那些方法相似的方法实现，如本文所述。电荷-诱导的电流的量级预测在 微安培的量级，其高于对于基于电子通道的检测所预测的微微安电流。
应该理解，尽管上述描述涉及单个的检测技术，但是在一些实施方案 中，可以使用多种不同的技术来检验结合混合物。多种检测模式的实例特 别包括与电子隧道电流组合的电流阻断，和与镜像电荷诱导的场组合的电 流阻断。使用不同的检测模式同时检测可以用来通过使获自不同检测模式 的所得信号的检测时间相关而鉴定结合反应中的成分。当检测混合物中的 未结合的和/或任何结合的成分时，相关的结合参数可以如上文所述进行确 定。
利用不同检测模式的不同装置可以用于分析结合混合物。这些特别包 括基于生物学的系统，其利用包埋在膜和固态系统中的生物孔或通道，其 中所述通道或孔全部或部分由制造的或造型的固态成分诸如硅制成。利用 生物孔如a-溶血素和孔蛋白的装置，在Kasianowiscz等，1996，美国国家 科学院学报(尸roc Ato/Jcac/5W OSL4) 93:13770-13773; Howorka等，2001, 自然生物技术(Atow Ao&c/z"o/) 18:1091-5; Szabo等，1998， FASES J！ 12:495-502;和美国专利号5,795，782, 6,015,714, 6,267,872,与6,428,959中 描述；所有公布通过引用结合于此。在一些实施方案中，结合反应的分析通过将在结合混合物中的成分转移通过由非生物材料制成的孔而进行。 孑L，包括通道，可以由各种固态材料利用许多不同的技术制成，特别包括 化学沉积、电化学沉积、电镀、电子束刻蚀、离子束刻蚀、纳米石印术、 化学蚀刻、激光切除以及本领域公知的其它方法(参见，例如，Li等，2001,
自然(淑匿)412:166—169;和WO 2004/085609)。通过举例而非限制的 方式，固态材料包括任何已知的半导体材料、绝缘材料和金属。因此，固 态的孔可以包括，而不限于，硅，硅，氮化硅、锗、砷化镓、金属(例如， 金、银、铂)、金属氧化物和金属胶体。
为了制备适当尺寸的孔，在制造过程中可以使用各种反馈方法。在离 子通过洞的实施方案中，检测通过固态材料的离子流提供一种测量在制造 过程中产生的孔大小的方法(参见，例如，美国公布的申请号 2005/0126卯5)。在其它实施方案中，其中电极限制孔的尺寸，电极之间的 电子隧道电流可以提供关于缝隙尺寸的信息。隧道电流的增加表示在电极 之间的缝隙距离的减小。其它反馈技术对于熟练的技术人员是显而易见 的。
在一些实施方案中，孔可以利用离子束刻蚀制造，如在Li等,2003，自 然材料(A^^"7l/aten'a&) 2:611-615中所述。在所述的方法中，通过低压 化学蒸汽沉积作用，将一层低压氮化硅膜沉积在硅基底上。影印石印术和 化学蚀刻的结合可以用于去除硅基底，以留下氮化硅层。为了形成孔，利 用聚焦的离子束(例如，能量为0.5-5.0 KeV、直径为0.1-0.5 mm的氩离 子束)在氮化硅膜上产生洞。通过适当地调整离子束参数(例如，氮化硅 暴露于离子束的总时间和暴露占空因数(duty cycle))和样品温度，材料可 以被去除以扩大洞，或者添加材料以减小洞尺寸。在室温和低占空因数的 离子束轰击导致材料迁移到洞中，而在5'C和更长的占空因数的轰击导致 洞的扩大。测量通过孔转移的离子的量为精确控制最终的孔尺寸提供了反 馈机制(Li等，同上)。为了形成适当尺寸的孔，可以利用导致氮化硅失 去的刻蚀参数制成大于最终需要的孔尺寸的洞。随后，可以利用导致材料 移动到最初形成的洞中的刻蚀参数将孔的尺寸调整到适当的尺寸。
在其它实施方案中，孔可以通过结合电子束石印术和高能电子束刻蚀 形成(参见，例如，Storm等，2003,自然材料(Atoww Mater/a&)
192:537-540)。根据已知方法制成的在绝缘体上的硅可以用来形成硅膜，然 后将其氧化形成氧化硅层。利用电子束石印术和各向异性蚀刻的结合，去 除氧化硅，以暴露硅层。通过KOH湿蚀刻在硅上制成洞，并且将硅氧化 形成足够深度的氧化硅层，诸如例如约40nm的层。将二氧化硅暴露于高 能电子束(例如，从发射电镜)使该洞周围的二氧化硅层变形。最初的洞 是扩大还是减小取决于最初的尺寸。50 nm或更小的洞似乎在尺寸上减小， 而约80nm或更大的洞在尺寸上增加。通过离子束溅射技术产生适当的孔 的类似方法在Heng等，2004,生物物理学杂志(历op/zy J) 87:2905-2911 中描述。在该技术中，利用使用聚焦的高能电子束的石印术，与产生超薄 膜的通用技术结合，在金属氧化物半导体(CMOS)上形成孔。
在其它实施方案中，孔可以按美国专利号6,627,067; 6，464,842; 6,783,643;和美国公布号2005/0006224所述通过刻蚀氮化硅而构造。首先， 通过化学蒸汽沉积作用将一层氮化硅沉积在硅层的两侧。以使得一部分氮 化硅层暴露的方式加入光致抗蚀剂后，通过常规离子蚀刻技术将在一侧的 暴露的氮化硅层去除，以留下在另一侧用氮化硅涂覆的硅。硅可以通过许 多蚀刻技术诸如通过各向异性KOH蚀刻去除，由此留下氮化硅膜。可以 通过调整沉积在该硅上的厚度而控制氮化硅膜的厚度。利用电子束石印术 或影印石印术，在氮化硅层的一侧产生空腔，然后使该空腔另一侧的膜变 薄。适当的变薄方法特别包括离子束溅射、离子束辅助的蚀刻、电子束蚀 刻、和等离子体反应性蚀刻。可以使用关于该构造方法的许多改变，例如， 使用夹在两个硅层之间的氮化硅层，而产生不同尺寸的孔。如上所示，基 于测量通过该孔的离子的速率和/或强度的反馈机制提供了一种在构造过 程中控制孔的尺寸的方法。
在其它实施方案中，孔可以构建为金或银纳米管。在一些实施方案中， 这些孔使用多孔材料模板形成，并且在该多孔材料的表面上沉积金或其它 适当的金属，所述多孔材料诸如利用径迹蚀刻方法(track etch method)制 备的聚碳酸酯滤器。径迹蚀刻的聚碳酸酯膜典型地通过将固体膜材料暴露 于高能核粒子而形成，高能核粒子在膜材料上产生径迹。然后，利用化学 蚀刻将蚀刻的径迹转变成孔。所形成的孔具有约10 nm以及更大的直径。 调整核粒子的强度控制在该膜中形成的孔的密度。通过无电镀膜法将金属，典型地是金或银沉积在径迹蚀刻的孔中，而可以在蚀刻的膜上形成纳
米管(Menon等，1995,分析化学(AnalChem) 67:1920-1928)。这种金属沉 积方法使用沉积在孔材料表面上的催化剂，然后将其浸没在含有Au(I)和 还原剂的溶液中。Au(I)还原成金属Au在含有催化剂的表面上发生。沉积 的金的量取决于温育时间，以致增加温育时间使在滤器材料中的孔的内直 径减小。因此，孔的尺寸可以通过调整沉积在孔上的金属的量而进行控制。 使用各种技术，例如，利用简单扩散的气体转运特征或通过利用局部夹钳 型系统测量通过孔的离子流，而测量获得的孔的尺寸。支持材料完好无损， 或者被去除而留下金纳米管。无电镀膜法技术能够形成直径为小于约1 nm-约5nm的孔尺寸，或者在需要时更大的孔尺寸。具有约0.6 nm孔直 径的金纳米管似乎区分Ru(bpy)2+2和甲基紫精，这表明所述金纳米孔的 选择性(Jirage等，1997,科学(Sc/e"ce) 278:655-658)。对金纳米管表面的 修饰易于通过将含有硫醇的化合物附着到金表面上，或者通过将金衍生具 有其它官能团而实现。这种特征允许孔修饰化合物的附着。使用本发明所 述的生物孔的装置如顺式/反式装置，也可以使用所述金纳米孔来分析结合 反应。
在检测模式包括通过被转移的成分的电流(例如，电子隧道流)的情 形中，固态膜可以通过多种技术进行硬化。可以在膜的两侧沉积导电层， 以产生适用于通过纵向电子隧道流检查该成分的电极。在一些实施方案 中，导电层可以沉积在膜的表面以形成适用于检查穿过孔的成分，例如， 横向电子隧道流的电极。用于沉积导电材料的各种方法是已知的，其包括 溅射沉积(即，物理蒸汽沉积)，非电解沉积(例如，胶状混悬液)、以及 电解沉积。其它的金属沉积技术特别包括丝状蒸发、金属层蒸发、电子束 蒸发、闪蒸和诱导蒸发。
在一些实施方案中，检测电极可以通过溅射沉积形成，其中离子束轰 击一块金属，并且蒸发金属原子，然后金属原子以薄膜形式沉积在晶片材 料上。取决于所用的石印术方法，然后通过反应性离子蚀刻对金属膜进行 蚀刻，或者使用化学-机制抛光法进行抛光。金属膜可以沉积在预先形成的 孔上或者在构建孔之前沉积。
在一些实施方案中，检测电极可以通过电沉积法构造(参见，例如，
21Xiang等，2005,綺缀CTzem. /"虚44:1265-1268; Li等，应用物理学通讯 (^一W尸/7戸b丄成)77(24):3995-3997;和美国申请公布号 2003/0141189)。这些构造方法适用于产生孔和放置在固态膜一面的相对应 的检测电极，诸如用于检测横向电子隧道。首先，利用常规石印法在二氧 化硅层上形成一对对向电极，其被支持在硅晶片上。电解质溶液覆盖该电 极，并且金属离子通过沿着该电极对传导电流而沉积在一个电极上。金属 随着时间沉积在电极上减小电极之间的缝隙距离，不仅产生检测电极而且 产生用于转移结合反应中的成分的一定尺寸的缝隙。电极之间缝隙的距离 可以通过许多反馈方法控制。在一些构型中，控制两个电极之间的距离的 反馈可以依赖于在所述两个电极之间的电势差异。随着电极之间的缝隙减 小，电势差异减小。在其它构型中，控制在两个电极之间的距离利用横穿 电极对的电子隧道流(Li等，同上)。随着电极之间的距离减小，电子隧 道流增加。使用电子隧道的反馈控制适合构造具有约1 nm或更小的缝隙 距离的电极，而基于电极缝隙电势的反馈控制允许构造具有约1 -约10 nm的缝隙距离的电极。电沉积的速率依赖于电解质浓度和通过电极的电 流。恒定的电流可以用来在该电极上形成金属层。在其它实施方案中，电 流脉冲可以用来在每个脉冲循环将己知数量的金属原子沉积在电极上，并 且由此提供对电极构造过程的精确控制。
在检测是基于电荷诱导的场效应的成像的情形中，可以按照美国专利 号6,413，792和美国公布的申请号2003/0211502中所述构造半导体装置。 构造这些检测装置的方法可以使用与构造其它固态孔所用的那些相似的 技术。在一些实施方案中，场效应检测器用在绝缘体上的硅制成，其包括 具有二氧化硅层和p-型硅层的硅基底(其中大部分电荷载体是带正电荷的 洞的掺杂质的硅)。薄的n-型硅(其中大部分电荷载体是带负电的洞的掺 杂质的硅)层通过在p-型硅层中注入离子和加入n-型掺杂剂而形成，而沿 着p-型硅层延伸的另一种n-型硅层在绝缘体上的硅的另一个区域形成。通 过蚀刻去除硅基底和二氧化硅层使得p-型硅暴露于与第一形成的薄的n-型层相对的面。在新暴露的p-型硅面上，形成第二薄的n-型硅层，其连接 沿着p-型硅层延伸的n-型硅层。为了分析结合反应，通过多种技术，例如 通过离子蚀刻或石印术(例如，光子或电子束)产生孔，该孔沿着两个薄的n-型硅层和p-型硅层延伸。为了减小孔的尺寸，二氧化硅层可以通过将 硅氧化而形成。金属层附着在第一形成的n-型硅层上和沿着p-型硅延伸的 n-型硅层上，由此形成来源和排出区。
在本发明关于混合物中成分分析的不同实施方案中，孔可以设定为不 同的形式。在一些实施方案中，装置包括膜，生物的或固态状态，其包含 保持在两个储存库之间的孔，所述两个储存库也称为顺式和反式室(参见， 例如，美国专利号6,627,067)。用于电子在两室之间迁移的导管允许这两 个室的电接触，并且在这两室之间的电压偏向可以指导结合成分通过孔转 移。这种构型的变化用于分析通过生物纳米孔的电流，如在美国专利号 6,015,714和6,428,959中；以及Kasia歸iscz等，1996,美国国家科学院学 报(Prac则加"".园)93:13770-13773中所述，其内容通过引用结 合于此。
上述装置的改变还在美国申请公布号2003/0141189中公开。在这些实 施方案中，将通过电沉积制造的一对纳米电极放置在基底表面上。电极彼 此相对，并且具有足以使待分析的成分通过的缝隙距离。绝缘材料保护该 纳米电极，仅使电极的末端暴露用于检测的目的。绝缘材料和纳米电极隔 开作为样品储存库的室，和通过转移将待分析的成分递送至其中的室。阴 极和阳极电极提供电场，用于引导从样品室到递送室的转移。
用于引导通过孔的转移的电流偏向可以通过穿过该孔施加电场而产 生。在一些实施方案中，电场是恒定电压或恒定电流偏向的。在其它实施 方案中，成分的转移可以通过电泳电场参数的脉冲操作得到控制(参见， 例如，美国专利申请号2003/141189和美国专利号6,627，067)。电流的脉 冲可以提供一种在确定时间阶段内通过孔精确转移的方法，并且在一些情 形中，将成分暂时保持在孔内，并且由此提供被分析的成分的电学性质的 更大的分辨率。
孔装置可以进一步包括电场或电磁场，用于在成分通过孔时限制它的 方向。这种支持场(holdingfidd)可以用来减少孔内分子的运动。成分在检 测区的运动可以增加检测信号的背景噪声。例如，当测量电流阻断时，孔 内聚合物的运动可能导致电流的变化。类似地，在检测测量电子隧道流的 情形中，相对于检测电极，电流信号可能对被检测的成分的空间方向敏感。
23通过在分子通过纳米孔转移时保持或者限制分子的方向，可以将在检测的 信号中的变化最小化。
在一些实施方案中，与转移方向正交的电场可以用于限制成分诸如聚
合物在孔内的运动。这在美国申请公布号2003/0141189中举例说明，其通
过在样品板的上部和下部使用两个平行的导电板进行。这些电极产生与转 移方向正交的电场，因此将成分保持在一个样品板上。例如，带负电荷的
DNA骨架，或被修饰在一条链具有负电荷的核酸，可以定向到阳极板， 由此限制多核苷酸的运动。正交电场保持成分在限定的检测方向的类似应 用在美国专利号6,627,067中描述。在这一实施方案中，被放置产生与转 移方向正交的电场的电极用于将成分保持在槽中，在槽中用探头(例如， 电子隧道探头)检查样品。与引导通过孔的转移的电场的控制相似，正交 电场可以关于保持场的持续时间和振幅进行控制。用于转移的电场与用于 保持待检测的成分处于精确控制通过孔的转移的限定方向所用的电场相 互配合。
在一些实施方案中，控制成分在孔中的位置可以通过在美国申请公布 号2004/0149580中描述的方法进行，其利用通过一系列放置在孔附近或孔 上的电极在孔内产生的电磁场进行。在这些实施方案中， 一组电极施加直 流电压和射频电势，而第二组电极施加相反的直流电压和射频电势，所述 射频电势关于由第一组电极产生的射频电势相转换180度。预期这种射频 四极将带电粒子(例如，细胞受体)保持在场中心(即，孔中心)。将转 移的成分保持在孔的中间预计减少通过孔的电子流的变化，并且还可以提 供通过电子隧道测量的电流的连贯性。表明改变射频四极的振幅也可以用 来推动成分到达孔的一侧，由此减缓转移速率。
2.3分析结合相互作用的方法的应用
如本发明所述，所述方法可以用于分析包括各种成分的结合相互作 用。因此，受体成分可以是能够与结合成分结合的任何试剂，反之亦然。
在一些实施方案中，结合成分，受体成分，或结合和受体成分二者， 可以包括小的有机分子。在不同实施方案中，小的有机分子可以包括任何 有机化合物，特别包括烷基、杂烷基、环垸基、杂环烷基、芳基、杂芳基、ary-芳基、多环芳基、融合的环系统、和连接的环系统。环烷基化合物的 实例包括，但不限于，基于下列各项的化合物环丙基；环丁基，如环丁 烷基和环丁烯基；环戊基，如环戊烷基和环戊烯基；环己基，如环己烷基 和环己烯基。示例性的杂环烷基化合物可以包括，但不限于，基于下列各 项的化合物四氢呋喃基(例如，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基等)，哌 啶基(例如，哌啶-l-基，哌啶-2-基等)，吗啉基(例如，吗啉-3-基，吗啉 _4_基等)，和哌嗪基(例如，哌嗪-l-基，哌嗪-2-基等)。
示例性的芳基可以包括，但不限于，基于下列各项的化合物.，醋蒽烯, 醋亚萘基(acenaphthylene),醋菲炔(acephenanthrylene),蒽，萸，苯，窟， 蔻，荧蒽,荷，并六苯，己芬,hexalene， as-indacene， s-indacene, 1,2-二氢化 節，邻，并乂、￥ (octacene) , 乂V3^ (octaphene) , octalene,卵*, jjt—2,4-二烯，并五苯，并环戊二烯，戊芬，茈，phenalene，菲，茜，偕双烯型化合物 (pleiadene)，芘，皮蒽，玉红省，三亚苯基，三萘等，以及它们的各种氢 化异构体。在一些实施方案中，芳基化合物包括(C5-d5)芳基，或(Crdo) 芳基。示例性的芳基化合物可以包括环戊二烯基、苯基和萘基。
示例性的杂芳香化合物可以特别包括基于下列各项的化合物吖啶, 苯并咪唑，苯并异噁唑，苯并二噁烷，苯并间二氧杂环戊烯，苯并呋喃，苯 并吡喃酮，苯并噻二唑，苯并噻唑，苯并三唑，苯并噁嗪(benzoxaxine),苯 并噁唑，苯并噁唑啉，咔唑，(3-咔啉，苯并二氢吡喃，色烯，噌啉，呋喃，咪 唑，。引唑，口引哚，二氢吲哚，中氮茚，异苯并呋喃，异色烯，异吲哚，异二 氢口引哚，异喹啉，异噻唑，异噁唑，1,5-二氮杂萘，噁二唑，噁唑，萘嵌间二 氮杂苯基，啡啶，啡咯啉，吩嗪，2,3-二氮杂萘，蝶啶，嘌呤，吡喃，吡嗪, 吡唑，哒嗪，卩比啶，嘧啶，吡咯，吡咯嗪(pyrrolizine),喹唑啉，喹啉，喹 嗪，喹喔啉，四唑，噻二唑，噻唑，噻吩，三唑，和咕吨。
在不同实施方案中，所述小的有机分子可以包括约100-约4000道尔 顿、约200-约4000道尔顿、或约500-约3000道尔顿的有机化合物。该分 子可以是任何类型或种类的化合物，特别包括杀虫剂、激素、维生素、抗 生素、抗病毒化合物、药物和药物化合物、以及酶抑制剂。适用于本发明 目的的其它小的有机分子对于熟练的技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，所述结合成分，受体成分，或结合成分与受体成分二者，可以包括碳水化合物。当用于本发明时，"碳水化合物"是指含 有氧、氢和碳原子并且由通用化学式C。(H20)n表示的化合物或其衍生物。 在不同实施方案中，所述碳水化合物可以是独立于其它化合物或与其它化 合物如脂质、多肽和核酸缔合的。碳水化合物可以是单糖、二糖、寡糖和 多糖。单糖可以包括醛糖和酮糖，醛糖在第一个碳原子上具有醛基，酮糖 典型地在第二个碳上具有酮基。它们还可以归类为丙糖、四糖、戊糖、己 糖等，取决于它们所含有的碳原子数目。示例性的单糖包括甘油醛，赤藓
糖(erythose),苏糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，来苏糖,阿洛糖，阿卓糖，葡 萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，和塔罗糖。
在一些实施方案中，碳水化合物可以包括二糖，其由通过共价糖苷键 连接在一起的两个单糖单位组成。常见的二糖特别包括纤维二糖、麦芽糖、 龙胆二糖(gentobiose)、海藻糖、蔗糖。在其它实施方案中，碳水化合物 可以包括寡糖和多糖，其由通过糖苷键连接在一起的长链单糖单位组成。 二者之间的差别基于在链中存在的单糖单位的数目。寡糖典型地含有3-9 个单糖单位，而多糖含有大于10个单糖单位。发现寡糖是蛋白质翻译后 修饰的常见蛋白质形式。多糖特别包括淀粉、纤维素、甲壳质和糖原。结 合碳水化合物的各种受体成分对于熟练的技术人员是己知的，并且在下文 进一步描述。
在一些实施方案中，所述结合成分，受体成分，或结合成分与受体成 分二者，可以包括脂质或脂肪酸。当用于本发明时，"脂质"是指基于烃 的分子，其是非极性的或者疏水性的，并且通常溶于非极性溶剂中。脂质 还包括两亲性的或两亲型分子，其特征在于存在疏水性和亲水性部分两 者。脂质可以是无环的或环形的，直链或分支的、饱和的或不饱和的。脂 质的种类包括，例如，脂肪酸、甘油酯和非甘油酯。脂肪酸是指具有疏水 部分诸如脂肪链的有机酸，并且可以是饱和的或不饱和的。示例性的饱和 脂肪酸特别包括丁酸、月桂酸(十二烷酸)、肉豆蔻酸(十四烷酸)、棕榈 酸(十六垸酸)、硬脂酸(十八烷酸)和花生酸(二十垸酸)脂肪酸。示 例性的不饱和脂肪酸特别包括a亚麻酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、 亚油酸、花生四烯酸、油酸和芥酸。不饱和脂肪酸可以是采取顺式或反式 构型。甘油酯或甘油脂质是指由甘油和脂肪酸形成的酯类。甘油酯可以采取 单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯的形式。甘油酯还包括磷酸甘油酯或甘油
磷脂，其包括sn-甘油-3-磷酸，sn-甘油-3-磷酸含有附着到甘油部分的至少 一个O-酰基或O-烷基或O-烷基-l'-烯基残基和由含氮碱基、甘油或肌醇 单位组成极性头。非甘油酯特别包括神经鞘脂、固醇(例如，胆固醇、雌 激素和睾丸激素)、异戊烯醇(例如，萜类)和多肽(polyketides)。所述 脂质可以独立于其它分子存在，或者非共价或共价附着到其它分子上。例 如，脂质可以以胶束形式存在或者共价附着到碳水化合物或蛋白上。
在一些实施方案中，所述结合成分，受体成分，或结合成分与受体成 分二者，可以包括多肽。当用于本发明时，"多肽"与术语"肽"、"寡肽" 和"蛋白"互换使用，并且是指由酰胺键连接的至少两个氨基酸。多肽可 以是任何长度的，线性的或环形的，或者包括分支结构，诸如例如，泛在 的多肽。术语"多肽"、"肽"、"寡肽"和"蛋白"包括具有D-和L-氨基 酸、以及D-和L-氨基酸混合物的那些。多肽中的氨基酸可以包括遗传编 码的氨基酸，而且还包括完整的或部分天然存在的和/或合成的非编码的氨 基酸。常见的非编码氨基酸包括，但不限于，2,3-二氨基丙酸；鸟氨酸；瓜 氨酸；高赖氨酸；磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；高天冬氨酸；高谷氨酸 (homoglutanic acid);高丙氨酸；正缬氨酸；高亮氨酸，高缬氨酸；高异亮 氨酸；高精氨酸；高半胱氨酸；高丝氨酸；羟脯氨酸和高脯氨酸。其它非编 码的氨基酸对于本领域的技术人员将是显而易见的(参见，例如，在Fasman, 1989,生物化学和分子生物学CRC实践手册(0 CPra"z'ca/7/a"必ooA:o/ 5z'oc/zem〖W 7 aw/ Mo/ecw/or 5z'o/ogy) , CRC出版社，Boca Raton, FL,在第 3-70页以及其中引用的参考文献中提供的多种氨基酸，所有这些通过引用 结合于此)。
在一些实施方案中，所述结合成分，受体成分，或结合成分与受体成 分二者，可以包括多种多肽类似物。当用于本发明时，"多肽类似物"是 指其中酰胺键被酰胺键的等排物或取代的酰胺键替代的任何多肽。在不同 实施方案中，取代的酰胺键包括，但不限于，式-C(0)NRZ的基团，其中R2
是(C,-C6)烷基,(C5-C一芳基取代的(Cs-C,Q)芳基,(C6-C,6)芳基垸基，取
代的(CVC,6)芳基烷基5-10元杂芳基取代的5-10元杂芳基,6-16元杂芳
27基烷基或取代的6-16元杂芳基烷基。在具体的实施方案中，W是(C,-C6)烷 基,(C2-C6)烯基,(C2-C6)炔基或苯基。
酰胺的等排物通常包括，但不限于，-NR3-SO-， -NR3-S(0)2-, -CH2-CH2-， -CH=CH-(顺式和反式)'-CH2-NH-， -CH2-S-， -CH2-0-， -C(0)-CH2-, -CH(OH)-CH2-和-CH2-S(0)2-,其中R 是氢或R2，并且112如上文所定义。这 些链接可以以一种极性或以相反极性包含在多肽中。包括这样的非酰胺键 的肽类似物，以及合成这样的类似物的方法是公知的(参见，例如，Spatola， 1983，"肽骨架修饰"("Peptide Backbone Modifications," ) ^": ^"^"潔、 ^f^7蛋/^^^夕众^^〃主激众学rC7ze附/sfr^ 5foc/zg附/W^ ^cz'(iy,
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备选地， 一个或多个酰胺键可以用肽模拟物和/或酰胺模拟物部分替 换。这样的部分的非限制性实例在Olson等，1993,医学化学杂志(J. Med. C7 em.) 36:3039-3049; Ripka和Rich, 1998,现代化学生物学观点(Cmr. (9/7/ . C&w. Biol.) 2:441-452; Borchardt等，1997，高级药物递送综述"c/v. Z>Wg. De"v. ) 27:235-256，以及其中引用的多篇参考文献中描述。
在一些实施方案中，多肽可以包括反肽(retro peptide)或反肽类似物。 "反肽"或"反肽类似物"是指具有与相对应的亲本肽或肽类似物的一级序列相反(在N+C方向上)的一级序列的肽或肽类似物。
在一些实施方案中，多肽可以包括逆肽(inversopeptide)或逆肽类似 物。"逆肽"或"逆肽类似物"是指具有与相对应的亲本肽或肽类似物相 同的一级序列、但是其中所有的手性a-碳都处于相反的构型的肽或肽类似
在一些实施方案中，多肽可以包括反-逆肽(retro-inverso peptide)或 反逆肽类似物。"反逆肽"或"反逆肽类似物"是指具有反肽或反肽类似 物和逆肽或逆肽类似物的结合特征的肽或肽类似物，如上文所定义。反-逆肽和反-逆肽类似物可以通过反转相对应的亲本肽或肽类似物的肽或类 似键的极性，或者反转一级序列(以N+C方向)的顺序并且改变相对应的 亲本肽或肽类似物的oc-碳的手性而制备。
用于本发明方法的多肽的种类特别包括酶、细胞受体、DNA结合蛋白、 碳水化合物结合蛋白、抗体、脂质结合蛋白、信号转导蛋白、肽激素、和 肽抗生素。用作结合和/或受体成分的多肽的其它种类对于熟练的技术人员 是显而易见的。
在一些实施方案中，所述结合成分，受体成分，或结合成分与受体成 分二者，可以包括核碱基聚合物。当用于本发明时，"核碱基聚合物"或 "核碱基寡聚体"是指通过键连接的两个或多个核碱基，所述键允许得到 的核碱基聚合物或寡聚体与具有互补核碱基序列的多核苷酸杂交。核碱基 聚合物或寡聚体包括，但不限于，多-和寡核苷酸(例如,DNA和RNA聚合物 和寡聚体)，多-和寡核苷酸类似物以及多-和寡核苷酸模拟物，诸如聚酰胺 或肽核酸。核碱基聚合物或寡聚体大小可以从几个核碱基,2 - 40个核碱基， 10 - 25个核碱基，12 - 30核碱基，或12 - 20个核碱基，到数百个核碱基, 到数千个核碱基，或更多个而不同。"核碱基"或"碱基"是指那些天然存 在和合成的杂环部分，它们通常对于使用核酸或多核苷酸技术或使用聚酰 胺或肽核酸技术由此产生可以以序列特异性方式与多核苷酸杂交的聚合 物的那些人是已知的。适宜的核碱基的非限制实例包括腺嘌呤、胞嘧啶、 鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、 5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、 N9-(2-氨基-6-氯嘌呤、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、异鸟嘌呤(iG)、.N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤)和N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌 呤)。其它适当的核碱基的非限制性实例包括在Buchardt等(WO 92/20702 或WO 92/20703)的图2(A)和2(B)中示例的那些核碱基。
在一些实施方案中，所述核碱基聚合物可以包括多核苷酸或寡核苷 酸。当用于本发明时，"多核苷酸"或"寡核苷酸"是指其中通过糖磷酸酯连 接(糖-磷酸骨架)相连的核碱基的核碱基聚合物或寡聚体。示例性的多-和寡核苷酸包括2'-脱氧核糖核苷酸的聚合物(DNA)和核糖核苷酸的聚合 物(RNA)。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成，完全由2，-脱氧核糖核苷 酸组成或它们的组合组成。
在--些实施方案中，所述核碱基聚合物可以包括多核苷酸或寡核苷酸 类似物。当用于本发明时，"多核苷酸或寡核苷酸类似物"是指其中通过糖 磷酸酯骨架连接核碱基的核碱基聚合物或寡聚体，所述糖磷酸酯骨架包括 一个或多个糖磷酸酯类似物。典型的糖磷酸酯类似物包括，但不限于，糖 烷基磷酸酯，糖磷酰胺(phosphoramidite)，糖烷基-或取代的垸基磷酸三酯， 糖硫代磷酸酯，糖二硫代磷酸酯，其中糖是除了2'-脱氧核糖或核糖之外的 糖的糖磷酸酯和糖磷酸酯类似物，具有带正电荷的糖胍基链接的核碱基聚 合物，诸如在美国专利号6,013,785和美国专利号5，696,253中所述的那些 (还参见，Daganil995，化学工程新闻(C7zem五"giVe，) 4-5:1153; Dempey 等，1995,美国化学学会杂志(J颠C/7ewSoc) 117:6140-6141)。其中糖是 2，-脱氧核糖的这样的带正电荷的类似物叫作"DNGs,"而其中糖是核糖 的那些叫作"RNGs"。在多-和寡核苷酸类似物的定义中特别包括锁定核酸 (LNAs;参见，例如，Elayadi等，2002,生物化学(所oc/zemz'sfr7)41:9973-9981; Koshkin等，1998,美国化学学会杂志(/爿w Ctem 5bc) 120:13252-3; Koshkin等，1998,四面体通讯(『"raW謂39:4381-4384; Jumar 等，1998，生物有机和医学化学通讯(S/oorgom'c & MeA'c,"c / C/ze冊's^y 丄e/fera) 8:2219-2222; Singh和Wengel, 1998，化学通讯(C7zew Comm丽) 12:1247-1248; WO 00/56746; WO 02/28875;以及，WO 01/48190;所有这些 通过引用完全结合于此)。
在一些实施方案中，所述核碱基聚合物可以包括多核苷酸或寡核苷酸 模拟物。当用于本发明时，"多核苷酸或寡核苷酸模拟物"是指其中一个或多个骨架糖-磷酸酯键被糖-磷酸酯类似物替换的核碱基聚合物或寡聚体。 这样的模拟物能够与互补的多核苷酸或寡核苷酸，或者多核苷酸或寡核苷 酸类似物或者与其它多核苷酸或寡核苷酸模拟物杂交，并且可以包括含有 一个或多个下述连接的骨架具有烷基胺侧链的带正电荷的聚酰胺骨架，
如在美国专利号5，786，461;美国专利号5,766,855;美国专利号 5,719,262;美国专利号5,539,082和WO 98/03542中所述(还参见，Haaima 等，1996，爿wgevvcm(^e C7zemZe z'w五wg/Zs/z 35:1939-1942; Lesnick等，
1997,核苷与核苷酸(M/c/ewW. A^c/e油W.)6:1775-1779; D'Costa等，1999, 有机通讯(OgLe") 1:1513-1516，还参见，Nielsen, 1999,现代生物技术 观点(CWrC^"A'ofec/mo/) 10:71-75);不带电荷的聚酰胺骨架，如在WO 92/20702和美国专利号5,539,082中所述；不带电荷的吗啉代亚磷酰胺骨 架，如在美国专利号5,698,685，美国专利号5，470,974，美国专利号 5，378，841和美国专利号5,185,144中所述(还参见，Wages等，1997，生物技术
(说orec/7m々WM) 23:1116-1121);基于肽的核酸模拟物骨架(参见，例如， 美国专利号5,698,685);氨基甲酸酯骨架(参见，例如，Stirchak和Summerton, 1987,有机化学杂志U <>g C/jew) 52:4202);酰胺骨架(参见，例如， Lebreton， 1994,5>"/故.1994:137);甲基羟胺骨架(参见，例如，，Vasseur等, 1992,美国化学学会杂志(J Jw 5V c) 114:4006); 3，-硫甲酰
(3，-thioformacetal)骨架(参见，例如，Jones等，1993,有机化学杂志U(9rg Cfem) 58:2983)和氨基磺酸酯骨架(参见，例如，美国专利号5,470,967)。 前述所有公布都通过引用结合于此。
在一些实施方案中，所述核碱基聚合物可以包括嵌合的核碱基聚合 物。"嵌合的核碱基聚合物"或"嵌合的寡核苷酸"是指包含多个不同的多 核苷酸、多核苷酸类似物和多核苷酸模拟物的核碱基聚合物或寡聚体。例 如，嵌合的寡聚体可以包括与RNA序列连接的DNA序列。嵌合寡聚体的其 它实例包括与PNA连接的DNA序列，和/或与PNA序列连接的RNA序列。
因为任一种上述任何化合物类型可以是结合相互作用的部分，所以可 以使用本发明的方法检验不同类型的结合相互作用。这些特别包括在小分 子-小分子，小分子-多肽，小分子-核碱基聚合物，多肽-多肽，多肽-核碱基 聚合物，核碱基聚合物-核碱基聚合物，脂质-蛋白，以及脂质-核酸之间的相互作用。
小分子-小分子相互作用的实例特别包括包合物与其相对应的客体分 子的相互作用。示例性的包合物是环糊精，其是通常由5个或更多个吡喃 葡糖苷单位组成的环状寡糖。在一些实施方案中，环糊精可以在环中包含 6-8个单位的葡萄糖单体，如0C-环糊精，其是一种六元环的分子；卩-环糊精， 其是一种七元环的分子；和Y-环糊精，其是一种八元环的分子。环糊精可 以与其它小的有机分子结合，其特别包括，杀虫剂敌百虫(trichlorfone); 胆固醇和其它固醇；以及各种亲脂性药物(例如，阿苯达唑(albendazole), 甲苯达唑(mebendzole),地高辛(digitoxin)，异丁普生(ibuproxam), prioxicam,左依莫帕米(levenopamil),舒林酸(sulindac),禾口达另卩唑 (danazol))。另一种示例性的包合物是冠醚，其通常是乙烯氧，即 -CH2CH20-的环形寡聚体，并且特征在于其通过氧原子使阳离子成为溶剂 化物的能力，所述氧原子与在环内部分的阳离子配位。冠醚的内部的尺寸 决定它可以溶剂化的阳离子的尺寸，以致18-冠醚-6结合钾阳离子，15-冠 醚-5结合钠阳离子，禾B12-冠醚-4结合锂阳离子。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析小分子和蛋白之间的结合相 互作用。小分子-蛋白相互作用的实例特别包括，佛波醇酯与佛波醇酯受体 的相互作用；雌激素和雌激素类似物与雌激素受体的相互作用，睾丸激素 与雄激素受体的相互作用，阿片剂与阿片剂受体之间的相互作用，四环素 或doxydine与Tet控制的反式激活蛋白(tTA)的相互作用；甘露糖与甘露糖 结合蛋白的相互作用；N-连接的多糖与伴刀豆球蛋白A的相互作用；P-半 乳糖苷与半乳凝素的相互作用；麦芽糖与麦芽糖结合蛋白(MalE)的相互作 用；阿拉伯糖与阿拉伯糖结合蛋白的相互作用，多巴胺与多巴胺受体的相 互作用，以及5-羟色胺与5-HT-受体的相互作用。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析小分子和核碱基聚合物之间 的结合相互作用。与核碱基聚合物相互作用的小分子的实例特别包括， DNA嵌入剂(例如，溴化乙锭,DAPY，氨基吖啶，吖啶橙，原黄氣道诺霉 氣放射霉素，YO,禾口YOYO,等)；顺铂药物(例如，顺式-二胺二氯铂)， benzypyrene,托泊替康，喜树碱，纺锤菌素，吡咯-咪唑(Py-Im)聚酰胺，和 苯丁酸氮芥。能够与核碱基聚合物相互作用的其它小分子对于熟练的技术
32人员是显而易见的。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析多肽-多肽相互作用。已知许 多多肽与其它多肽结合，包括与修饰的多肽如磷酸化或脂质化多肽的结 合。在一些实施方案中，多肽-多肽相互作用可以通过蛋白相互作用结构域 发生。因此，该方法可以用于检验具有各种蛋白-相互作用结构域的多肽与 它们的同源受体结构域之间的相互作用。示例性的蛋白-蛋白相互作用结构
域包括，例如但不限于，SH2结构域(src同源结构域2),SH3结构域(src同 源结构域3), PTB结构域(磷酸酪氨酸结合结构域)，FHA结构域(叉形头 (forkedhead)相关的结构域)，WW结构域，14-3-3结构域血小板-白细胞C 激酶底物同源结构域，Cl结构域，C2结构域，FYVE结构域(Fab-1, YGL023, Vps27，和EEA1)，死亡结构域，死亡效应器结构域，胱天蛋白酶募集域， Bd-2同源结构域，溴代结构域，染色质组织修饰结构域，F盒结构域，hect 结构域，环结构域(锌指结合结构域)，PDZ结构域(PSD-95, discs large, 和闭锁小带(zona occludens)结构域)，不育a基序(sterile a motif)结构域， 锚蛋白结构域，arm结构域(犰狳蛋白重复基序)，WD 40结构域和EF-手 (钙视网膜蛋白)，以及PUB结构域(Suzuki T等，2001,生物化学生物物理 学研究通讯(历oc/zem所o/ /z;^ O wwm") 287:1083-87)。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析多肽-核碱基聚合物相互作 用。可以与核碱基聚合物相互作用的多肽的实例特别包括，肽偏端霉素A， 合成的两亲性肽Ac-(Leu-Ala-Arg-Leu)3-NH-接头，禾Q 310-螺旋 Ac-(Aib-Leu-Arg)4-NH-接头，其含有[(3]-环-构建剂[a]-氨基异丁酸(Aib)。 在其它实施方案中，与核碱基聚合物相互作用的蛋白可以包括参与调节核 酸代谢的多种多肽，诸如例如，转录激活剂、增强子结合蛋白、转录抑制 剂、染色体模拟蛋白、DNA复制蛋白等。与蛋白-蛋白相互作用结构域相 似，许多与蛋白结合的核碱基聚合物通过普通结构和功能的特异性结构域 与聚合物相互作用。示例性的相互作用结构域包括，例如但不限于，螺旋 -转角-螺旋结构域，螺旋-环-螺旋，亮氨酸拉链结构域，同源框结构域，锌 指结构域，配对结构域，LIM结构域，ETS结构域，和T盒结构域。示例性的 多核苷酸结合蛋白特别包括GAL-4， X Cro蛋白，Jun/Fos复合物，GCN-4, CREB,类视黄醇-X-受体，类视黄醇受体，维生素D受体，TFIIA, krupple,Antp, Ubx， myc, myb, NF-kb, Stat蛋白(例如，Stat 1， State 2, Stat 3. Stat 4,Stat 5，等)，MADS盒蛋白，TATA结合蛋白，视网膜母细胞瘤蛋白，组蛋白(例如，HI (H5), H2A, H2B H3，和H4)，错配结合蛋白(例如，Cel I),拓扑异构酶,uvrABC核酸内切酶，光复活酶，单链结合蛋白(ssb),禾0recA。适用于本发明方法的其它DNA结合蛋白对于熟练的技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析核碱基聚合物-核碱基聚合物相互作用。如上文讨论，核碱基聚合物包括多核苷酸，多核苷酸类似物,和多核苷酸模拟物。在一些实施方案中，其中受体成分包括多核苷酸，诸如寡核苷酸，结合成分可以包括基本上互补的寡核苷酸或多核苷酸。当用于本发明时，术语"基本上互补"是指在用于使核碱基聚合物退火或杂交的条件下能够与互补序列特异性杂交的核碱基聚合物序列。当用于本发明时，"退火"或"杂交"是指一个核碱基聚合物与另一个的碱基-配对相互作用，其导致形成双链结构、三链结构或在核碱基聚合物之间通过碱基配对相互作用形成的其它结构。退火或杂交可以通过沃森-克里克碱基-配对相互作用发生，但是可以通过其它氢键相互作用诸如Hoogsteen碱基配对调控。
在一些实施方案中，核碱基聚合物的退火特征可以通过杂交复合物的7yf角定。7U直越大，杂合体越稳定。7;是50%的核碱基寡聚体与其完全的
补体形成双链寡聚体结构的温度。对于所选的核碱基聚合物的j;,还随着影
响或改变杂交的因素改变。例如，这样的因素包括，但不限于，通常用于影响或控制杂交严格性的因素，(即，甲酰胺浓度(或其它化学变性剂)，盐浓度(即，离子强度)，杂交温度，变性剂浓度，pH和包含物的存在或不存在)。对于形成杂合体组合的最佳严格性可以通过固定一些前述严格性因素然后确定改变单个严格性因素的作用的公知技术而找到。可以调节相同的严格性因素来控制PNA与构架杂交的严格性，除了PNA的杂交完全
不依赖于离子强度之外。最佳的或适合的严格性条件可以通过检验每个严格性因素直到获得理想的区分程度而凭经验确定。
核碱基寡聚体的rm值可以使用预测熔融温度的已知方法进行计算(参见，例如，Baldino等，酶学方法(MeAoA Ewzymo/o") 168:761-777;Bolton等，1962,美国国家科学院学报(ZVoc. A^/」cW. 48:1390;Bresslauer等，1986，美国国家科学院学报(Prac.Ato/. A^/.83:8893-8897; Freier等,1986,美国国家科学院学报(户rac.腐如d,)83:9373-9377; Kierzek等，生物化学(肠c/z簡勿)25:7840-7846;Rychlik等，1990,核酸研究(A^c/e/c JczA 18:6409-6412; Sambrook等,2001,分子克隆..实验室手册(7kfo/ecw/"rC7ow'"f J￡Worato,_yM3m^/),第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港，纽约；Suggs等，1981,在利用纯化的基因的发育生物学(Deve/opme"to/所o/ogy C/w'"g尸w折^/中(Brown等，编)，第683-693页，学院出版社(Academic Press);和Wetmur， 1991,生物化学分子生物学评论综述(O"i ev所oc/^mAfo/所o/) 26:227-259;所有的公布通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，所述基本上互补的寡核苷酸或多核苷酸可以包括与受体寡核苷酸或多核苷酸错配的至少一个核苷酸。本发明的方法可以用于检验具有与受体多核苷酸错配的核苷酸的基本上互补的多核苷酸的退火。在一些实施方案中，取决于基本上互补区域的长度，被检验的核苷酸错配的数目可以包括2个或更多个核苷酸错配，约5个核苷酸错配，约10个或更多个核苷酸错配，或约20个核苷酸错配或更多。核苷酸错配的数目可以包括在所述基本上互补的区域中多达至少约0.5%,约1%,约2%,约5%，约10%，约20%多达约30%的核苷酸残基。
在一些实施方案中，基本上互补的寡核苷酸或多核苷酸与相对应的受体寡核苷酸或多核苷酸的退火特征可以在不同退火条件下进行检验。参数，诸如例如，离子强度，离液剂，氢键分裂剂(例如，甲酰胺，尿素),pH，G/C含量，以及温度可以进行变化，以确保退火行为，诸如确定检测错配的最佳条件。这样的分析可以有效用于选择特别的寡核苷酸作为探针，来检测归因于特定基因中的特异性核苷酸序列改变的遗传学上可遗传的病症。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析包括脂质和与脂质结合的蛋白的结合相互作用。示例性的脂质-蛋白相互作用特别包括，单酰基化的脂质与下列各项的相互作用脂质转移蛋白(Douliez等，2001，欧洲生物化学杂志(Ewr./所oc/7em) 268,384-388);脂肪酸，视黄醇，以及其它疏水性配体与脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)的相互作用；脂肪酸和花生酸与脂肪
35酸结合蛋白(FABP)的相互作用；脂肪酸CoA酯与酰基-CoA-结合蛋白 (ACBP)的相互作用；磷脂与磷脂结合蛋白(例如，copine)的相互作用；以及 磷脂酰肌醇与磷脂酰肌醇转移蛋白的相互作用。
在一些实施方案中，该方法可以用于分析脂质-核酸相互作用。通常， 这些包括采取作用为多核苷酸载体的脂质体或胶束形式的阳离子脂质。脂 质体可以由不同的脂质和脂质组合形成，特别包括，磷脂酰肌醇，磷脂酰 乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，二甲基双十八烷基溴化铵，二油基磷脂酰乙醇胺， 二油基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和胆固醇。用于形成脂质体的其 它脂质，包括例如但不限于，阳离子脂质D282，D378,D383，D3886,D3897 和D3899，(分子探针(MolecuIar Probes), Eugene, Oregon,美国)。
在其它实施方案中，该方法可以用于分析包括抗体和由该抗体结合的 抗原的结合相互作用。"抗原"是指任何分子或分子基团，其包括小的有 机分子，碳水化合物，脂质/脂肪酸，多肽，和被至少一个抗体识别的核碱 基聚合物。抗原包括能够被所述抗体识别的至少一个表位或决定簇。"抗 体"是指免疫学结合试剂"抗体"是指包括通过二硫键连接的至少两个重 (H)链和两个轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链包括重链可变 区(在此处简写为VH)和重链恒定区。IgG重链恒定区包括4个结构域，艮P, CH1,铰链，Ch2和Ch3。每条轻链包括轻链可变区(在此处简写为VJ和轻 链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域即Ct。 Vh和Vl区可以迸一歩再分 成高可变区，其叫作互补决定区(CDR)，其配置有更保守的区域，该更保 守的区域叫作构架区(FR)。毎个Vh和Vl由3个CDR和4个FR組成，其从氨 基端到羧基端以下列顺序排列FR1, CDR1， FR2, CDR2, FR3， CDR3, FR4。 重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可 以调节免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括各 种免疫系统细胞(例如，效应器细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq). 抗体包括不同同种型的抗体，其包括IgG, IgM， IgD,和IgA同种型的那些, 和任何抗原结合片段(即，"抗原-结合部分")或其单链，和片段，诸如Fab和 (Fab)2片段。
抗体可以是多克隆的或单克隆的。当用于本文时，"单克隆抗体"或 "单克隆抗体组合物"是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组
36合物通常表现出对特别表位的单一结合特异性和亲和力。术语"人单克隆 抗体"是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的表现出单 --结合特异性的抗体。
抗体也可以是单链Fv ("sFv")抗体，其是共价连接的VH::VL杂二聚体。
这些单链抗体可以由包括通过编码肽的接头连接的VH-和VL-编码基因的
基因融合体表达(参见，例如，Huston等，1988,美国国家科学院学报(尸rac. 淑.灰ac/. 6W.园)85(16):5879-5883)。已经描述了许多方法，用来区分 这样的化学结构，该化学结构用来将来自抗体V区的天然聚集的但是化学 分离的轻链和重链抗体链转化成sFv分子，该sFv分子将折叠成与抗原-结合 位点结构基本上相似的三维结构(参见，例如，美国专利号5,091,513; 5,132,405;和美国专利号4,946,778)。
利用本发明的方法检验抗体-抗原结合相互作用可以提供关于结合强 度的信息，并且在一些情形中，提供关于所结合的抗原部分的信息。在一 些实施方案中，被分析的抗体可以针对任何细胞分子，诸如为了诊断或治 疗病症的目的(例如，抗TNF-a，抗-Her-2，抗-CTLA-4，等)。
在其它实施方案中，该方法可以用来检验酶以及其与结合成分如底 物、抑制剂或激活剂的相互作用。术语"酶"是指能够催化化学和生物反 应的分子或分子聚集物，并且包括，但不限于，多肽、肽、RNA、 DNA、 核酶、抗体和其它可以促进化学或生物反应的催化的分子。用于分析的示 例性的酶可以包括，例如但不限于，血管紧张素转化酶，DNA聚合酶，反 转录酶，蛋白酶，酯酶，激酶(例如，酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸)，螺旋酶，拓 扑异构酶，端粒末端转移酶，核酸酶，磷酸酶，异构酶，和氧化还原酶。依 据选择用于分析的酶，关于所述酶的各种底物、抑制剂和激活剂对于熟练 的技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，所述结合成分可以是结合成分文库的一员，并且 该方法可以用于检验该文库中每个成员的结合相互作用。"结合成分的文 库"是指多种不同的结合成分，其可以关于与受体成分相互作用的能力进 行筛选。通过鉴定表现出最佳结合特征的结合成分，可以鉴定有效用于影 响受体成分的性质的结合成分，所述最佳结合特征例如平衡解离常数、缔 合速率和解离速率。制备化合物的文库对本领域的技术人员是公知的。这样的组合化合物
文库包括，但不限于，肽文库(参见，例如，美国专利号5,010,175, Furka, 1991，肽蛋白质研究(Pe/ /.Ae&) 37:487-493， Houghton等，1991,自 然(A^w")， 354:84-88，拟肽(PCT公布号WO 91/19735),编码的肽(PCT公 布WO 93/20242)，随机生物寡聚体(PCT公布WO 92/00091),苯二氮杂萆 类(美国专利号5,288，514), diversomers，诸如乙内酰脲，苯二氮杂萆类和二 肽(Hobbs等，1993,美国国家科学院学报(尸rac Ato ^cad Sc/ V&O 9010:6卯9-6913),插烯性(vinylogous)多肽(Hagihara等，1992，美国化学 学会杂志(■/C7ze附.) 114:6568),非肽肽模拟物(Hirschmann等, 1992,美国化学学会杂志(JJmwC/7emSoc) 11415:9217-9218)，低聚氨基 甲酸酯(Cho,等，1993,科学(SdMce) 261:1303)，肽基磷酸酯(Campbell 等，1994,有机化学杂志aC^C7z柳)59:658; Gordon等，1994,医学化学 杂志(/7kfedC7^w) 37:1385),核酸文库(Sambrook等，同上)，肽核酸文库 (参见，例如，美国专利5,539,083)，抗体文库(参见，例如，Vaughn等，1996, 自然生物技术 (A^we 所ofec/z"o/ogy ) 14(3)20:309-314),禾口 PCT/US96/10287),碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，1996,科学
"dwce) 274:1520-1522，和美国专利号5，593,853)，以及小有机分子文库 (参见，例如，类异戊二烯，美国专利号5,569,588;噻唑烷酮和间噻嗪垸酮
(metathiazanones),美国专利号5,549,974;吡咯烷，美国专利号5,525,735 和5,519,134;吗啉代化合物，美国专利号5,506,337;苯二氮杂萆类，美国 专利号5,288,514)。
为了所有目的，在本申请中引用的所有公布、专利、专利申请和其它 文献都通过引用完全结合于此，其程度与为了所有目的单独指明每篇单个 的公布、专利、专利申请或其它文献通过引用而结合的程度相同。
在本文所用的任何词语或词组的定义与用法与任何其它文献包括通 过引用结合于此的任何文献中的词语或词组的定义和/或用法有冲突的情 形中，本发明中的词语或词组的定义和/或用法应该总是起控制作用。
尽管联系各种实施方案描述了本发明教导的内容，但是并不意欲将本 发明教导限制为所述实施方案。相反，本发明教导包括各种备选方案、修 改和等价物，这是本领域的那些技术人员应该理解的。
权利要求
1. 一种分析溶液中结合相互作用的方法，所述方法包括(a)使一种或多种结合成分与受体成分接触，其中未结合的和任何结合的成分能够通过孔转移；(b)通过使所述未结合的和结合的成分通过所述孔转移而检测所述未结合的和任何结合的成分，其中所述检测是通过使电荷诱导的场效应成像而进行的；和(c)确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数目。
2. 权利要求1的方法，其中所述孔包括纳米孔。
3. 权利要求l的方法，其中对所述未结合的和任何结合的成分进行计数。
4. 权利要求l的方法，其中在不同浓度的结合和受体成分下确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数目。
5. 权利要求l的方法，其中在不同浓度的结合成分和在恒定浓度的受体成分下确定按受体成分的数目计的结合的结合成分的数百。
6. 权利要求l的方法，其中所述受体成分具有与所述结合成分的n个相互作用位点。
7. 权利要求6的方法，其用于其中n是l的结合相互作用。
8. 权利要求6的方法，其用于其中n是2-10的结合相互作用。
9. 权利要求6的方法，其用于其中所述相互作用位点具有相同的平衡结合常数的结合相互作用。
10. 权利要求6的方法，其用于其中至少两个所述相互作用位点具有不同的平衡结合常数的结合相互作用。
11. 权利要求6的方法，其用于其中至少两个所述相互作用位点表现出协同相互作用的结合相互作用。
12. 权利要求6的方法，其中所述相互作用位点包括至少第一和第二相互作用位点，其中所述第一和第二相互作用位点是不同的。
13. 权利要求l的方法，其用于其中所述结合成分和所述受体成分是相同的结合相互作用。
14. 权利要求l的方法，其用于其中所述结合成分和受体成分是不同的 结合相互作用。
15. 权利要求l的方法，其中所述结合成分包括至少第一和第二结合成 分，其中所述第一和第二结合成分是不同的。
16. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二结合成分竞争性地与所 述受体成分结合。
17. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二结合成分非竞争性地与所述受体成分结合。
18. 权利要求l的方法，其中所述结合成分是结合成分文库的一员，并 且分析所述文库中每个成员的结合相互作用。
19. 权利要求l的方法，其中所述受体成分包括与所述结合成分结合的 蛋白。
20. 权利要求19的方法，其中所述蛋白包括酶。
21. 权利要求19的方法，其中所述蛋白包括细胞受体。
22. 权利要求21的方法，其中所述细胞受体包括细胞表面受体。
23. 权利要求19的方法，其中所述结合成分包括所述蛋白的激动剂。
24. 权利要求19的方法，其中所述结合成分包括所述蛋白的拮抗剂。
25. 权利要求19的方法，其中所述结合成分包括约500-约3000道尔顿的小的有机分子。
26. 权利要求19的方法，其中所述蛋白包括抗体。
27. 权利要求26的方法，其中所述结合成分包括被抗体结合的抗原。
28. 权利要求l的方法，其中所述受体成分包括寡核苷酸。
29. 权利要求28的方法，其中所述结合成分包括约500- 3000道尔顿的小的有机分子，所述小的有机分子结合寡核苷酸。
30. 权利要求28的方法，其中所述结合成分包括与所述寡核苷酸结合 的蛋白。
31. 权利要求28的方法，其中所述结合成分包括基本上互补的寡核苷酸。
32. 权利要求31的方法，其中所述基本上互补的寡核苷酸具有至少单 个核苷酸错配。
全文摘要
本发明内容涉及分析在结合成分和受体成分之间的结合相互作用的方法，该方法通过将未结合的和任何结合的成分通过孔转移并且检测所述未结合的和结合的成分进行。
文档编号G01N33/53GK101490551SQ200780027247
公开日2009年7月22日 申请日期2007年6月14日 优先权日2006年6月30日
发明者孙洪业, 肯尼思·J·利瓦克 申请人:阿普里拉股份有限公司