专利名称：一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种固相酶联免疫检测试剂盒，具体涉及一种检测非人灵长类实验动物多项病毒的梳式斑点固相酶联多项病毒检测试剂盒。
背景技术：
灵长类实验动物是研究病毒感染性疾病、神经系统疾病及肿瘤等疾病和新药研发所必需的重要动物模型。随着研究的深入，对灵长类实验动物的需求量及其品质的要求也不断提高。我国科技部已经制定实验猴健康标准，明确要求普通级动物必须是B病毒阴性，SPF级动物必须是B病毒、包括STLV、SIV、SRV在内的逆转录病毒等阴性，但因为缺乏可靠 的检测方法，灵长类实验动物健康检测远远跟不上行业发展的需要，因此，提供一种灵敏度高、特异性强、检测速度快、效率高的猴病毒检测方法已成为必然的需求。现有的检测方法主要是玻片法和ELISA方法，该两种方法一次只能检测出一种病毒，操作繁琐，检测的速度慢、效率低。
发明内容为解决现有技术的不足，本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、检测速度快、效率高的梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒。为达到上述目的，本实用新型是通过以下的技术方案来实现的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，包括抗原梳、与抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部设置有多个平行的梳齿，所述的梳齿上贴附有按顺序预点了若干项病毒抗原的硝酸纤维膜。其中,所述的梳齿为12条,且所述的深孔板为lml96孔,深孔板每排具有12个孔，与12条梳齿一一对应，而所述的梳齿的长度与深孔板的深度相配合。此外，所述的抗原梳的材质为PVC板。所述的塑料平皿的尺寸为12cm*12cm。而所述的硝酸纤维膜上预点的抗原为实验猴易感的B病毒(BV)、猴T细胞趋向性病毒I型(STLV-I)和猴逆转录D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多种病毒中的至少一种。此外，还包括一台用于将染色后的抗原梳成像的成像仪。而通过成像仪将染色后的抗原梳拍成照片，再经过软件的处理和分析，可以对结果做定量分析。上述抗原梳使用硝酸纤维膜作为病毒抗原的载体，将所需检测的病毒抗原按顺序点布在硝酸纤维膜上，将该硝酸纤维膜贴于PVC板材制成的梳齿上。将梳齿置于加了待检样本的稀释液中，样本中相关的病毒抗体和硝酸纤维膜上相应的抗原发生特异性结合，然后加入酶标二抗，形成抗原-抗体-酶复合物，最后加入显色剂显色一定时间后终止反应，通过所述一系列的反应使得相应的抗原点呈现肉眼可见的斑点，达到定性检测病毒的目的。[0012]本实用新型的有益效果是本实 用新型提供的检测试剂盒，可在两小时内，一次性同时检测出多种病毒抗体，实现了多种病毒同步检测，减少了每个标本的采样量。一把抗原梳可以同时检测12份样本，一次实验可以同时操作多把抗原梳，大大提高了检测的速度和效率。使用硝酸纤维膜作为固相载体，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反应的效率和敏感性，而且可批量加工，且易于保存，稳定性及重复性好，结果可靠，检测过程不需要特殊仪器设备，结果可以肉眼观察，并能长期保存，适合养殖场或基层单位使用。

图I为本实用新型所述的抗原梳的结构示意图；图2为本实用新型所述的与图I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯视图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作具体的介绍。图I为本实用新型所述的抗原梳的结构示意图；图2为本实用新型所述与图I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯视图。如图I和图2所示梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，包括抗原梳I、与抗原梳I相匹配的Iml96孔深孔板2和12cm*12cm的塑料平皿(图中未示出)，所述抗原梳I的材质为PVC板，其上贴附有按顺序预点了若干抗原的硝酸纤维膜3。所述抗原梳I有12个梳齿，以及所述的Iml深孔板每排有与所述的梳齿对应个数的12个孔，共八排，梳齿的长度与深孔板的深度相配合，保证深孔板里面的液体能将抗原梳I的梳齿浸没。而本实用新型还可以额外配备一台成像仪，通过成像仪将染色后的抗原梳拍成照片，再经过软件的处理和分析，可以对结果做定量分析。此外，所述的硝酸纤维膜上所预点的抗原为猴血清中B病毒(BV)、猴T细胞趋向性病毒I型(STLV-I)和猴逆转录D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多种病毒中的至少一种病毒。而将梳齿置于加了待检样本的稀释液中，即插入到深孔板2的孔中，样本中相关的病毒抗体和硝酸纤维膜3上相应的抗原发生特异性结合，然后加入酶标二抗，形成抗原-抗体-酶复合物，最后加入显色剂显色一定时间后终止反应，通过所述一系列的反应使得相应的抗原点呈现肉眼可见的斑点，达到定性检测病毒的目的。梳式斑点多项病毒检测试剂盒对病毒抗原的定性检测。I.梳式斑点多项病毒检测试剂盒内的材料及试剂(I) 12*12cm 塑料平皿；(2)96 孔 Iml 深孔板；(3)将所需检测的病毒抗原按矩阵点于硝酸纤维膜上，具体为如图I所示图中每个梳齿上点有九个点，第一和第九个标记点(颜色实际为紫色)为用于定位的甲基紫点33，位于两者之间的点为病毒的抗原点32及其对照细胞31 ；(4)然后将上述硝酸纤维膜贴于0. 2mm厚原带胶的PVC板上,再切为长4cm、宽6mm的梳齿，将没有抗原的一端夹在两块厚0. 4mm原带胶的长12cm、宽Icm的PVC板之间，就制成了抗原梳1，4°C干燥保存。(5)碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG 二抗购自KPL ；(6)快红购自 Sigma ;(7)萘酹购自 Sigma ;(8)配Ix磷酸盐缓冲液(PBS，0. 01 M, pH 7. 2 7. 4)，室温保存；(9)在1000 ml PBS中加入I ml 100%吐温，充分混匀，得0. 1%PBST洗涤液，室温保存；(10)取适量BSA粉末，加入Ix PBS配成含1%BSA的样本稀释液，4°C保存； (11)配 Tris 缓冲液(0. 2 M, pH 8. 0)，室温保存；(12)配0. 1% EDTA反应终止液，室温保存；2.操作步骤(I)将抗原梳I从冰箱拿出，平衡20-30分钟至室温。(2)将待检血清样本按照I :100的比例用1%BSA稀释于Iml深孔板中。(3)将稀释好的血清震荡混匀，再将抗原梳I插入Iml深孔板2的样本稀释液中，室温反应30分钟。(4)孵育结束后，取出抗原梳1，置于加入洗涤液的12*12cm塑料平皿中，置于摇床上中速摇动，每个塑料平皿可放置1-3把梳子，洗涤5遍，每遍I分钟。(5)将碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗猴IgG)按所需浓度稀释混匀后加入平皿中，置室温(20-25 °C)孵育30分钟。(7)倒出二抗溶液，加入洗涤液，在摇床上中速摇动。洗涤5遍，每遍I分钟。(8)称取30 mg快红溶于10 ml Ix Tris缓冲液中，4mg萘酚溶于10 ml超纯去离子水(或蒸馏水)。将显色液混匀后加入塑料平皿中，染色5分钟。将抗原梳转移至含20ml终止液的塑料平皿中，反应I分钟，然后用水冲洗抗原梳I片刻，置于空气中自然晾干，最后判读结果。染色后，病毒抗体阳性的点呈红色(可视点)，病毒抗体阴性的抗原点无着色。3.结果判定，可以选用3. I和/或3. 2所述方式进行判读。3. I肉眼判读阳性⑵若对照细胞点无色或颜色很淡，但病毒抗原点颜色达试剂盒中提供的阳性对照点深度或更深，则判为阳性；阴性(N):若病毒抗原点无色，或颜色很浅且与相应对照细胞点接近，判为阴性。3. 2对检测结果做定量分析。取获得的带有免疫斑点的抗原梳I,通过成像仪将免疫梳I成像,再用Image J软件进行处理和分析。即可对所检测的病毒抗体做定量分析。本实用新型提供的检测试剂盒，可在两小时内，一次性同时检测出B病毒、STLV、SIV、SRV、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多种病毒抗体中的任意数种，实现了多种病毒同步检测，减少了每个标本的采样量。一把抗原梳I可以同时检测12份样本，一次实验可以同时检测多把抗原梳，大大提高了检测的速度和效率。预点了若干病毒抗原的硝酸纤维膜可批量加工，且易于保存，稳定性及重复性好，结果可靠。上述实施例不以任何形式限制本实用新型，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本实用新型的保 护范围内。
权利要求1.一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，包括抗原梳、与抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部设置有多个平行的梳齿，所述的梳齿上贴附有按顺序预点了若干项病毒抗原的硝酸纤维膜。
2.根据权利要求I所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的梳齿为12条。
3.根据权利要求I或2所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的抗原梳的材质为PVC板。
4.根据权利要求I所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的深孔板为lml96孔，且深孔板每排具有12个孔，而所述的梳齿的长度与深孔板的深度相配合。
5.根据权利要求I所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的塑料平皿的尺寸为12cm*12cm。
6.根据权利要求I所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维膜上预点的抗原为实验猴易感的B病毒、猴T细胞趋向性病毒I型和猴逆转录D型病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒中的至少一种病毒抗原。
7.根据权利要求I或2任一权利要求所述的一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于还包括一台用于将染色后的抗原梳成像的成像仪。
专利摘要本实用新型公开了一种梳式斑点酶联免疫多项病毒检测试剂盒，其特征在于，包括抗原梳、与抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳设置有多个平行的梳齿，所述的梳齿上贴附有按顺序预点了若干项病毒抗原的硝酸纤维膜。本实用新型提供的检测试剂盒，可在两小时内，一次性同时检测出多种病毒抗体，实现了多种病毒同步检测，减少了每个标本的采样量。一把抗原梳可以同时检测12份样本，一次实验可以同时操作多把抗原梳，大大提高了检测的速度和效率。使用硝酸纤维膜作为固相载体，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反应的效率和敏感性，而且可批量加工，且易于保存，稳定性及重复性好，结果可靠。
文档编号G01N33/543GK202393769SQ201120511078
公开日2012年8月22日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者时长军 申请人:苏州西山生物技术有限公司