专利名称：：乙型肝炎病毒基因亚型检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属免疫学检测领域，具体地是一种应用多聚酶链反应(PCR)技术结合限制性内切酶片段长度多态性(RELP)技术对乙型肝炎病毒基因亚型进行检测的方法及试剂盒。乙型肝炎是危害我国人民身体健康的重要疾病，患者及病毒携带者约占人群的15％，目前检测乙型肝炎病毒感染的方法很多，主要有表面抗原、两对半和乙型肝炎病毒DNA的检测，这些技术为乙型肝炎病毒感染的正确诊断起到重要作用，同时仍存在许多问题，临床难以解释，需要更有效的技术和方法加以论证和解决。乙型肝炎病毒学清方法证实有四种重要的亚型(adr、adw、ayr、gyw)，决定这四种亚型的病毒基因基础是由于其S基因的亚型基因碱基序列不同所致。由于S基因是乙型肝炎病毒基因中变异率发生最高的基因区，所以亚型又派生出许多亚亚型，这种基因突变所导致的结果，可以引起临床诊断、治疗的失误，目前检测乙型肝炎病毒亚型的方法主要是反向间接血凝法、ELISA法，这些检测技术属蛋白质水平的检测技术，所观察的亚型及其变异都属蛋白质水平的表型结果，而对其决定亚型的基因和其变异情况了解甚少，由于生物的变异的基础是生物的基因改变，即基因的碱基系列发生改变，随着分子生物技术的发展、基因分析技术的进步，人们越来越重视乙型肝炎病毒基因的遗传变异的分析对临床诊断、治疗引导和促进作用，这就需从更高层次基因水平上对乙型肝炎病毒进行分析。如检测乙肝基因亚型。概括地说，检测乙肝基因亚型具有下述重要意义1、重要的乙肝学清标志俗称两对半，有许多少见模式，目前可以被接受的学说认为是不同的亚型感染引起的，虽这学说有令人信服的理论依据，但到目前为止仍无有效的实验证实，检测乙肝亚型可以对这一学说进行实践检验，对乙肝血清标志物这一特殊现象的研究和临床实验提供有效的技术手段。2、最近的研究发现，乙肝血清学标志即俗称两对半检测中，有许多少见模式是由其相互之间的非特异性交叉反应所引起，这对少见模式是由不同亚型引起的学说是一个很大的冲击，基因亚型分析技术可以为此进一步研究提供有效手段。3、已知乙肝病毒有四种亚型，在易感人群中，不同的种族所易感亚型也有所不同，但表面抗体自然感染变阳性的人群，是自身免疫抵抗力强所致，还是不同亚型所致，只能通过检测乙肝基因亚型来证实。4、丙肝的基因亚型分析技术发展很快，研究发现不同的丙肝亚型对干扰素的敏感性不同，治疗效果也完全不同，乙肝病毒的基因亚型比丙肝多，是否也与疗效有关这是一个非常有意义的课题。5、检测和研究乙肝病毒基因亚型的变异，对研究乙肝基因变异与地区、药物以及种族有何关系有很重要的意义。6、检测和研究乙肝病毒基因亚型的变异，可以对导致乙肝病毒感染所致的肿瘤作更深入的研究。目前国际上仍采用多聚酶链反应(PCR)技术，将乙型肝炎病毒的核酸扩增后进行核酸碱基的序列分析，检测病毒亚型的碱基序列以获得亚型或其变异结果，这种乙型肝炎病毒基因亚型的检测分析方法虽然较精确，但需要极为贵重的仪器，方法较繁琐，费时费力，人财物消耗大，分析成本高，临床推广应用难，尤其对象我国这种经济不发达，而乙肝感染率又高的发展中国家没有实际的推广应用意义。本发明的目的旨在提供一种简便易行、成本较低廉、易推广使用的乙型肝炎病毒基因亚型检测方法及试剂盒。本发明的目的是以下述方式实现的一种乙型肝炎病毒基因亚型检测方法，应用多聚酶链反应(PCR)技术结合限制性内切酶片段长度多态性(RELP)分析技术鉴定乙型肝炎病毒基因亚型，即先用多聚酶链反应(PCR)技术扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，其引物所扩增的片断长度为513个碱基，扩增的基因部位位于S基因区较恒定的区域序列，再用特定的限制性内切酶对多聚酶链反应(PCR)的扩增产物进行切割。其检测试剂盒由多聚酶链反应(PCR)扩增系统和扩增产物酶切系统组成，扩增产物酶切系统酶切酶是经选择的四种限制性内切酶BamHI、MsPI、Hpall和HinfI，扩增产物酶切系统可以是上述四种限制性内切酶其中任意一种，或其中任意两种，或其中任意三种，或其中四种。扩增产物酶切系统最佳为BamHI、MsPI和HinfI或BamHI、Hpall和HinfI。由于用PCR技术扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，片段长度为513个碱基，扩增所设计引物是病毒S基因区较恒定的区域序列，它所扩增出的核酸片段包括所有乙型肝炎病毒各种基因亚型的决定基因，以便进行酶切分析，而由于本发明所使用的四种限制性内切酶能特异性识别忆型肝炎病毒不同的基因亚型的决定碱基序列，对不同的乙型肝炎病毒基因亚型进行不同的切割，能非常容易的判断出乙型肝炎病毒不同基因亚型和发现其基因的变异，这种方法简便易行，分析成本较低廉，也无需贵重仪器，检测速度快(4小时以内可出结果)，只要能开展PCRT作的单位都可以应用此方法和试剂盒，宜推广使用。实施例1试剂盒由多聚酶链反应(PCR)扩增系统和扩增产物酶切系统组成，酶切系统为限制性内切酶BamHI；其检测方法是，先用PCR扩增系统扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，其引物所扩增的片断长度为513个碱基，扩增的基因部位位于S区较恒定的区域序列；再用BamHI对扩增产物进行切割，可对四种乙型肝炎病毒基因亚型(adr、adw、ayr、ayw)作出鉴定和变异分析。实施例2试剂盒由多聚酶链反应(PCR)扩增系统和扩增产物酶切系统组成，酶切系统为限制性内切酶BamHI和MsPI；其检测方法是，先用PCR扩增系统扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，其引物所扩增的片断长度为513个碱基，扩增的基因部位位于S区较恒定的区域序列；再用BamHI和MsPI对扩增产物进行切割，可对乙型肝炎病毒基因亚型三种(adr、adw、ayw)作出鉴定和变异分析。(见表1)</tables>实施例3试剂盒由多聚酶链反应(PCR)扩增系统和扩增产物酶切系统组成，酶切系统为限制性内切酶BamHI、MsPI和HinfI；其检测方法是，先用PCR扩增系统扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，其引物所扩增的片断长度为513个碱基，扩增的基因部位位于S基因区较恒定的区域序列；再用BamHI、MsPI和HinfI对扩增产物进行切割，BamHI、MsPI和HinfI可对乙型肝炎病毒基因亚型四种(adr、adw、ayl、ayw)作出鉴定和变异分析。因MsPI和Hpall是同功酶，在实施酶切时，两者可以替代或混合使用，功能和效果是一致的。权利要求1.一种乙型肝炎病毒基因亚型检测方法，其特征在于其检测方法是应用多聚酶链反应(PCR)技术结合限制性内切酶片段长度多态性(RELP)分析技术鉴定乙型肝炎病毒基因亚型，即先用多聚酶链反应(PCR)技术扩增出乙型肝炎病毒核酸的S基因区，其引物所扩增的片断长度为513个碱基，扩增的基因部位位于S基因区较恒定的区域序列，再用特定的限制性内切酶对多聚酶链反应(PCR)的扩增产物进行切割。2.一种乙型肝炎病毒基因亚型检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由多聚酶链反应(PCR)扩增系统和扩增产物酶切系统组成，扩增产物酶切系统酶切酶是经选择的四种限制性内切酶BamHI、MsPI、Hpall和HinfI，扩增产物酶切系统可以是上述四种限制性内切酶其中任意一种，或其中任意两种，或其中任意三种，或其中四种。3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于所述扩增产物酶切系统最佳为BamHI、MsPI和HinfI或BamHI、Hpall和HinfI。全文摘要本发明涉及一种乙型肝炎病毒基因亚型检测方法及试剂盒,其检测方法是应用多聚酶链反应(PCR)技术结合限制性内切酶片段长度多态性分析技术鉴定乙肝病毒基因亚型,检测试剂盒由PCR扩增系统和扩增产物酶切系统组成,酶切系统的酶切酶是经选择的四种限制性内切酶:BamHI、MsPI、HpalI和HinfI,用该试剂盒能方便快捷地对四种乙肝亚型(adr、adw、ayr、ayw)作出鉴定和变异分析,便于乙肝的临床诊断和治疗引导。文档编号G01N33/576GK1184255SQ97109278公开日1998年6月10日申请日期1997年10月21日优先权日1997年10月21日发明者曾真,李沛涛,邬若楠,曹亚申请人:曾真