专利名称：一种甲型h1n1流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于免疫层析检测技术领域，特别涉及一种甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒。
背景技术：
流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，迅速传播。流感病毒分甲型、乙型、丙型三型，甲型流感威胁最大。甲型Hmi流感病毒(猪流感，swine infuenza)，属于正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus Α)。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，有囊膜。其基因为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成，共编码10种蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2)。流感病毒核心的外面覆盖着一层基质蛋白膜，基质蛋白膜外面又覆盖着一层脂膜。有2种重要的跨膜蛋白穿过脂膜突出来，一是红细胞凝集素(Hemagglutinin，HA)，一是神经氨酸酶 (Neuraminidase, ΝΑ)。它们分别在病毒识别靶细胞表面受体以及穿膜、成熟病毒粒子的释放过程中具有重要作用。它们也是流感病毒亚型分型的依据。H有1 15个亚型，N有1 9个亚型(在甲型病毒的情况下)。由于H和N的组合不同，病毒的毒性和传播速度也不相同。人为主要传染源，主要通过飞沫或气溶胶经呼吸道传播，也可通过口腔、鼻腔、眼睛等处黏膜直接或间接接触传播。接触患者的呼吸道分泌物、体液和被病毒污染的物品亦可能造成传播。自从二十世纪八十年代，侧向免疫层析技术发展之初，这项技术就被广泛的接受。 主要是因为其实验设计的简便性侧向免疫层析产品具有小而便于携带的优势，而且大多数产品不需要额外的试剂去实现结果，还有液态样品直接可以用于测试，测试结果也能快速简便的读取，而且经常不需要任何仪器的辅助。其强大的功能在于可以将多个样品同时在同一个产品上测量。其容易和其他技术结合起来综合分析，如警察可以再路边上用一个小型仪器同时测量药物和酒精超标情况。免疫层析试纸条的制作相对容易且成本低、材料成分的改进，加工仪器的改进，更加注意生产质量等都可以增加可信度，精确性。然而，不断涌现的对定量的结果和敏感性的要求对这项技术的提出了更大的挑战。磁性纳米颗粒的出现使得这一技术得到了快速的发展，借助小型仪器对试纸条上免疫磁珠微量磁信号的检测从而对样品实行定量检测，大大提高了检测的灵敏度，使得这一技术得到认可。纳米磁珠免疫层析检测试剂盒检测的基本原理如下利用纳米磁珠标记一种抗原或抗体，成为免疫磁珠，在NC膜上包被相应的配对的抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的抗体或抗原时，免疫磁珠会和样品中的抗原或抗体结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被捕获线上的抗体或抗原捕获，聚集在检测线上，数分钟后，再通过MICT磁信号检测仪测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。磁珠免疫层析试纸条的最大特点是可以通过MICT磁信号检测仪读取磁珠含量，定量检测样本中分析物的含量，而不只是像传统的胶体金一样只能通过肉眼观察或评价其颜色深浅，因此使得结果更精确灵敏，数据客观，易于读取、保存记录
实用新型内容
本实用新型解决的技术问题在于提供一种甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，将超顺磁性纳米颗粒作为标记物，提高了筛查的工作效率，大大提高了检测的灵敏度，既可以定性又可以定量，特别适合大规爆发流行性传染病时进行快速筛查。本实用新型是通过以下技术方案来实现一种甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底板，底板上设有免疫层析分离垫，在免疫层析分离垫的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫和样品垫，在免疫层析分离垫的另一端设有吸水垫；所述的免疫磁珠结合垫是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着与抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HAl相偶联的纳米磁珠；所述的免疫层析分离垫是在硝酸纤维素膜上间隔5 8mm设置检测线T线和质控线C线；T线上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HA2，C线上吸附有羊抗鼠的二抗。所述的免疫层析分离垫上还覆盖有一层保护膜或标志膜。所述的免疫磁珠结合垫和样品垫搭接在靠近检测线的一端，吸水垫搭接在靠近质控线的一端。所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维素膜或无纺布，纳米磁珠为超顺磁性纳米磁珠。与现有技术相比，本实用新型具有以下有益的技术效果1)本实用新型设计的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，通过免疫磁珠结合垫和免疫层析分离垫的设计，在进行免疫层析时，待检样本中包含的病毒偶联于免疫磁珠并进行夹心式抗体的识别捕捉，提高了筛查的工作效率，大大提高了检测的灵敏度， 是一种对甲型Hmi流感病毒快速检测的试剂盒。2)本实用新型设计的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，既可以通过肉眼观测条带颜色的深浅，从而判断是否感染了甲型Hmi流感病毒，也可以通过磁力检测仪(MICT)检测试纸条特定位置上的磁信号，根据磁信号得出待测样品中病毒蛋白的含量， 尤其适合大规爆发流行性传染病时进行快速筛查。3)本实用新型所使用的免疫磁珠为超顺磁性纳米磁珠，不受其他有色杂质干扰， 通过高灵敏度磁性检测仪测量结合在免疫磁性复合物上的微粒所产生的局部磁场效应，进而得出所测分析物的定量结果，并使检测下限高于同类目测法10 1000倍。4)本实用新型提供的快速检测试剂盒，克服了主观观察颜色的缺点，使得判断结果具有客观，准确，更值得信赖；而且其检测结果稳定，实验结果可以保存数月至数年，有利于提供复检的机会并易于保存原始数据。

图1为本实用新型的侧视图；图2为本实用新型的俯视图。[0022]其中1为样品垫；2为免疫磁珠结合垫；3为免疫层析分离垫；4为检测线T线；5 质控线C线；6为吸水垫；7为底板。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型做进一步详细描述，所述是对本实用新型的解释而不是限定。参见图1、图2，一种甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底板7，底板7上设有免疫层析分离垫3，在免疫层析分离垫3的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫2和样品垫1，在免疫层析分离垫3的另一端设有吸水垫6 ；并且免疫磁珠结合垫2和样品垫1 搭接在靠近检测线的一端，吸水垫6搭接在靠近质控线的一端。免疫层析分离垫3上还覆盖有一层保护膜或标志膜，以起到保护作用；所述的免疫磁珠结合垫2是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着与抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HAl相偶联的纳米磁珠；所述的免疫层析分离垫3是在硝酸纤维素膜上间隔5 8mm设置检测线T线4和质控线C线5 ;T线上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HA2，C线上吸附有羊抗鼠的二抗；anti-HAl和anti_HA2是两种针对抗原血凝素HA的抗体。下面说明各个组件部分的制备及磁珠免疫层析试剂盒的组装1、样品垫的处理将玻璃纤维膜用作样品垫，在样品垫处理液中浸泡30min后取出在室温下干燥后放入自封袋里保存备用。样品垫处理液的triton X100, 0. 1-1 %的PVP，0. 02M、PH7-9的磷酸盐缓冲液。 2、以超顺磁性纳米磁珠作为纳米磁珠，取2mg磁珠，用500 μ 1 PH 4-6的MES缓冲液洗涤3次并重悬于485 μ IMES缓冲液中，加入2. 5mg的EDC和NHS，25°C偶联30min，然后用PH7-9的BST缓冲液洗涤磁珠2次并重悬于350 μ 1 BST缓冲液中，再加入50-500 μ g的 anti-HAl单抗。20_25°C偶联过夜12小时，期间在垂直旋转混合仪上不断摇晃。然后用磁力架吸附磁珠洗涤，然后加入含有1-10% BSA的BST溶液中，封闭2-12h，最后洗涤后的磁珠重悬于保存液中。3、免疫结合垫的制备将偶联好的纳米磁珠用喷点仪均勻喷于玻璃纤维膜或无纺布上，在20-25°C干燥条件下干燥2-5小时，制成免疫结合垫。4、免疫层析分离垫的制备以0. OlM PH 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)分别将 anti-HA2单克隆抗体和羊抗鼠二抗配置成2mg/ml的溶液，并用喷膜仪在NC膜上以1 μ 1/ cm的量分别划线作为T线和C线，两条线间距为5-8mm，划线后在37°C干燥30min。5、磁珠免疫层析试剂盒的组装在干燥的室内，温度20_25°C，湿度小于30 %，将已包被好的NC膜放在PVC板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫(2mm)粘贴，在免疫磁珠垫另一侧搭接样品垫 (3mm)，在NC膜的另一侧搭接吸水垫(2mm)；最上面可贴一层标志膜，用来保护试纸条，最后安装在塑料支撑卡中即可。样品的检测及结果的显示将被检血清或尿液平衡至室温，将试剂盒平放，在样品垫上加入80-100 μ 1被检样品，溶液将溶解结合垫上的标记好的磁珠，并在NC膜上发生层析，然后在5 IOmin内用磁力检测仪(MICT)检测试纸条T线、C线上的磁信号，根据磁信号得出待测样品中病毒蛋白的含量， 或直接用肉眼观测条带颜色的深浅，从而判断是否感染了甲型Hmi流感病毒。
权利要求1.一种甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，包括底板(7)，底板 (7)上设有免疫层析分离垫(3)，在免疫层析分离垫(3)的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫 (2)和样品垫(1)，在免疫层析分离垫(3)的另一端设有吸水垫(6)；所述的免疫磁珠结合垫(2)是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着与抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HAl相偶联的纳米磁珠；所述的免疫层析分离垫(3)是在硝酸纤维素膜上间隔5 8mm设置检测线T线和质控线C线；T线上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HA2，C线上吸附有羊抗鼠的二抗。
2.如权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫层析分离垫(3)上还覆盖有一层保护膜或标志膜。
3.如权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁珠结合垫(2)和样品垫(1)搭接在靠近检测线的一端，吸水垫(6)搭接在靠近质控线的一端。
4.如权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维素膜或无纺布，纳米磁珠为超顺磁性纳米磁珠。
专利摘要本实用新型公开了一种甲型H1N1流感病毒免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底板，底板上设有免疫层析分离垫，在免疫层析分离垫的一端顺次搭接有免疫磁珠结合垫和样品垫，在免疫层析分离垫的另一端设有吸水垫；所述的免疫磁珠结合垫是在玻璃纤维素膜或无纺布上附着与抗原血凝素HA的鼠源性抗体anti-HA1相偶联的纳米磁珠；所述的免疫层析分离垫是在硝酸纤维素膜上间隔设置检测线T线和质控线C线。通过免疫磁珠结合垫和免疫层析分离垫的设计，在进行免疫层析时，待检样本中包含的病毒偶联于免疫磁珠并进行夹心式抗体的识别捕捉，提高了筛查的工作效率，大大提高了检测的灵敏度，是一种对甲型H1N1流感病毒快速检测的试剂盒。
文档编号G01N33/569GK202075280SQ20112003130
公开日2011年12月14日 申请日期2011年1月29日 优先权日2011年1月29日
发明者孙建斌, 梁平, 海春旭, 王伟, 赵锦荣, 郭晏海, 雷小英, 颜真 申请人:中国人民解放军第四军医大学