专利名称：与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用的制作方法
与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及定量检测与肝病进程相关的酶联免疫吸附法 检测试剂盒及其应用。
背景技术：
肝硬化是一种常见的慢性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用引起的肝脏 弥漫性损害。肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学改变。肝纤维化是肝脏对慢性损伤的 一种修复反应，是慢性肝病共有的病理改变，不仅是向肝硬化发展的必由之路，而且贯穿于 肝硬化的全过程。
目前“肝炎一肝纤维化一肝硬化一肝癌”，这一链条已被认为是各种慢性肝病导致 严重后果的共同途径。临床研究发现，肝纤维化的诊断方法主要包括影像学、病理学和血清 学诊断3种。影像学诊断主要是B超和CT，在临床应用广泛，但只能在肝纤维化晚期，发生 肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图像，不能做出早期诊断。肝纤维化的诊断金标准虽 是肝组织活检，但其本身也存在许多问题，如肝穿刺的盲目性、取材不够、肝脏病变的不均 一性而导致取样误差；虽属于微创检查，但多数患者不愿接受，且不能反复取材进行动态观 察。
肝纤维化是发展至肝硬化的必经阶段；临床数据表明，有80%的肝癌患者是由肝 硬化进一步恶化所至。因此，在肝纤维化阶段进行早期发现治疗，尚有好转的可能。由此可 以看出肝纤维化的临床诊断和治疗对于慢性肝病极为重要。
因此迫切需要一种特异性强、结果可靠、操作性强、简单可行的对肝纤维化进行检 测，对肝病进程的发展进行有效监测的方法。发明内容
本发明的目的在于提供保藏号为CGMCC No. 5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株在制 备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明中，特异性定量检测多肽标志物P印5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105， 是以多妝标志物抗原(序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名为多肽5，简称P印5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶 联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的特异性定量检 测肝病进程相关的多肽标志物P印5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，已于2011年9月 27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。
本发明中，所述的检测试剂盒优选为酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒。
其中，所述的ELISA试剂盒含有辣根过氧化物酶标记的本发明所述的单克隆抗 体。
其中，所述的ELISA试剂盒还含有包被液、封闭液、显色液、终止液和固相反应板。
其中，所述的ELISA试剂盒进一步含有对多肽标志物进彳丁足量检测用的校准品、 质控品。进一步，所述包被液优选为碳酸盐缓冲液、封闭液优选为5%脱脂奶粉、显色液优 选为TMB显色液、终止液优选为2M硫酸、固相反应板优选96孔聚丙乙烯微孔板。所述校准品、质控品为系列稀释度的Pep5稀释液。本发明的ELISA试剂盒在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用，具体 包括以下步骤1)包被取5-30 u L临床血清，加入70 u L_95 u L包被液，置于96孔板中，4°C放 置过夜或37°C放置2小时；同时加入100 u L包被液作为阴性对照；2)清洗弃包被液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 y L清洗5-7次，拍干；3)封闭加入200-300 u L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；4)清洗弃封闭液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 y L清洗5-7次，拍干；5)酶结合物加入80-120 uL HRP标记抗体，37°C静置1小时；6)清洗弃抗体溶液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 u L清洗5-7次，拍 干;7)显色加入80-120iiL显色液，37°C避光孵育15min显色；8)终止加入30-70 u L 2M硫酸，终止反应；9)读数用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值；10)判别以检测0D值与阴性0D值之比大于2. 1为阳性。本发明中，术语“肝病进程”包括肝炎一肝纤维化一肝硬化一肝癌，肝纤维化是向 肝硬化发展的必由之路。针对上述技术方案，本发明具有以下优点和效果本发明中所阐述的多肽标志物Pep5定量检测试剂盒不仅可以特异性检测肝癌及 正常血清样本，也能通过血清样本中多肽标志物P印5的定量检测，对肝病进程的发展进行 有效的监测。本发明所提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多肽标志物抗原的 检测方法的操作步骤简便快捷，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。


图1为本发明所阐述的的多肽标志物P印5定量检测试剂盒在肝病发展进程‘肝 炎_肝纤维化_肝硬化_肝癌’血清与正常血清的P印5含量差异的箱式图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法1)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；其全长 序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后检测尾血滴度，达到1 :1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠 骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；
3)通过ELISA方法进行筛选，用有限稀释法对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞进行克隆纯化；
4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，意外地发现其中一株敏感性较高(lng/well)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(1:200000)、滴度 (O. 0005μ g/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株，并于2011年9月27 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。
实施例2 P印5定量检测ELISA检测试剂盒的组装
(1)1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的实施例1的抗Pep5的特异性单克隆抗体；
(2)包被液0.1M ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液；
(3)封闭液5g/100ml脱脂奶粉；
(4 )显色液过氧化氢/TMB显色液；
(5)终止液2M硫酸;
(6)校准品/质控品系列稀释度0_24ng/ml的P印5稀释液；
(7) 96孔酶联板。
实施例3多肽标志物抗原的ELISA检测方法
样本临床确诊的肝炎血清50份、肝纤维化血清30份、肝硬化血清、肝癌血清103 份、正常血清160份。
检测过程
(I)包被5 μ L临床血清,加入95 μ L包被液,置于96孔板中，4°C放置过夜；同时相应空中加入校准品及质控品；
(2)清洗弃包被液，用O. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；
(3)封闭加入300 μ L5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；
(4)清洗弃封闭液，用O. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；
(5)酶结合物加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的多肽抗体，37°C静置I小时；
(6)清洗弃抗体溶液，用O. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干。
(7)显色分别加入50 μ LTMB底物液和显色液，37°C避光孵育IOmin显色；
(8)终止加入50 μ L 2Μ硫酸，终止反应；
(9)读数用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值(0D值)；以检测OD值与阴性 OD值之比大于2.1为阳性。
结果经统计，如图1的显示，通过对临床样本中P印5含量的数据分析发现，P印5 含量在肝炎及正常临床样本中无显著性差异，说明，在肝炎阶段血清中Ppe5含量仍处于较低水平；肝硬化阶段P印5水平开始升高，P印5含量在4-8ng/ml范围内时，可以诊断为纤维化，其中诊断灵敏度为76. 67% ;在8-12ng/ml范围内，可诊断为肝硬化；>12ng/ml，则可能有发生肝癌的风险。
由上述可知，本发明中的多肽标志物P印5在肝病发展进程‘肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌’中含量与正常血清的多肽标志物P印5含量具有明显的差异，且呈现良好的 ‘Pep5含量-肝病发展进程’的相关性。应用本发明提供的定量检测试剂盒，特异性很强、 重复性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.保藏号为CGMCCNo. 5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杂交瘤细胞株AP0105在制备肝纤维化相关的检测试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为酶联免疫吸附法检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒含有辣根过氧化物酶标的保藏号为CGMCC No. 5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还含有包被液、封闭液、显色液、终止液、质控品、校准品和固相反应板中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述包被液为碳酸盐包被液、封闭液为5% 脱脂奶粉、显色液为TMB显色液、终止液为2M硫酸、校准品为系列浓度的P印5稀释液、固相反应板为96孔聚丙乙烯微孔板。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述应用中的检测包括如下步骤1)包被取5-30μ L临床血清，加入70 μ L-95 μ L包被液，置于96孔板中，4°C放置过夜或37°C放置2小时；同时加入100 μ L包被液作为阴性对照；2)清洗弃包被液，用O.01Μ、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；3)封闭加入200-300μ L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；4)清洗弃封闭液，用O.01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；5)酶结合物加入80-120μ L HRP标记抗体，37°C静置I小时；6)清洗弃抗体溶液，用O.01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；7)显色加入80-120μ L显色液，37°C避光孵育15min显色；8)终止加入30-70μ L 2M硫酸，终止反应；9)读数用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值；10)判别以检测OD值与阴性OD值之比大于2.1为阳性。
全文摘要
本发明公开了保藏号为CGMCC No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。本发明所提供的由所述杂交瘤细胞中分泌的单克隆抗体制备的试剂盒可通过血清样本中多肽标志物Pep5的定量检测，对肝病进程的发展进行有效的监测，而且操作步骤简便快捷，利于高通量地临床检测，检测成本低。
文档编号G01N21/31GK102998451SQ201210479510
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者魏开华, 肖汉族, 孙云波, 傅海媛, 侯利平, 黄亚娟, 宋纯艳, 杨保安, 甄蓓, 徐淑芳, 张拓, 王东茂, 周晓明, 原剑 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司