专利名称：动物源性功能性食品中五种磺胺类兽药残留的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种动物源性功能性食品中兽药残留检测方法，特别涉及磺胺类兽药残留的检测方法。
背景技术：
改革开放30年来，功能性食品行业作为21世纪的朝阳产业愈来愈呈现出勃勃生机，功能性食品也逐渐走进了广大人民群众的生活，对促进机体健康、突破亚健康、祛除疾病等方面发挥了重要作用。动物源性功能性食品如钙粉、鱼油和蜂蜜等的生产制备多以畜牧、水产动物和半成品为原料，而磺胺类药物因其造价低廉、抗病效果好，被广泛地应用于预防和治疗家畜及水产品的细菌感染性疾病，这就有可能产生多种磺胺类残留。磺胺类兽药残留对人体的直接毒害作用主要包括三种①对人类胃肠道微生物的影响，国内外近年许多研究认为，有抗菌性药物残留的动物产品，可以对人类肠道的正常菌群产生不良的影响，部分敏感菌受抑制或被杀死，使得正常的微生物环境遭到破坏，有些条件性致病菌(如大肠杆菌等)可能大量繁殖，或易使体外病原菌侵入，损害人类健康。②造成人类病原菌耐药性的增加，使用含抗生素等抗菌药物的饲料后，抗菌药物在动物产品中残留可能使人类的病原菌长期接触这些低浓度的药物，从而产生耐药性。1997年10月首次"抗生素应用于食品动物后对人类医疗影响"国际研讨会，专家一致认为食品动物长期低剂量使用抗生素会增加耐药菌，并且细菌的耐药基因可以在人群中细菌、动物群中细菌和生态系统产生的细菌之间相互传递， 由此可导致致病菌产生耐药性而引起人类和动物感染性疾病治疗的失败。③直接导致人类疾病，有许多抗生素残留可以直接导致人体产生疾病。磺胺类药物在奶中残留，不仅能抑制乳产品的发酵，而且还可能使人产生过敏和变态反应。因此，国际食品法典委员会(CAC)、 欧盟和美国规定食品和饲料中磺胺类总量不得超过100 μ g/kg，我国无公害水产品中渔药残留限量标准(附5070-200幻也规定了水产品中同样限值。同样GB/T 20759-2006中规定了畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的LC-MS-MS法，各种磺胺类药物方法检出限如下磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶为5. 0 μ g/kg ；磺胺二甲基嘧啶为20. 0 μ g/kg ；磺胺间二甲基嘧啶为 10.0 μ g/kg ；而磺胺喹噁啉目前暂无限量标准。GB/T221316-2007中规定在动物肝、肾、肌肉组织和牛奶中23种磺胺药物残留的定量限均为50 μ g/kg ；在水产品中23种磺胺药物残留的定量限为10 μ g/kg。目前，动物源性食品中磺胺类兽药残留量的检测方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法、免疫分析法、高效液相色谱与紫外、荧光技术、电化学检测技术联用等。这些方法都有最低检出浓度高，不能有效排除基质干扰，容易出现假阳性且有机溶剂使用量大等缺点。 功能性食品中成分比较复杂，大多含有多种不同成分，这就给检测其中的磺胺类兽药残留带来困难。目前，功能性食品中磺胺类兽药残留检测尚未有文献报道
发明内容
为了克服已有技术的不足，本发明的目的是提供一种能够有效检测功能性食品中磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDM)、磺胺喹噁啉(SQX)和磺胺间二甲氧嘧啶(SDT)五种磺胺类兽药残留的方法，以解决现有技术中最低检出浓度高，不能有效排除基质干扰，容易出现假阳性且有机溶剂使用量大等缺点。本发明是通过以下技术方案实现的一种功能性食品中五种磺胺类兽药残留的 HPLC-MS-MS检测方法，包括如下步骤(1)样品提取称取适量样品，乙腈作为溶剂涡旋振荡提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；称样量为0. 5克-10. 0克，每次溶剂提取乙腈用量为5mL-100mL。(2)样品净化用正己烷萃取步骤(1)中所得乙腈液，底层乙腈液经浓缩后用10% 乙腈水溶解，过滤；(3)采取HPLC-MS-MS系统测定样品中五种磺胺类兽药残留量。所述五种磺胺类兽药包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺间二甲氧嘧啶。所述步骤C3)采取HPLC-MS-MS系统测定样品中五种磺胺类兽药残留量，检测条件是色谱条件流动相是乙腈0-90体积份0. 05% -0. 2%甲酸水溶液5-95体积份流速为0. 3mL/min ；进样量5μ L，柱温:35°C ；质谱条件电离方式为电喷雾电离，正离子(ESI+)；毛细管电压3. 50kV ；离子源温度110°C;锥孔气氮气，50L/Hr ；脱溶剂气氮气，500L/Hr，温度400°C ；碰撞气氩气，0.14mL/min。所述流动相甲酸水溶液为乙酸铵溶液或甲酸铵溶液，浓度为0. 05mM-10mM。所述样品为动物源性原料制成的功能性食品，例如以骨粉为原料制成的补钙类功能性食品，以鸡蛋蛋黄粉为原料制成的功能性食品，或者以蜂蜜为原料制成的功能性食品等。本发明的有益效果是本发明的测定方法，对以动物源性原料制成的功能性食品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺间二甲氧嘧啶五种磺胺类兽药残留的分离性良好，灵敏度高，选择性和特异性好，能够有效排除基质干扰和假阳性， 最低检出浓度低，达到20ng/ml，且在样品处理过程中采用递减量乙腈进行提取，即保证了目标物的回收率，还减少了有机溶剂的使用量，减少了废液排放，节约了检测成本。与其他方法相比，HPLC-MS-MS(液相色谱-质谱/质谱)系统技术灵敏度高，选择性和特异性好，不仅可对样品中低浓度的多药物残留进行定性确认，克服样品基质干扰， 而且能够有效排除假阳性，进行动物源性为原料制成的功能性食品中残留物准确的定量分析。本发明建立了适用于功能性食品中磺胺类兽药残留测定的HPLC-MS-MS技术，是动物源性功能性食品生产过程中有效履行HACCP管理体系的重要内容之一，是保障功能性食品安全的有力手段，也是广大消费者身体健康的重要保证，为以后功能性食品中兽药残留监测提供了有效的技术支撑。


图1为本发明五种磺胺类兽药的TIC谱图。
具体实施例方式下面将通过实例对本发明作进一步的描述，这些描述将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。1.样品提取取混合均勻的样品，称取2g(精确至0. Olg)样品装于具塞旋盖四氟乙烯试管中，加入30mL乙腈，涡旋振荡lmin，振荡提取30min，于10000r/min离心5min， 将乙腈层移入150mL分液漏斗中。向沉淀物再加入20mL乙腈摇勻，振荡提取30min，于 lOOOOr/min离心5min，合并乙腈提取液。离心后沉淀物再加入IOmL乙腈，照上述操作振荡离心，合并乙腈提取液，待净化。2.样品净化提取液中加入25mL正己烷，振摇5min，将底层乙腈溶液移入150mL 鸡心瓶中，加入15mL异丙醇，用旋转蒸发器于45°C水浴中减压蒸发至近干。鸡心瓶中加入5mL乙腈，超声30s溶解残渣，将溶解液移入15mL离心管中；再向鸡心瓶中加入3mL乙腈，超声30s，合并溶解液。溶解液在氮吹仪上氮气吹干。10%乙腈溶液溶解，漩涡lmin，过 0. 22 μ m微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱测定。3.色谱质谱条件流速为0. 3mL/min ；进样量5 μ L，柱温35°C，流动相及梯度洗脱条件见表1。MS/MS测定条件为电离方式为电喷雾电离，正离子(ESI+)；毛细管电压 3. 50kV ；离子源温度=IlO0C ；锥孔气氮气，50L/Hr ；脱溶剂气氮气，500L/Hr，温度400°C ； 碰撞气氩气，0. 14mL/min。以多反应监测(MRM)模式进行实验。各种化合物离子对和电压见表2。表1流动相及梯度洗脱条件
时间/mm流动相A (乙腈)％流动相B (0.1%甲酸水溶液)％~
10.0025.00
30 30.5 40
15 50 40
95 85 50 60 95 95 表2各种化合物的离子对和电压
权利要求
1.一种动物源性功能性食品中五种磺胺类兽药残留的检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)样品提取称取样品，乙腈作为溶剂涡旋振荡提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；(2)样品净化用正己烷萃取步骤(1)中所得乙腈液，底层乙腈液经浓缩后用10%乙腈水溶解，过滤；(3)采取HPLC-MS-MS系统测定样品中五种磺胺类兽药残留量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述五种磺胺类兽药包括磺胺嘧啶、 磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺间二甲氧嘧啶。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤C3)采取HPLC-MS-MS系统测定样品中五种磺胺类兽药残留量，检测条件是色谱条件 流动相是乙腈0-90体积份0. 05% -0. 2%甲酸水溶液5-95体积份流速为0. 3mL/min ；进样量5 μ L，柱温:35°C ； 质谱条件电离方式为电喷雾电离，正离子(ESI+)；毛细管电压:3. 50kV ；离子源温度110°C ；锥孔气氮气，50L/Hr ；脱溶剂气氮气，500L/Hr，温度400°C ；碰撞气氩气，0. 14mL/min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的甲酸水溶液为乙酸铵溶液或甲酸铵溶液，浓度为0. 05mM-10mM。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)称样量为0.5克-10. 0 克，每次溶剂提取乙腈用量为5mL-100mL。
全文摘要
本发明公开了一种动物源性功能性食品中五种磺胺类兽药残留的检测方法，包括如下步骤(1)样品提取称取适量样品，乙腈作为溶剂涡旋振荡提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；(2)样品净化用正己烷萃取步骤(1)中所得乙腈液，底层乙腈液经浓缩后用10％乙腈水溶解，过滤；(3)采取HPLC-MS-MS系统测定样品中五种磺胺类兽药残留量。本发明的测定方法，对功能性食品中五种磺胺类兽药残留的分离性良好，灵敏度高，选择性和特异性好，能够有效排除基质干扰和假阳性，最低检出浓度低，且在样品处理过程中采用递减量乙腈进行提取，即保证了目标物的回收率，还减少了有机溶剂的使用量，减少了废液排放，节约了检测成本。
文档编号G01N30/72GK102253148SQ20101060493
公开日2011年11月23日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者李星芝, 赵晓娟, 韩立军 申请人:天津天狮生命源有限公司, 天津天狮生物发展有限公司, 天狮集团有限公司