专利名称：一种富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法
技术领域：
本发明涉及分析化学中样品前处理领域，具体是涉及一种以磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法。
背景技术：
克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇为苯乙醇胺类化合物，属于β_受体激动剂类药物，可促进动物如牛、猪、羊、家禽等生长，并增强体内的脂肪分解代谢，显著提高瘦肉率。所以自20世纪80年代以来，β -受体激动剂被大量添加于饲料中，以促进家畜生长和提高瘦肉率。β -受体激动剂易在动物组织，特别是内脏中蓄积残留，其通过食物链进入人体后可引发肌肉震颤、心律失常、头痛等症状，严重者可能危及生命。鉴于以上原因，我国已于1997将克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等列为禁止在饲料和养殖家畜饮用水中使用的药品。但是目前仍有养殖者将其违法使用在畜牧业中，引发药物残留，从而对消费者健康造成严重损害。目前检测活体动物排泄尿样中β_受体激动剂残留是判断动物饲养过程中是否添加受体激动剂的有效手段之一。当前，在所有β_受体激动剂中，克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等是最为常用的三种受体激动剂。针对克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等造成的养殖家畜源性食品安全问题，建立尿样中中痕量克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺的快速、简便的分离富集方法，对提高定量检测的灵敏度以及准确性，具有重要意义。目前，在痕量分析物的食品安全检测分析中，有将近一半的误差来源于样品的前处理，而真正来源于仪器检测的误差还不足三分之一，且近70%的工作量都耗费在样本的前处理阶段。因此，发展快速、`高效的样品前处理方法，对痕量分析物进行高效快速富集后再检测，是减少痕量分析物检测误差、缩短检测时间的有效手段。现有的养殖家畜尿样中中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的提取、净化方法主要参照中华人民共和国农业部行业标准(农业部1063号-3-2008文件)执行，文件中规定了养殖家畜尿样中11种β_受体激动剂残留量液相色谱-串联质谱法测定的具体流程。其中样品前处理步骤如下:取澄清养殖家畜尿样5 mL，添加内标工作液100 μ (含克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D9各100 Pg/mL)，充分混匀。5 mol/L氢氧化钠调节溶液pH至9-10，加叔丁醇-叔丁基甲醚(6:4)提取液10 mL，充分震荡，7000 r/min离心10min，移取上清，重复提取一次，合并上清，旋转蒸干(40°C)。0.2%甲酸水溶液溶解后过混合型强阳离子柱。与本发明方法相比，现有农业部行业标准样品前处理流程相对较长，包括两次提取净化以及旋转蒸干等步骤。而本方法仅需简单地调整一次尿样PH值即可。

发明内容
本发明目的提供了一种更为简便和快速有效的养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇高效富集的方法。本发明中所米用的技术属于磁分散固相萃取技术范畴，磁固相萃取(MagneticSolid Phase Extraction, MSPE)是一种以表面功能化的磁球(Magnetic Beads, MBs)为吸附剂的新型固相萃取方法。原理见图1，该磁球以超顺磁性纳米四氧化三铁为核，经非磁性聚合物材料包裹而成。通过在磁球表面修饰不同的化学功能团对目标物进行吸附。该方法结合了磁分离的简便性与分散固相萃取吸附的高效性，采用分散固相萃取模式，克服了传统固相萃取中过柱操作的缺点(如过柱耗时长、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及装柱时吸附剂填装不均匀密实产生的短路等问题)；同时由于磁球粒径介于纳米和亚微米之间，比表面积远大于固相萃取材料(固相萃取材料粒径范围一般为20-100 μ m之间)，吸附容量大，吸附剂用量少，可实现微量洗脱液洗脱，富集倍数高，且可省去常规前处理流程中的旋转蒸发等浓缩步骤；纳米材料在溶液中具有良好的单分散性，在溶液中可均匀分布，比表面积大，提高了萃取过程中吸附剂吸附待分离物的速率，缩短了吸附时间；同时可在短时间内处理大体积样品，有利于通过加大样品处理量来增加富集系数，降低检测限。具体来说本发明的技术方案包含下列步骤:
(1)样品处理:取尿样5 10mL，调节尿样pH至5 7;
(2)吸附:加入适量磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球，混匀，充分·吸附，磁场分离磁球，弃去上清；
(3)洗脱收集:加200-800μ 洗脱溶剂将磁球上的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇洗脱，分离磁球，收集洗脱液；其中洗脱溶剂为含5%氨水的甲醇或乙醇溶液(即100份洗脱溶剂中95份为甲醇或乙醇，5份为氨水)。样品可以使用牛、猪、羊、马等养殖养殖家畜的尿样。加入的磁球数量从节约材料角度以能充分吸附尿样中的目标物为准。分离磁球可以采用常规的磁力架分离或者通过离心分离磁球等方法。聚苯乙烯超顺磁磁球表面修饰有磺酸基功能团(见图2)，通过磺酸基等作用将目标物吸附，为了达到更好的富集效果，磺酸基修饰磁球粒径为7(T300 nm ;该范围的磁珠能更好的在溶液中分散，当然在此粒径范围之外的磁珠也能达到富集的作用。本发明还涉及到上述富集方法在养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的分析检测中应用，只需收集洗脱液，过滤后直接进行液相或者液相色谱-质谱联用定量分析。过滤可以直接采取常规液相或液质联用进样所需的0.45 ym或0.22ym滤膜过滤，液相色谱或液相色谱-质谱联用的条件可以直接采取隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析条件，此为常规实验技术，不再赘言。粒径范围在70-300 nm的磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球可以按照如下步骤制备:一步法合成磺酸基修饰聚苯乙烯磁性微球(粒径范围在70-300 nm):化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒,用体积比15:1的苯乙烯-十六烧混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒，超声5 10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL, 0.0lM含0.2 0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超声波频率为25KHz，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12 h ;磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，表面修饰有磺酸基的磁球，磁球粒径大小与溶液中SDS含量以及超声功率成反比；磁架回收磁球，制备好的磺酸化磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗涤各I 3 h，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中于4°C保存备用。采用上述制备方法，可以使得磁球具有稳定性好、重现性好的优点。磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球可以还按照如下步骤制备:
以羧基化聚苯乙烯磁性微球为原料:将表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球分散于pH4.0-5.0硼酸盐缓冲液中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺以活泼酯法活化磁球上的羧基；取上述表面羧基被活化后的磁球，加入5^20倍于磁球表面羧基密度的对氨基苯磺酸溶液，溶液PH调至8.(T9.0,室温下振荡反应2 4 h ;磁架回收磁球，制备好的磺酸化磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗涤各Γ3 h，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中，4 °C保存备用。本发明技术方案具有如下优点:1、本发明采用磁固相萃取方法(具体原理见图1)，能有效地富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇，且吸附效率高，样品提取回收率高；并且本方法尿样预处理非常简单，只需要将尿样调整PH即可，大大提升了分析速度。2、本方案中磁球的溶液单分散性好，在溶液中可均匀分布，比表面积大，提高了吸附剂吸附待分离物的速率，缩短了吸附时间；与本发明方法相比，现有农业部行业标准样品前处理流程相对较长，包括两次提取净化以及旋转蒸干等步骤。而本方法仅需简单地调整一次尿样pH值即可。3、磁球粒径 小，比表面积远大于固相萃取材料，吸附容量大，吸附剂用量少，可实现微量洗脱液洗脱，富集倍数高，且可省去常规前处理流程中的旋转蒸发等浓缩步骤，对分析物破坏少，减少了检测误差。


图1磁固相萃取原理图。图2本发明磁球结构图。
具体实施例方式为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1合成直径70 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
参照文献(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化,无水乙醇洗漆后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烧混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒,超声5 10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL, 0.0lM含0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，300 ff (25KHz)功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径为100 nm的表面修饰有磺酸基的磁球。实施例2合成直径100 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
参照文献(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化,无水乙醇洗漆后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烧混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒,超声5 10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL, 0.0lM含0.4%的SDS的NaHCO3溶液中，300 ff (25KHz)功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径为100 nm的表面修饰有磺酸基的磁球。实施例3合成直径200 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
参照文献(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化,无水乙醇洗漆后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烧混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒,超声5 10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.0lM含0.25%的SDS的NaHCO3溶液中，250 ff (25KHz)功率继续超声乳化30 min，形成 细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径为200 nm的表面修饰有磺酸基的磁球。实施例4合成直径300 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
参照文献(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化,无水乙醇洗漆后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烧混合液5 mL悬浮Fe3O4纳米颗粒,超声5 10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL, 0.0lM含0.2%的SDS的NaHCO3溶液中，200 ff (25KHz)功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径为300 nm的表面修饰有磺酸基的磁球。实施例5以粒径为100 nm的磺酸基化聚苯乙烯磁球为吸附剂共同富集、净化猪尿中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇
O添加克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的猪尿样品的制备:取经农业部1063号公告-3-2008文件方法验证不含克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的新鲜猪尿4份，每份各5mL，向每份尿样中添加等量的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇以及相应的氘代标准品，添加量分别为0.5、1、5和10 ng,其中氣代标准品添加量分别为2.5 ng。2)以粒径为100 nm的磺酸基化聚苯乙烯磁球为吸附剂共同富集、净化加标猪尿中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇，操作流程如下:用IN HCl调整尿样pH至5.0。将10mg磺酸基化修饰的磁球加入上述尿样中,振荡混勻后静置吸附5 min,磁力架分离磁球,弃去提取液；I mL甲醇洗涤磁球两次，400 μ L 5%氨化甲醇浸泡磁球I分钟后，磁力架分离磁球，收集洗脱液过0.22 Mffl滤膜后直接用于液相色谱-质谱联用法定量分析。本方法整个提取、富集净化过程耗时约20-25 min。3)参照农业部1063号_3_2008文件方法用液相色谱-质谱联用法测定所得富集液中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的含量，内标法定量。液相色谱条件为:
色谱柱:Agilent Eclipse plus C18 (100 mmX2.1 mm,1.8 Mm);进样量:IOKL ;柱温:30°C ;流动相:0.2%甲酸/甲醇溶液(50:50)，流速为0.2 mL /min。质谱条件:
离子源:电喷雾ESI，正离子模式；扫描方式:多反应监测MRM;雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；监测离子对:克伦特罗m/z277/203 (定量离子)、氘代克伦特罗-D9 m/z 286/204 (定量离子)，沙丁胺醇m/z 240/148(定量离子)、氘代沙丁胺醇-D3 m/z 243/151 (定量离子)，莱克多巴胺m/z 302/164 (定量离子)、氘代莱克多巴胺m/z 307/167 (定量离子)。4)回收率的计算:将由液相色谱-串联质谱法测定得到的富集净化液中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的含量，除以加标量得到加标样品中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的回收率。5)不同添加量时本专利提取富集方法的加标回收率见表I。由表可知，本实验方法提取回收率较高，可达到国标要求。表I加标回收实验结果`
权利要求
1.一种富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于包含以下步骤: (1)样品处理:取尿样5 10mL，调节尿样pH至5 7; (2)吸附:加入适量磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球，混匀，充分吸附，磁场分离磁球，弃去上清； (3)洗脱收集:加200-800μ 洗脱溶剂将磁球上的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇洗脱，分离磁球，收集洗脱液；其中洗脱溶剂为含5%氨水的甲醇或乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于步骤(2)中聚苯乙烯超顺磁磁球表面修饰有磺酸基功能团，磺酸基修饰磁球粒径为70 300 nm。
3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于每5mL尿样所需磁球剂量为7.5-20mg ο
4.根据权利要求1所述的富集方法在养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的分析检测中应用，其特征在于收集洗脱液，过滤后直接进行液相或者液相色谱-质谱联用定量分析。
5.根据权利要求3所述的富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特征在于所述粒径为7(T300 nm，磺酸基修饰的聚苯乙烯磁球按照如下步骤制备: 化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，再将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe3O4纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮F e3O4纳米颗粒,超声5 10 min形成磁流体,将磁流体转入400 mL, 0.0lM含0.2 0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超声波频率为25KHz，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30min，形成细乳液；加0.1g K2S2O8于70°C反应2(T40 min后加入0.5 g乙烯基磺酸钠，继续反应12 h ;磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe3O4纳米单颗粒，表面修饰有磺酸基的磁球，磁球粒径大小与溶液中SDS含量以及超声功率成反比；磁架回收磁球，制备好的磺酸化磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗涤各广3 h，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中于4 °C保存备用。
全文摘要
本发明公开了一种富集养殖家畜尿样中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法。本发明涉及分析化学领域特别是样品前处理的方法。本发明先通过样品预处理，再加入表面修饰有磺酸基的聚苯乙烯超顺磁纳米或亚微米磁球吸附，洗脱，收集洗脱液。洗脱溶液可直接用于液相色谱-质谱联用定量分析克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的含量。本发明方法具有操作流程简单、提取回收率高、洗脱溶剂用量少、无需旋蒸的特点。
文档编号G01N30/08GK103076416SQ20121031629
公开日2013年5月1日 申请日期2012年8月31日 优先权日2011年11月15日
发明者熊勇华, 许恒毅, 吴科盛, 郭亮, 梁语嫣, 徐峰, 赖卫华 申请人:南昌大学