专利名称：独一味制剂中独一味含量的测定方法及测定标准的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药品检测方法，特别是涉及一种测定独一味制剂中独一味含量的方法及其测定的标准。
背景技术：
藏药独一味作为一种具有活血化瘀，镇痛止血功能的药材，常用于制备止血镇痛的药物。准确检测独一味制剂中独一味的含量是在生产中有效控制产品质量的方法。现有的检测独一味制剂中独一味含量的方法是采用分光光度法检测药物中总黄酮(以芦丁计)的含量和正丁醇提取物的含量。其标准为正丁醇提取物含量不少于8.0％，总黄酮(以芦丁计)不少于20.0mg。因药物中能够溶解于正丁醇的物质较多，而正丁醇提取物无法与药物中独一味的含量形成一一对应的关系，因此，以正丁醇提取物的含量来检测独一味制剂中独一味的含量容易受到正丁醇可溶杂质的干扰。不利于在生产中控制和监测药品的质量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的检测独一味制剂中独一味含量的方法。
本发明的另一个目的就是提供一种检测独一味制剂中独一味含量新的标准。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的检测独一味制剂中独一味含量的方法中含有如下含量测定中一种或几种1、独一味制剂中总黄酮含量测定对照品溶液的制备精密称取在110～130℃减压干燥至恒重的芦丁对照品0.2g，置100ml量瓶中，加60％～90％乙醇55～85ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加60％～80％乙醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，每1ml中含无水芦丁0.2mg。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加3％～10％亚硝酸钠溶液0.5～1.5ml，混匀，放置3～10分钟，加6％～20％硝酸铝溶液0.5～1.5ml，摇匀，放置3～10分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置10～20分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法精密称定独一味制剂(6g)，置于100ml量瓶中，加60％～90％乙醇55～85ml，置水浴上微热并时时振摇20～40分钟，放冷，再60％～90％乙醇至刻度，摇匀，放置3～5小时，精密量取上清液1ml，置于25ml量瓶中，加水至6ml，加3％～10％亚硝酸钠溶液0.5～1.5ml，混匀，放置3～10分钟，加6％～20％硝酸铝溶液0.5～1.5ml，摇匀，放置3～10分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置10～20分钟，照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。其检测标准为每0.3g独一味制剂(相当于生药1g)中含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计，不得少于26.0mg。
2、木犀草素的含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件与波长选择用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按木犀草素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密称定供试品150mg，置于25ml量瓶中，加2.5mol/L盐酸甲醇溶液10～25ml，超声处理20～40分钟，放冷，再用2.5mol/L盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，于80～100℃水浴中加热水解20～40分钟，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定结果，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入高效液相色谱仪，测定，即得结果。检测标准为每0.3g独一味制剂(相当于生药1g)中木犀草素的含量为0.8000mg～1.8105mg之间，即木犀草素的含量在0.2666％～0.6035％之间。
本发明所述的独一味制剂包括胶囊、片剂、颗粒剂以及口服液体制剂、针剂、膜剂、气雾剂等临床可接受的剂型。
独一味中的主要化学成分为黄酮类化合物木樨草素、木樨草素-7-0-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-新橙皮糖苷、槲皮素和槲皮素-3-0-阿拉伯糖苷。其水解后的主要黄酮苷元为木樨草素，是独一味中的主要活性成分，且含量与独一味含量在一定条件下成线性关系。故在用比色法测定总黄酮含量的基础上，将药物水解测定黄酮苷元木樨草素的含量，以此来检测独一味制剂中独一味的含量，从而使独一味制剂中独一味含量质量标准得以进一步完善、提高，切实做到独一味制剂质量的稳定、可控。
下列实验例用于进一步说明本发明。
实验例1木樨草素含量测定方法的研究(1)仪器与试药高效液相色谱仪，包括Waters 1525泵，2487双通道紫外检测器，Waters柱温箱，Breeze液相色谱工作站，Brasson超声清洗仪。木犀草素对照品(批号111520-200201，供含量测定用，中国药品生物制品检定所见图3-5)，甲醇为美国Tedia色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。待测药物样品为独一味胶囊(批号0301114353甘肃独一味生物制药有限责任公司)。
(2)色谱条件 参照银杏黄酮含量测定的色谱条件色谱柱Phenomenex Luna C18(2)，4.6mm×150mm，5um；柱温35℃；流动相甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)；检测波长为350nm；流速0.8ml/min。
(3)检测波长的选择取木犀草素对照品溶液，在200～400nm范围内扫描，结果在350nm处有最大吸收，故选择350nm作为检测波长。
(4)水解介质的选择参照银杏黄酮的测定方法[2]和甘草黄酮的水解条件，考察水解介质对测定结果的影响，照含量测定项下操作。取胶囊内容物约150mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，超声处理30分钟，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收至干，加10ml水解介质。水解介质分别为甲醇-25％盐酸(4∶1)与2.5mol/L盐酸甲醇，测定样品(批号0301114353)中木犀草素的含量，结果见表1。
表1水解介质对测定结果的影响水解介质 木犀草素含量(％) 方法来源甲醇-25％盐酸(4∶1) 0.281 文献[2]2.5mol/L盐酸甲醇0.390 文献[3]因此，选用2.5mol/L盐酸甲醇作为水解介质。
(5)提取溶剂的选择分别以甲醇、2.5mol/L盐酸甲醇作为提取溶剂，照含量测定项下操作，对样品(批号0301114353)中木犀草素的含量进行测定，结果见表2。
表2 提取溶剂对测定结果的影响提取溶剂木犀草素含量(％)甲醇 0.4012.5mol/L盐酸甲醇 0.499因此，选用2.5mol/L盐酸甲醇作为提取溶剂。
(6)溶剂用量的选择分别加2.5mol/L盐酸甲醇20ml，40ml超声处理30分钟，定容至25ml、50ml。然后分别精密量取10ml、20ml回流水解，最后定容至25ml。对样品(批号0301114353)中木犀草素的含量进行测定，结果见表3。
表3 溶剂用量对测定结果的影响溶剂用量(ml) 木犀草素含量(％)20 0.49940 0.498
因此，选用加2.5mol/L盐酸甲醇20ml超声处理。
(7)水解时间的选择照含量测定项下操作，回流水解时间分别为0.5、1小时，测定样品(批号0301114353)中木犀草素的含量，结果见表4。
表4 水解时间对测定结果的影响水解时间(小时)0.5 1木犀草素含量(％) 0.499 0.497因此，回流水解时间选用0.5小时。
(8)空白试验按处方中药味的比例，自配不含独一味的空白制剂，按上述方法制成空白溶液，依法测定，结果空白溶液在与木犀草对照品相同保留时间处未见显色谱峰，故认为无干扰。
(9)线性关系考察精密吸取上述对照品溶液(0.01584mg/ml)2、4、6、8、10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的进样量(ug)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表5。
表5线性关系实验数据(n＝5)ul ug 峰面积2 0.03168 1451874 0.06336 2967346 0.09504 4512558 0.12672 59357110 0.15840 754208Y＝4781815.025X-6272.7r＝0.9999结果表明在0.03168～0.15840ug范围内呈良好的线性关系。
(10)稳定性试验精密吸取供试品溶液5ul，间隔一定时间进样，测定木犀草素的峰面积，RSD为0.78％，结果表明24小时内测定结果稳定，结果见表6。
表6 稳定性试验数据(n＝5)进样时间(小时)0 1 2 4 24RSD(％)木犀草素峰面积273583276828279385 277938 276294 0.78(11)精密度试验精密吸取供试品溶液5ul，注入液相色谱仪，测定木犀草素的峰面积，重复进样5次，结果RSD为0.70％，见表7表7 精密度试验数据(n＝5)进样次数 1 2 3 4 5 RSD％木犀草素峰面积273583272930276302 276828 2770020.70(12)重现性试验照含量测定项下操作，对同一批号(批号0301114353)样品5份进行测定，求得相对标准偏差RSD为0.87％，结果见表8。
表8重现性试验数据测定次数 木犀草素含量(％)RSD％1 0.4912 0.4953 0.493 0.874 0.5025 0.498(13)回收率试验用加样回收，精密称取已知木犀草素含量的同一批号(批号0301114353，0.496％)的样品约75mg，分别精密加入木犀草素对照品溶液(0.380mg/ml)一定量，照含量测定项下操作，按下式计算回收率，结果见表8及

图12。

表9加样回收率实验数据(n＝6)样品称样量 样品中木犀草素的含量添加对照品相当于木犀草素量测出木犀草素总量 回收率(mg) (mg) (ml) (mg) (mg) (％)75.6 0.3750 0.8 0.304 0.6720 97.7071.2 0.3532 0.8 0.304 0.6453 96.0974.3 0.3685 1.0 0.380 0.7350 96.4572.8 0.3611 1.0 0.380 0.7364 98.7670.7 0.3507 1.2 0.456 0.7933 97.0670.1 0.3477 1.2 0.456 0.7861 96.14平均回收率为97.03％RSD为1.08％。
实验例2独一味胶囊中木犀草素的含量测定照上述含量测定的方法操作，测定了11批独一味胶囊中木犀草素的含量，结果见表10(批号0301114353)。
表10 独一味胶囊木犀草素的含量测定批号 含量(mg/粒)平均含量(mg/粒)03011143531.4941.4851.489503030241511.0561.0321.044003030242511.0651.0411.053003030243511.0471.0711.059003012242541.4911.5301.510503012242511.5091.5391.52402052941211.8271.7941.810503011142521.4671.4791.473003011042511.4911.5331.512003011043521.5361.5481.542002020643211.5541.5811.5675测得每0.3g独一味制剂(相当于生药1g)木犀草素含量在1.0440～1.8105mg之间，考虑到工业放大中的损耗误差，因此在最低含量的基础上，下浮20％，因此得到的检测标准为每0.3g独一味制剂(相当于生药1g)木犀草素含量在0.8000mg～1.8105mg之间(即木犀草素含量在0.2666％～0.6035％之间)。
实验例3正丁醇提取物检测独一味制剂含量的缺陷检测手段中现有独一味制剂检测方法中正丁醇提取物专属性不强，独一味胶囊的化学组分中主要为黄酮类物质，通过对100批独一味胶囊实验分析，发现其正丁醇提取物中，除黄酮类成分，还有一部分不确定成分，致使无法确保检测结果的准确，稳定。现对其中10批的分析情况统计如下a.正丁醇提取物测定方法按《中国药典》2000年版独一味胶囊质量标准[正丁醇提取物]项下测定。b.正丁醇提取物中总黄酮含量测定方法按《中国药典》2000年版独一味胶囊质量标准[含量测定]项下测定。c.独一味胶囊总黄酮含量测定方法按《中国药典》2000年版独一味胶囊质量标准[含量测定]项下测定。d.数据统计表11 样品名称独一味胶囊

a.结论独一味胶囊正丁醇提取物中不确定成分的溶解量不稳定，在总黄酮含量相差不大的情况下，正丁醇提取物中不确定成分的含量波动较大，因此以正丁醇提取物的含量来检测独一味不能确保检测结果的准确性。
试验例4独一味制剂检测方法比较以正丁醇提取物检测独一味的不足之处是提取物中溶解成分不明确，专属性差；而独一味中主要化学成分为黄酮类化合物，通过对30批总黄酮含量、木犀草素含量均不合格的独一味胶囊测定其正丁醇提取物、正丁醇提取物中总黄酮含量，结果表明，其正丁醇提取物均符合国家药典标准规定，而正丁醇提取物中总黄酮含量只占提取物总量的49.3％。(附独一味胶囊正丁醇提取物数据分析对比表)表12

实验表明，用HPLC法测定独一味胶囊制剂中木犀草素的含量，样品中木犀草素可以得到较好的分离(其加样回收率97.03％，RSD为1.08％)，用该法取代正丁醇提取物测定，可以在生产中有效的控制和监测药品的质量。
实施例独一味胶囊质量检测方法1、独一味胶囊中总黄酮含量测定(甘肃独一味生物制药有限责任公司生产批号0308201222)对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品0.2g，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，每1ml中含无水芦丁0.2mg。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取独一味胶囊的内容物，精密称定，研细，取0.6g，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热并时时振摇30分钟，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀，放置4小时，精密量取上清液1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，得到结果为每0.3g(相当于生药1.0g)独一味胶囊中含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计33.6mg。
2、木犀草素的含量测定(甘肃独一味生物制药有限责任公司生产批0301114256)用高效液相色谱法测定
色谱条件与波长选择用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按木犀草素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；供试品溶液的制备取供试品内容物150mg，精密称定，置25ml量瓶中，加2.5mol/L盐酸甲醇溶液20ml，超声处理30分钟，放冷，用2.5mol/L盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，于90℃水浴中加热水解30分钟，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定结果分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算得到每0.3g独一味胶囊(相当于生药1.0g)中木犀草素的含量为1.488mg，即木犀草素含量为0.496％。
权利要求
1.一种独一味制剂中独一味含量的检测方法，其特征在于该方法中含有如下含量测定中一种或几种a、独一味制剂中总黄酮含量测定对照品溶液的制备精密称取在110～130℃减压干燥至恒重的芦丁对照品0.2g，置于100ml量瓶中，加60％～90％乙醇55～85ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加60％～80％乙醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，每1ml中含无水芦丁0.2mg；标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加3％～10％亚硝酸钠溶液0.5～1.5ml，混匀，放置3～10分钟，加6％～20％硝酸铝溶液0.5～1.5ml，摇匀，放置3～10分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置10～20分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法取独一味制剂，精密称定，置100ml量瓶中，加60％～90％乙醇55～85ml，置水浴上微热并时时振摇20～40分钟，放冷，加60％～90％乙醇至刻度，摇匀，放置3～5小时，精密量取上清液1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加3％～10％亚硝酸钠溶液0.5～1.5ml，混匀，放置3～10分钟，加6％～20％硝酸铝溶液0.5～1.5ml，摇匀，放置3～10分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置10～20分钟，照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。检测标准为每0.3g独一味制剂中含总黄酮以芦丁计，不得少于26.0mg；b、木犀草素的含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件与波长选择 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液50∶50为流动相；检测波长为350nm。理论板数按木犀草素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密称定独一味制剂150mg，置25ml量瓶中，加2.5mol/L盐酸甲醇溶液10～25ml，超声处理20～40分钟，放冷，用2.5mol/L盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，于80～100℃水浴中加热水解20～40分钟，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定结果分别精密吸取对照品溶液与独一味制剂溶液各5ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。检测标准为每0.3g独一味制剂中木犀草素的含量为0.8000mg～1.8105mg之间，即木犀草素的含量在0.2666％～0.6035％之间。
2.如权利要求1所述的独一味含量的检测方法，其特征在于该方法中含有如下含量测定中一种或几种a、独一味胶囊中总黄酮含量测定对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品0.2g，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，每1ml中含无水芦丁0.2mg；标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法取独一味胶囊的内容物，精密称定，研细，取0.6g，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热并时时振摇30分钟，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀，放置4小时，精密量取上清液1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，得到结果为每0.3g，独一味胶囊中含总黄酮以芦丁计33.6mg；b、木犀草素的含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件与波长选择用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按木犀草素峰计算，应不低于1500；对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；供试品溶液的制备取独一味胶囊内容物150mg，精密称定，置25ml量瓶中，加2.5mol/L盐酸甲醇溶液20ml，超声处理30分钟，放冷，用2.5mol/L盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，于90℃水浴中加热水解30分钟，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定结果分别精密吸取对照品溶液与独一味胶囊内容物溶液各5ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算得到每0.3g独一味胶囊中木犀草素的含量为1.488mg，即木犀草素含量为0.496％。
3.权利要求书1中所述独一味制剂，其特征在于剂型包括胶囊、片剂、颗粒剂以及口服液体制剂、针剂、膜剂、气雾剂等临床可接受的剂型。
全文摘要
本发明涉及一种测定独一味制剂中独一味含量的方法及其测定的标准，属于中药制剂领域。本发明测定方法及其测定的标准是通过独一味制剂中总黄酮、木犀草素含量测定实现；其中其检测标准为每0.3g独一味制剂(相当于生药1g)中含总黄酮以芦丁(C
文档编号G01N30/02GK1544920SQ20031011683
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者阙文彬 申请人:甘肃独一味生物制药有限责任公司