专利名称：鉴定微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及快速鉴定微生物(例如细菌)的方法。
背景技术：
有很多情况都需要能够快速地检测潜在的致病生物体，例如细菌和病毒。目前的实验室方法典型地包括培养生物体和应用免疫诊断测试，或者制备组织学样本以及应用特殊的染色和/或免疫组织化学技术。这些技术至少需要几个小时，如果要培养生物体，则需要几天。基于DNA的鉴定，例如PCR，虽然更灵敏，但仍然需要几个小时，也需要相当多的实验设备和专家。
通过特异性多克隆抗血清和单克隆抗体鉴定特异性微生物是标准的技术实践。免疫组织化学方法可以鉴定组织中存在的生物体，利用例如酶联免疫吸附测试(ELISA)可以检测体液中的病原体，或来源于它们的抗原。然而，除非只用于确定由其他诊断标准(criteria)(一般情况)暗示的特定病原体的存在，这些诊断技术需要应用许多不同的特异性抗体并很难用于从潜在的目标中鉴定出特定的病原体。细胞成分的免疫亲和纯化在理论上也是本领域公知的，但由于通常需要有关的生物体的知识，一般不能成为以鉴定为目的的实用技术。
应用交叉反应血清鉴定微生物先前已有报道(Bonenberger等，2001)。其中，用抗分支杆菌的BCG菌株的多克隆抗血清在活组织样本中对多种微生物进行染色。这项技术不能鉴定特定的个别生物体，只能一般地对一定范围的细菌、真菌和原生动物病原体染色。
近几年来质谱(MS)在生物学上的应用在增长。新的进展使得能够分析大的生物分子(综述见Bakhtier和Tse，2000)。特别是，基质辅助的解析电离(MALDI)和电喷射质谱以及与其相关的相对温和的电离技术特别适合蛋白应用(综述见Rowley等，2000)。不久前，离子井(ion trap)质谱的引入减少了分析生物分子混合物的时间，特别是只有少量物质的时候(Henderson等，1999)。
WO 00/29987(Demirev/马里兰大学)公开了一种测量微生物中各种组分的分子量和应用数据库检索试图鉴定它们的方法。然而，这种方法的缺点是必须处理大量信息，而且必须区分相似分子量的大量组分。它没有试图通过携带信息的生物标记进行预选来简化质谱分析。
WO 96/37777(Nelson等)公开了一种用质谱分析抗原/抗体分析物的方法。然而，该申请的目的确定特定的抗体和/或抗原是否存在，以及如果存在的话，测定它们存在的量。它没有提出明确地鉴定未知生物体的方法。
通过与应用特异性单克隆抗体和免疫亲和纯化相结合，用质谱可以获得许多分子的详细结构图(综述见Downard，2000)。特别是，已对许多的蛋白(例如钙联蛋白)进行了如下分析通过免疫亲和层析分析感兴趣的分子，然后对分离的分子进行质谱分析(Yamashita等，1999)。在一些情况下，可以酶解通过免疫亲和纯化的蛋白，产生一组特定的肽，再对这些肽进行质谱分析，例如，酿酒酵母的Ty1Gag蛋白(Yu等，1998)。Lacey等(2001)报道了通过免疫亲和纯化然后进行质谱分析对运铁蛋白的同种型进行分析，以确立与运铁蛋白异种性有关的糖类修饰的结构。然而这包括使用特异性的抗运铁蛋白多克隆抗体，所述多克隆抗体与相同氨基酸序列的分子结合。分子间的区别在于糖蛋白的糖部分，并且抗体不是交叉反应性的。
带有共同结构特性的分子的亲和纯化可用除固定化抗体之外的其他配体进行，并且是本领域公知的技术。Bundy和Fenselau(2001)报道了利用外源凝集素从不同微生物中俘获不同的复合糖类，以及用特定的糖类俘获表达外源凝集素的细菌。用质谱分析俘获的分子，或它们通过酸水解产生的肽。虽然这些可被描述为用于俘获不同分子以进行MS分析的一般配体，但该方法不能用于鉴定未知微生物。该方法中没有选择合适的生物标记用于鉴定未知微生物。该方法没有讲述如何鉴定生物标记。该方法没有暗示所建议的配体具有足够的特异性，使得可以纯化所要求的特异性生物标记，或者所用的生物标记在本发明所要求的不同生物体中一致地存在。该方法没有暗示使用一种或一小组生物标记能够使大范围的微生物的快速识别成为可能。
虽然在实验室设备中更快速地鉴定病原体是有利的，但也需要便携的野外系统，能够在和平时期用于人类或动物的流行病，或在军用情况下，作为生物武器计量手段的一部分。就这一点而言，病原体，例如瘟疫或炭疽菌，可作为攻击者，典型地以气溶胶形式释放。激光测量可用于检测气溶胶，但是气溶胶也可能只是假(dummy)武器释放的水雾(Willeke和Baron，1993)。人们需要在野外快速而准确地鉴定怀疑是生物武器的物质，无论它是用什么方式释放的。以前也报道过以离子井质谱为基础鉴定细菌的方法(Krishnamurthy等，1999)。其中，在通过反相微细管层析分离之后，在产生的波谱(spectrum)的基础上直接分析并鉴定完整细菌。虽然作者提到了野外应用设备的小型化的问题，但没有建议应用免疫亲和选择来简化质谱分析，并且使该分析适用于对大范围的生物体进行快速鉴定。另外，也没有提及可以用作生物标记的特定蛋白，没有考虑在不同的环境条件下获得的质谱的可重复性。在没有对所用的生物标记进行表征的情况下，这项技术在生物标记的表现(例如离子化特性)的不一致性上也存在缺陷，使得它的可靠性进一步降低。
病毒蛋白的直接质谱分析也已被报道(WO 99/58727)，但是它没有建议亲和纯化和使用共同的生物标记。细菌细胞裂解物的质谱分析也已被报道(Chong等，1997)。在MALDI-TOF质谱分析前用盐酸胍和Triton X-100溶解细菌样品。它没有应用任何形式的亲和纯化。它的目的是在大肠杆菌诱导和抑制蛋白合成，而不是鉴定未知的生物体。
发明概述本发明提供了一种鉴定微生物的方法，包括确定从组成微生物的大量蛋白中提取的至少一种蛋白的分子量。
本发明基于以下发现，即在组成微生物的上千种的蛋白中，通过评估相对少量的蛋白，甚至一种蛋白，可以进行鉴定。众所周知，一些蛋白，特别是那些在细胞中完成普遍存在的和至关重要的代谢功能的蛋白，在广泛的物种中在结构上是高度保守的。它们在具有共同的代谢途径的不同物种中完成非常类似的功能，这一事实导致了进化上的压力，以保留功能特性所依赖的结构特征。这种高度保守的蛋白包括与基本细胞过程例如糖酵解(例如磷酸丙糖异构酶)和核甘酸代谢(例如腺苷酸激酶)有关的酶、DNA聚合酶以及热激蛋白。
这些蛋白的保守区域显示了氨基酸序列的高度同源性。结果，它们带有可与交叉反应抗体结合的共同的免疫表位，使得可以从不同物种中用单一的单克隆抗体来鉴定或分离这些保守蛋白的任一家族。在一些情况下，一个单独的抗体可与非常普遍的保守表位结合，因此可用于从许多物种中分离蛋白。然而，在许多情况下，为了使可鉴定物种的数目最大化，减少存在未鉴定的微生物的机会，可以将与相同或其他蛋白上的不同表位结合的一定数量的这样的抗体组合使用。令人惊异的是，尽管它们的结构高度保守，本发明表明，通过准确地测定它们的分子量，可以利用这些蛋白之间的微小差异快速而一致地鉴定产生它们的物种。质谱达到的分辨力可以容易地鉴别出蛋白或来源于它们的多肽之间单一氨基酸的差别。因此，带有共同表位的高度保守蛋白亲和纯化，以及随后进行这样的蛋白或来源于它们的多肽的质谱分析，可形成鉴定微生物的快速而可靠的方法的基础，其中所述蛋白得自所述微生物。以这样的方式使用的蛋白或其他生物分子被称为生物标记。
这种方法依赖于生物标记数据库的获得，所述数据库将已知的生物标记的准确分子量与生物标记来源的物种联系起来。在一些情况下，可能有必要使用一种以上的生物标记明确地鉴定一个物种、亚种或菌株。这些数据库是通过以下方法产生的在一定的条件范围内生长相关的微生物，通过二维凝胶电泳对蛋白类(proteomes)做图，用抗全微生物细胞裂解物的抗体进行western印迹分析。按以下的标准选择的令人感兴趣的标记可以被快速地鉴定，通过质谱分析准确测定的它们的分子量，将分子量输入数据库。
选择生物标记的一个重要因素是它们的分子量在不同的因素下是恒定的，所述不同的因素例如细胞循环、生长条件(如温度或营养物的获得)。这与在环境(例如生物武器)中鉴定微生物特别相关，所述环境的条件可能远离生物体的最适条件，在这种条件的压力下，微生物可能改变基因表达或翻译后修饰的方式。因此，优选地它们没有通过磷酸化、脂化或核苷化而被短暂修饰，虽然这些修饰可能是已知的和一致性的，这并不排除应用这样的分子进行鉴定。在所有的条件下，生物标记都应该是一致性地以足够高的水平表达的，使提取和分离的量足够多，使得可以进行鉴定。
根据这样的考虑，热激蛋白(Hsp)家族分子是特别合适的生物标记。例如Hsp60分子在物种间具有高度的保守性，不在翻译后被修饰，是一致地和遍在地(ubiquitously)表达的。实际上，由于与细胞胁迫(cellular stress)有关，当生物体处于亚最适环境条件下时，它们的表达增加。Hsp60(GroEL，陪伴蛋白(chaperonin))和它的辅陪伴蛋白Hsp10(GroES)与新生多肽在ATP依赖性地翻译后折叠成它们正确的三级结构，以及非天然蛋白重新折叠成它们正确的天然构象有关(Sigler et al，1998)。
除了应用交叉反应抗体从一定范围的微生物中分离合适的生物标记之外，可以使用其他配体进行生物标记的亲和俘获。外源凝集素可用于俘获在其糖类修饰中带有特异性结构特征的糖蛋白或糖脂。固定化核酸可以用来俘获DNA结合蛋白。依赖于所用的配体，这些蛋白可以是一般的DNA结合蛋白(如聚合酶)或者是序列特异性的结合蛋白(如转录因子或限制性内切核酸酶)。固定化的RNA aptamers和核酶也可以用于结合特异性的靶结构(综述见Hoffman等，2001)。人工染色配体能够结合具有共同结构特点(如辅因子结合凹(pocket))的不同分子(见“亲和层析原理和方法”，Pharmacia LKBBiotechnology，1988)。例如，Cibacron Blue F3G-A结合不同的需要NAD或NADP的酶，以及对腺嘌呤基(adenylyl)底物有特异性的酶，如腺苷酸激酶，它是本发明有用的保守性生物标记。
用交叉反应抗体或其他一般的结合配体从细胞裂解物中免疫亲和纯化一种或几种高度保守的生物标记，然后参照数据库对所用的一种或几种生物标记进行质谱分析(优选离子井质谱)，这两者的结合提供了一种具有多种用途的，快速、可靠和可重复的鉴定微生物的方法。
在一个改变的实施方案中，俘获的生物标记可被酶解，根据所用的酶和候选分子(来自经记录的物种范围)的已知氨基酸序列产生一组可预定的肽。产生的质谱是生物标记的指纹特征，可与数据库进行参照，用于鉴定有关的微生物。使用固定化酶是一个方便的途径，可以简化过程，并降低待分析的肽混合物中存在的酶分子的复杂性。
对于野外生物战中的计量应用，希望以下整个过程可以在便携单元装置中自动进行从环境中取样，浓缩和裂解细胞，亲和纯化感兴趣的生物标记，洗脱上述的生物标记，对它们进行质谱分析，记录所获得的质谱，将质谱与数据库进行最佳匹配，最后参照这些信息，鉴定出被检测的生物体。如果在第一次分析时没有得到明确的鉴定结果，则自动进行其他步骤，例如俘获的生物标记的酶促切割。保留亲和纯化步骤中初始洗脱物的一部分用于此目的。需要精确应用时，最终的输出可以是生物体或其菌株的精确鉴定。对于战场应用，简单地输出“安全”或“不安全”是合适的。
此外，自动单元可以被设计为用于其他应用。例如，用于分析血液或医院和实验室所用的组织样品的椅子上单元(bench-top unit)。
相应地，本发明提供了一种生物标记，其特征在于，来源于至少两个微生物属的大多数种的所述生物标记的种同系物(specieshomologues)是结构上基本相似的，结构上的相似性使得可以从不同种的微生物中分离出所述生物标记；其另一特征是来源于所述属中各种微生物的生物标记具有独特的分子量。
优选地，所述生物标记的特征是它是一种蛋白，结构上的相似性基本上是氨基酸序列的相似性。优选地，所述微生物是细菌。
优选地，所述生物标记的特征是至少三个种同系物具有至少一个共同的表位，使得可以通过免疫亲和层析分离。更优选地，至少五个物种具有至少一个共同的表位。更优选地，它是热激蛋白，最优选地它是Hsp60。
可选地，所述生物标记可以是腺苷酸激酶。
本发明也提供了鉴定微生物的方法，包括a.鉴定一种生物标记，其特征在于，来源于至少两个微生物属的大多数种的所述生物标记的种同系物是结构上基本相似的，结构上的相似性使得可以从不同种的微生物中分离出所述生物标记；其另一特征是来源于所述属中各种微生物的生物标记具有独特的分子量；b.通过针对结构相似的区域进行亲和层析分离所述生物标记；c.通过质谱测量所述生物标记的分子量，以及d.参照数据库分析获得的分子量数据组合，由此推断存在的微生物的种类。
优选地，所述生物标记是从细胞裂解物中分离的。
更优选地，所述生物标记是通过免疫亲和层析分离的，最优选地，所述生物标记是通过固定化抗体分离的，所述固定化抗体特异性地与来源于多种微生物的标记分子上的交叉反应表位结合。
可选地，这种方法可包括附加的步骤在通过质谱测定其分子量之前，把分离的生物标记切割成特定的片段。优选地，生物标记的切割是通过酶解进行的。
优选地，生物标记或其片段的分子量的测量是通过离子井质谱进行的。
本发明也提供了一种鉴定大分子毒素的方法，包括a.通过亲和层析分离一种或几种毒素；b.通过质谱测量所述毒素的分子量；以及c.参照数据库分析所得的分子量数据组合，由此推断存在的毒素的身份(identity)。
本发明的另一个实施方案包括自动进行任一上述方法的设备，包括a.分离生物标记或毒素的装置；b.包括能够测定生物标记或毒素的分子量的质谱的单元；c.能够将得到的数据与已知的分子量数据库匹配，由此推断微生物或毒素身份的数据处理装置。
可选地，所述设备还包括一个单元，所述单元包括一种或者固定化的能够切割所述生物标记的蛋白水解酶。
定义本文所用的“生物标记”指的是一种环境生物化学参数，它的检测或定量可用于鉴定潜在的生物危害。在本发明中，它特别是指结构保守的生物大分子，包括蛋白，它们可以从大范围的微生物中分离，用于鉴定所述微生物。
本文所用的“亲和层析”指的是“一种典型的吸附层析，其中待纯化分子被一种固定在不溶支持物(基质)上的互补性结合物质(配体)特异性地和可逆地吸附”(见“亲和层析原理和方法”，PharmaciaLKB Biotechnology，1998)。
本文所用的“免疫亲和层析”指的是亲和层析的一种形式，其中固定化配体是抗体或其表位结合衍生物本文所用的“种同系物”指的是来自另一物种的等价基因或基因产物。这样的同系物具有等价的功能，在氨基酸水平上具有一定程度的序列相似性。在本文中，没有假设生物体之间在进化上的关系。
发明详述以下参照附图，以实施例的方式描述本发明。


图1是利用本发明方法的系统中功能要素的示意图。
图2显示的是不同的潜在病原菌中的Hsp60蛋白的分子量的图示比较。
图3显示的是单克隆IgG1A57-E4对来自土拉热弗朗西丝氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌的重组Hsp60蛋白的结合亲和性的间接ELISA测量。
图4是流产布鲁氏菌和表皮葡萄球菌的Hsp60蛋白的Arg-C消化产生的肽指纹的图示比较。
图5是从一定范围的潜在致病微生物中获得的腺苷酸激酶的分子量与人类的Hsp60的图示比较。
实施例1 自动取样和鉴定系统参照图1，用一个真空装置(没有显示)从怀疑含有病原菌的气溶胶中获取样品。气溶胶与载体液体混合，通过取样器(2)将悬浮液输入系统(1)。从那里，悬浮物被输送到超声发声器(4)，在超声发声器中，用超声打碎悬浮液中任何细菌的细胞壁，由此将细菌的组成蛋白释放到裂解液中。无可避免地，裂解物中也含有碎片。因此，超声发声器(4)的下游是过滤器(5)，过滤器(5)阻止不需要的物质通过。在一些情况下，通过使用去污剂可以促进裂解，这应当不影响下游的免疫亲和步骤。适合适的温和的非离子去污剂是本领域公知的，包括基于聚氧乙烯的去污剂(例如Triton X-100和X-114、NonidetP40和Brij系列)和正辛基α-D-吡喃葡糖苷。
接下来是免疫亲和模块(module)(6)，其中一种或几种细菌生物标记(如果吸附液中存在的话)被分离。在模块(6)中有一种或几种对所述生物标记有特异性的固定化抗体。裂解液中的生物标记在经过时被结合，余下的液体经过后被丢弃。这一步骤不仅分离了相关的生物标记，而且把它们从可能非常稀的裂解液中有效地浓缩。在裂解液洗涤之后，可以向单元中少量的洗脱缓冲液，以除下结合的生物标记。
释放的生物标记被输送到脱盐装置(8)，在将它们送入离子井质谱(10)之前，将它们脱盐，在离子井质谱(10)中确定它们的单独的分子量。将得到的分子量的组合与一定范围的细菌中相关生物标记的分子量的数据库进行对照，鉴定出匹配的结果。输出的可以是特定的鉴定结果，或者简单地告知操作者该区域“安全”还是“不安全”，以便采取所需的保护措施。
如果分子标记蛋白对于单独分析而言太大，洗脱的蛋白可以通过酶解装置(12)送入脱盐装置(8)，在酶解装置中，蛋白在氨基酸序列中的可预测位点被切割，分析得到的肽。当与预测的肽的数据库比较时，产生的肽分子量的模式是诊断性的(见实施例3)实施例2 利用Hsp60作为生物标记来鉴定潜在的病原菌从多种生物体中获得的Hsp60的平均分子量可以通过已知的氨基酸序列高度准确地预测(根据存在同位素混合物修正)或者用合适的纯化的重组蛋白直接测量。虽然Hsp60在很多物种(不仅是细菌)中具有高度的保守性，质谱分析可以高度准确地测定分子量，能够区分只有三个分子量单位差别的蛋白分子。将这些测量值和已知值数据库进行比较就可以鉴定有关物种，如表1所示。
表1

图2所示的是多种生物体的Hsp60分子量的图示比较，表明很多的物种可以单纯地根据它们的Hsp60分子量(由质谱测出)鉴定出夹然而，为了减少其他蛋白的背景(background)(这些蛋白中或许有一些具有容易混淆的相似分子量)，优选地进行相关生物标记的亲和纯化。对于Hsp60中，可以通过交叉反应抗体从细胞裂解液中免疫亲和纯化蛋白。例如，单克隆抗体A57-E4(Affinity Bioreagents Inc)与许多潜在致病生物体的Hsp60中存在的线性表位RGIDKA结合，所述生物体包括百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophilapsittaci)、伯氏考克斯体(Coxiella burnetii)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、肺炎克氏杆菌(Kebsiella pneumoniae)，嗜肺菌团菌(Legionellapneumophila)、脑膜炎奈色球菌(Neisseria meningitidis)、假单胞铜绿菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、耶尔森肠炎菌(Yersinia enterocolitica)。
因此，应用这样的抗体可以从很大范围的潜在病原体中纯化Hsp60，并鉴定所述病原体。该抗体与土拉热氏弗朗西丝氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌的Hsp60蛋白的结合已通过标准的比色间接ELISA确认并定量，如图3所示。
表2来自沙眼衣原体的Hsp60的胰蛋白酶水解肽图谱平均分子量* 位置 肽序列4029.607503-543 SALESAASVAGLLLTTEALIAEIPEEKPAAAPAMPGAGMDY3791.379231-265 DFLPVLQQVAESGRPLLIIA EDIEGEALATLVVNR3183.553197-224 GYLSSYFATNPETQECVLED ALVLIYDK2717.020142-167 EIAQVATISANNDAEIGNLI AEAMEK2575.881395-420 VDDAQHATIAAVEEGILPGG GTALIR2462.838421-442 CIPTLEAFLPMLTNEDEQIGAR2333.760286-307 AMLEDIAILTGGQLISEELG MK2111.31384-104 AGDGTTTATVLAEAIYTEGL R1842.076181-196 GFETVLDIVEGMNFNR1723.935484-499 DAYTDMLEAGILDPAK1379.617462-473 EGAIIFQQVMSR1309.430327-338 EDTTIVEGMGEK1287.279351-361 QIEDSSSDYDK1231.409105-116 NVTAGANPMDLK1174.400308-318 LENANLAMLGK1145.33665-74HENMGAQMVK1096.141474-483 SANEGYDALR1074.271133-141 ISKPVQHHK1049.227380-389 VGAATEIEMK1048.138171-180 NGSITVEEAK951.067 42-50SFGSPQVTK872.055 371-379 LSGGVAVIR828.987 125-131 VVVDQIR803.887 58-64EVELADK781.800 7-12 YNEEAR772.879 454-461 QIAANAGK731.867 21-27TLAEAVK719.775 277-283 APGFGDR710.851 36-41HVVIDK699.868 447-453 ALSAPLK689.786 51-57DGVTVAK688.758 339-344 EALEAR614.762 28-33VTLGPK579.689 345-349 CESIK

533.602 75-79VCAVK517.646 226-230 ISGIK排除分子量小于500的肽。
*平均同位素修正分子量(M+H)
表3来自肺炎衣原体的Hsp60的胰蛋白酶水解肽图谱平均分子量* 位置 肽序列3805.406232-266DFLPVLQQVAESGRPLLIIAEEIEGEALATLVVNR3213.580198-225GYLSSYFSTNPETQECVLED ALILIYDK2722.019143-168EIAQVATISANNDSEIGNLI AEAMEK2728.109504-530SALESAASIAGLLLTTEALI ADIPEEK2561.854396-421VDDAQHATIAAVEEGILPGG GTALVR2405.786422-443CIPTLEAFLPMLANEDEAIG TR2319.733287-308AMLEDIAILTGGQLVSEELG MK2097.28685-105 AGDGTTTATVLAEAIYSEGL R1957.147328-345EDTTIVEGLGNKPDQAR1828.049182-197GFETVLDVVEGMNFNR1739.934485-500DAYTDMIDAGILDPTK1372.507531 544SSSAPAMPSAGMDY

1231.409106-117NVTAGANPMDLK1191.428309-319LENTTLAMLGK1145.33666-75 HENMGAQMVK1096.141475-484SANEGYDALR1074.271134-142ISKPVQHHK1049.227381-390VGAATEIEMK951.067 43-51 NGSITVEEAK875.951 59-65 EIELEDK872.055 372-380LSGGVAVIR801.958 126-132VVVDELK788.878 455-62 QIASNAGK781.800 8-13 YNEEAR731.867 22-28 TLAEAVK719.775 278-284APGFGDR713.895 448-454ALTAPLK710.851 37-42 HVVIDK689.786 52-58 DGVTVAK614.762 29-34 VTLGPK592.687 346-350CDNIK559.726 323-327VIVTK545.616 365-368LQER533.602 76-80 EVASK519.680 273-277VCAVK517.646 227-231ISGIK排除分子量小于500的肽。
*平均同位素修正分子量(M+H)实施例3 通过胰蛋白酶消化得到来源于Hsp60的Hsp60肽图谱如表2和表3所示，具有相似总分子量的密切相关的Hsp60蛋白的酶解可以得到肽的区别模式(distinctive pattern)，可以通过质谱分辨。胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基的羧基-肽连接处切割肽(除非下一个残基是脯氨酸)。在分子量精确度为0.01％的情况下，一些肽非常相似而难以识别(框内)。在其他情况下，一些非常短的肽具有相同的组成因此有相同的分子量，由切割还可以产生单一的游离氨基酸。即使如此，每一个肽组(set)构成了独特的指纹，所述指纹是产生所述肽的特定生物体的特征。
实施例4 布鲁氏菌属的布鲁氏杆菌和表皮葡萄球菌的Arg-CHsp60肽的比较内肽酶Arg-C(核菌蛋白酶)，如其名称暗示的那样，切割精氨酸的羧基-肽键。图4是Arg-C消化布鲁氏杆菌和表皮葡萄球菌Hsp60得到的肽指纹的图示比较。如图3所示，来自这些生物体的完整Hsp60蛋白的分子量是相似的(分别为57649和57529，包括N-末端蛋氨酸)。然而，获得的肽组是非常不同的，表征了相关的生物体。
实施例5 用腺苷酸激酶作为诊断性生物标记图5所示的是从不同微生物(细菌和原生动物寄生虫Shistosomamansoni)中获得的高度保守的胞内酶-腺苷酸激酶-及人蛋白的分子量的比较。腺苷酸激酶是一种核苷单磷酸激酶，它可以催化腺苷单磷酸、二磷酸和三磷酸之间的可逆的磷酸转移酶反应。该酶在多种细胞代谢过程所需的核苷合成，以及RNA和DNA的合成方面起着十分重要的作用。腺苷酸激酶满足本发明的可用的生物标记的标准，因为它在物种之间具有高度的保守性而，并且每一个物种都具有可以通过分子量区分的独特的蛋白。它也是一致性地表达的，并且是代谢所必需的。
实施例6 通过电喷射质谱测量完整Hsp60生物标记的分子量，从而鉴定大肠杆菌为了表明本发明的实用性，用抗Hsp60免疫亲和柱和电喷射质谱鉴定细菌，具体如下方法抗体柱的制备在与柱结合之前，配体(单克隆抗体A57-E4，Affinity BioreagentsInc)经过0.2M碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH8.3的缓冲液(偶联缓冲液)透析。最佳体积为1毫升，最佳浓度为1至10mg/ml。
使用在Fast Flow Hi-Trap柱中的1毫升NHS活化的Sepharose 4(Pharmacia Biotech)。用3×2毫升的1mM的盐酸清洗柱，除去存储液(异丙醇)，保持流速低于两秒钟1滴，以避免挤压基质。向柱中注入配体溶液并在室温下温育30分钟。通过用0.5M的乙醇胺，0.5M的氯化钠，pH8.3(缓冲液A)和0.1M的乙酸盐，0.5M的氯化钠，pH4.0(缓冲液B)交替清洗来清洗柱并使柱失活(3×2毫升的缓冲液A，3×2毫升的缓冲液B，然后是3×2毫升的缓冲液A)。然后用含有0.1％(w/v)叠氮钠的磷酸缓冲液平衡并保存柱子。
样品的纯化方法所有的样品都在AKTA prime system(Pharmacia Biotech)中经过NHS活化柱。在20mM，pH7.5的磷酸钠中上样，并用3M尿素，在pH8.0或pH2.0下洗脱。1毫升的样品通过样品环加入柱中，用5毫升的磷酸缓冲液洗去杂质。用6毫升的洗脱缓冲液过柱，第一个1毫升的缓冲液作为废液丢掉，收集随后的2毫升用于电喷射质谱分析。通过用4毫升的磷酸缓冲液，然后用10毫升的3M尿素，再用10毫升磷酸缓冲液清洗使柱得以再生，用于下一样品。所有步骤的流速是1ml/min。
质谱实验方法免疫亲和柱的洗脱液以2毫升的级分收集，在4℃下存储过夜。将样品注入2毫升的保持环(holding loop)中。将保持环中的内容物在20％B(A＝0.1％溶于水的TFA，B＝0.1％溶于乙腈/水90/10(v/v)的TFA)中以1ml/min的流速加到C8 cartridge(Hichrom)内。在洗去缓冲盐后，将蛋白用90％B以25μl/min的流速洗脱到Quattro II型串联四极质谱仪(Micromass，UK Ltd)中。以连续方式获得数据。扫描范围m/z 700-2000，每次扫描5秒。毛细管(capillary)电压是3千伏，锥体电压是在扫描的m/z范围内从33伏到74伏。源温度是80℃，LMRes和HM Res被设为15.5。来自cartridge的洗脱峰大约持续1分钟。用马心肌红蛋白校准仪器。
结果抗体与Hsp60生物标记的交叉反应如图6所示，标准的结合测试表明来自一些细菌种类的Hsp60与单克隆抗体交叉反应，所述单克隆抗体抗沙眼衣原体Hsp60，并结合保守表位(RGIDKA)。结合曲线表明这样的抗体适用于从一定范围的细菌种类中免疫纯化Hsp60生物标记。
通过分子量鉴定大肠杆菌Hsp60 K12图7显示了从用细菌蛋白上样的抗Hsp60免疫亲和柱的洗脱液中检测的质谱。标明的分子量峰57203.1±1.8Da与Burland等1995年报道的大肠杆菌K12变异体的Hsp60匹配。标准的大肠杆菌Hsp60分子量，如Swiss-Prot数据库登录号P06130中详细给出的，是57137Da。然而，Burland等报道的变异体有两个突变A261L和I266M，给出的预期分子量是57197。这在仪器的已知分子量精度(±0.01％)范围内，使得不仅可以明确地鉴定生物体，而且能鉴定单独的菌株和突变体。
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权利要求
1.一种生物标记，其特征在于来源于至少两个微生物属的大多数种的所述生物标记的种同系物是结构上基本相似的，结构上的相似性使得可以从不同种的微生物中分离出所述生物标记，来源于所述属中各种微生物的生物标记具有独特的分子量。
2.权利要求1的生物标记，其特征在于它是一种蛋白，所述结构相似性在于氨基酸序列基本相似。
3.权利要求1或2的生物标记，其特征在于所述微生物是细菌。
4.权利要求1-3中任一项的生物标记，其特征在于至少三个种同系物具有至少一个共同的表位，使得可以通过免疫亲和层析分离。
5.权利要求1-4中任一项的生物标记，其特征在于它是热激蛋白。
6.权利要求6的生物标记，它是Hsp60。
7.权利要求1-4中任一项的生物标记，其特征在于它是腺苷酸激酶。
8.一种鉴定微生物的方法，其包括a.鉴定一种生物标记，其特征在于，来源于至少两个微生物属的大多数种的所述生物标记的种同系物是结构上基本相似的，结构上的相似性使得可以从不同种的微生物中分离出所述生物标记，来源于所述属中各种微生物的生物标记具有独特的分子量；b.通过针对结构相似的区域进行亲和层析分离所述生物标记；c.通过质谱测量所述生物标记的分子量，以及d.参照数据库分析获得的分子量数据组合，由此推断存在的微生物的种类。
9.权利要求8的鉴定微生物的方法，其特征在于所述生物标记是从细胞裂解物中分离的。
10.权利要求8或9的方法，其中生物标记是通过免疫亲和层析分离的。
11.权利要求10的方法，其中固定化抗体特异性地结合标记分子上存在的交叉反应表位，所述标记分子来源于不同的微生物物种。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其特征在于以下附加步骤在通过质谱测定分子量之前，将分离的生物标记切割成确定的片段。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述生物标记的切割是通过酶解完成的。
14.上述权利要求中任一项的方法，其中生物标记或其片段的分子量是通过离子井质谱测量的。
15.一种鉴定大分子毒素的方法，其包括a.通过亲和层析分离一种或几种毒素；b.通过质谱测量所述毒素的分子量；以及c.参照数据库分析所得的分子量数据组合，由此推断存在的毒素的身份。
16.一种自动进行上述权利要求中任一项的方法的设备，其包括a.分离生物标记或毒素的装置；b.包括能够测定生物标记或毒素的分子量的质谱的单元；c.能够将得到的数据与已知的分子量数据库匹配，由此推断微生物或毒素身份的数据处理装置。
17.权利要求11的设备，其特征在于它还包括一个单元，所述单元包括一种或者固定化的能够切割所述生物标记的蛋白水解酶。
全文摘要
一种通过生物标记的质谱快速鉴定未知微生物的方法，所述生物标记分离自微生物的裂解物，所述方法基于生物标记在物种之间的结构上的相似性。本发明也公开了所述生物标记，特别是Hsp60。
文档编号G01N27/62GK1535380SQ02814880
公开日2004年10月6日 申请日期2002年5月22日 优先权日2001年5月22日
发明者R·W·蒂特巴尔, D·德斯佩罗克斯, R W 蒂特巴尔, 古迓蘅怂 申请人:英国国防部