专利名称：化学发光免疫分析检测hla-g超敏感方法
技术领域：
本发明属于生物医学临床免疫分析领域。利用化学发光免疫分析通过检測
HLA—G建立早期、敏感、广谱诊断恶性肿癯的方法。此外本发明也可用于生理、病理、药理、免疫、生殖、肿瘤、器官移植等多方面研究。
背景技术：
肿瘤是一种常见病和多发病，发病率居第二位。据世界卫生组织1997年报告称全球肿癯患者每年死亡人数高达660万，到2020年全球的肿瘤患者将达到1500万。各种恶性肿癯严重地威胁着人类的身体健康。在肿癯发病的早期往往没有自觉症状， 一旦发觉自觉症状时已到无法治疗的中晚期。在肿癯发病机理和治疗问题尚未彻底解决的今天要降低肿瘤患者死亡率必须开展基层肿瘤普査工作，做到早发现早治疗。
尽管研究人员已经发现了多种肿瘤相关抗原，例如AFP (甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA15—3、 CA19—9、 CA50、 CA125、 PSA等等。由于免疫分析具有高度的特异性、专一性，所以利用某种肿瘤相关抗原只能检測其对应的一类肿瘤。如果要检查体内是否存在常见的某些肿瘤必须作多项检查。
1987年Geraghty等(l)发现并克隆了 HLA—G。 HLA—G是人类白细胞抗原(HLA) I组中非经典的组织相容性抗原。在正常组织中不存在。HLA—G最初发现于胎盘绒毛细胞滋养层。初期有关HLA—G的研究集中于胎儿同母亲之间的免疫耐受(2)。由于胎盘分泌HLA—G使母体产生免疫耐受，从而使胎儿避免了母体的排斥作用。近20年，HLA—G已成为重要的免疫分子，在免疫、生殖、肿瘤、器官移植等方面作为一种免疫抑制剂发挥着重要作用(3)。由于恶性肿瘤细胞能够表达和分泌HLA—G,恶性肿瘤才得以逃避人体免疫监视，使其快速生长和扩散。免疫组化检測结果证实在喉癌、食道癌、胃痛、结肠癌、，
癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌等多种恶性肿瘤组织中都能表达HLA—G。大量的实验证明，HLA-G是一个具有高度肿瘤特异性的肿瘤标志物，在恶性肿癯的表达具有普遍性。在肿瘤发生和发展过程中其水平在血液、其它体液及肿瘤组织中增高。因此检測HLA-G能广泛地应用于各种常见恶性肿瘤的诊断。通过检测HLA-G便可探明受检者体内是否存在常见的各种恶性肿瘤。因此我们有理由称HLA-G为"肿瘤共同抗原"。
由于HLA—G是肿瘤共同抗原，所以通过检測HLA—G可以诊断多种恶性肿瘤。目前已有检測HLA—G的免疫组化试剂盒和ELISA试剂盒的报道。由于ELISA检測HLA—G的敏感度比较低，不适合用于检測早期恶性肿瘤。为了检測早期恶性肿瘤所产生的低浓度HLA—G，我们建立了超敏感的化学发光免疫分析检測HLA—G的方法。用化学发光免疫分析技术检測HLA—G的试剂盒我们称之为"早期广谱肿瘤诊断试剂盒"。利用该试剂盒只作一次測试就可以诊断多种早期恶性肿瘤。
1977年Arakawe创建了化学发光免疫分析(Chemiluminescentimmunoassay ,CLIA)。该方法可以使检測敏感度可达10的负18次方摩尔水平。根据标记物的不同，化学发光免疫分析可分以下三个类型(l)以辣根过氧化物酶(HRP)为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为二酰基肼的衍生物，在氧化剂存在下，HRP催化二酰基肼衍生物发光，波长425nm。苯酚类化合物可增强其发光强度。(2)以碱性磷酸酶为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1, 2—二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生物)。例如AMPPD、CSPD、 CDP-Star、 Lumi-phos480、 Lumiphos-530等。荧光素衍生物和表面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470nm。 (3)以吖啶酯类化合物为标记物的化学发光系统。该系统不需酶催化，不需增强剂。吖啶酯类化合物在碱性H202作用下直接发光，波长430nm。吖啶酯类化合物发光系统发光强度高，反应干扰因素少，背景发光低，信噪比高，具有较高的灵敏度。吖啶酯类发光系统是一类很有效的化学发光系统。
参考文献1. Geraghty DE， Koller BH， Orr HT. A human major histocompatibilitycomplex class I gene that encodes a protein with a shortenedcytoplasmic segment. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84: 9145-9149.
2. Yan冊,Fan LA. HLA—G and maternal—fetal immunology. Chin J ObstetGynecol (Chin) 2002; 37: 567-569.
3. Yan冊，Fan LA. HLA—G and transplatation. Immunol J (Ghin) 2004; 20:1-3.

发明内容
HLA—G单抗的制备用人工合成的HLA—G多肽抗原片段作为免疫原免疫BALB/c小鼠制备两种同HLA"G反应具有不同结合位点的单抗。具体方法参见本文作者申请的专利(专利申请号为200610130403.3)。
亲合素一生物素双单抗夹心一步法检測HLA-G方法该方法需要两种同HLA-G反应具有不同结合位点的单抗。需制备单抗(1)同生物素的复合物，单抗(2)同酶(或吖啶酯)的复合物，将链每亲合素固化于固相载体上。当单抗(1)同生物素的复合物、单抗(2)同酶(或吖啶酯)的复合物、样品(或标准品)一起加入反应池后，通过一步法生成复合物固相载体一链霉亲合素一生物素一单抗(l) —HLA~G—单抗(2)—酶(或吖啶酯)，经过洗涤后加入底物、氧化剂、增强剂便可法光。吖啶酯标记物需加碱性H202发光启动剂才能发光。
竞争法检测HLA—G的方法只需用一种单抗。首先制备HLA—G(抗原片段)同链霉亲合素的复合物，酶(或吖啶酯)同生物素的复合物，将单抗固化于固相载体上。当样品(或标准品)同HLA—G—链奪亲合素复合物、酶(或吖啶酯)一生物素复合物一起加入反应池，经过反应、洗绦后加入酶的底物、氧化剂、增强剂便可发光。吖啶酯标记物需加碱性H202启动剂才能发光。
若单抗(2)所结合的酶为辣根过氧化物酶，则底物需用二酰基肼的衍生物;若单抗(2)所结合的酶为碱性磷酸酶，则底物是环1， 2 — 二氧乙垸衍生物(AMPPD);若单抗(2)所结合的是吖啶酯类化合物，则反应不需底物，仅需要碱性H202发光启动剂就可发光。
有效的吖锭酯类化合物有吖瞎酯DMAE—NHS、吖啶磺酰胺、吖啶酯AE、双吖啶(DMDSBA)等，其发光启动剂为碱性H202酶促化学发光免疫分析法可采用全自动检測仪，也可采用半自动发光仪。根据需要，固相载体可选用多孔板或磁微粒。渕定吖啶酯化学发光应使用全自动化学发光检測仪。
吖啶酯标记单抗的方法参见本文作者申请的专利(申请号200710056485.6实施例l)。
单克隆抗体同酶或生物素的结合按常规方法进行，已有多处报道
1、 J .Immunological Methods ,1979,31:231-236。
2、 J. Histochem. Cytochem ， 1979，22:1084-1091。
3、 尹伯元、王仁芝、李振甲、许以平等编著《标记免疫学》41—50页。
4、 Peters JH ， Bau呢arten H eds. Monoklonale Antik5rper. 1988:1349-53 。
具体实施方案实施例1
辣根过氧化物酶发光体系的配制方法发光底物二酰基肼的衍生物(优选鲁
米诺)浓度为1.0mMol/L。复合氣化剂过硼酸钠一H202各为1.0通ol/L。复合增强剂对羟基肉桂酸一对碘酚各为0.05mMol/L。用0.1Mol/L, p朋.60的Tris一HC1缓冲液调整pH。
实施例2
生物素一亲合素双单抗夹心一步法检測HLA—G化学发光免疫分析方法的建立
1、 按前述文献制备单抗(1)同生物素的复合物，单抗(2)同辣根过氧化物酶的复合物，将链雾亲合素结合于固相载体上。
2、 建立亲合素一生物素双单抗夹心一步法检測HLA—G的CLIA法。将待測血清(或HLA—G的标准品)、单抗(1)同生物素的复合物、单抗(2)同辣根过氧化
物酶的复合物各50"l加入经链霉亲合素包被的Nanc板孔中，37*C温育60分钟，用PBST洗涤3次，加入底物鲁米诺溶液(具体配制见实施例l)，用化学发光免疫分析仪检測425nm发光值，由微机软件算出样品含量。该方法的灵敏度经測定(Bo+2SD)为0. lng/ml，检測范围0. 5—200 ng/ml。实施例3
正常人血请HLA—G含i測定。正常人105例(志愿无偿献血者)，经检測HLA—G,正常人血清HLA—G的含量为零，正常人血清中未检測到HLA-G 。
实施例4
随机抽查临床确诊的肝癌患者5例，直肠癌患者7例，食道癌患者ll例，肺癌患者3例。经定量检测这26例癌症患者的HLA—G的含量，结果表明这26例癌症患者全都呈现HLA —G阳性反应。5例肝癌的HLA — G平均值为105. 2ng/ml ， 7例直肠癌患者的HLA—G平均值为97. 3ng/ml ， 11例食道癌的HLA一G平均值为85.1ng/ml ， 3例肺癌患者的HLA—G的平均值为63. 7ng/ml 。
权利要求
1、人类白细胞抗原G(HLA-G)化学发光免疫分析方法，其特征在于用酶促化学发光免疫分析体系和/或吖啶酯化学发光免疫分析体系检测HLA-G。
2、 根据权利要求1所述酶促化学发光免疫分析体系，其特征之一在于用辣根过 氧化物酶作为标记物，用二酰基肼衍生物作为辣根过氧化物酵的底物，过氧 硼酸钠一H202作为复合氧化剂，对羟基肉桂酸一对姨酚作为复合增强剂。
3、 根据权利要求1所述酶促化学发光免疫分析体系，其特征之二在于用碱性碟 酸酶作为标记物，用1, 2—二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)作为碱性麟酸酶的底物，用荧光素衍生物和表面活性剂作为发光增强剂。
4、 根据权利要求l所述吖啶酯化学发光免疫分析体系，其特征在于用吖啶酯类 化合物作为标记物，用碱性H202作为发光启动剂。
5、 根据权利要求1所述HLA—G化学发光免疫分析方法，其特征在于用双单抗夹 心法和/或竞争法；固相载体采用微孔板(或条)、高分子聚合物管(或球)、 磁微粒等；用生物素一亲和素作为放大系统；測定手段采用全自动或半自动 化学发光免疫分析仪进行分析測定。
6、 根据权利要求5所述单抗其特征在于用人工合成法合成HLA—G的多肽抗原片段作为免疫原免疫BALB/c小鼠，经细胞杂交形成两个杂交瘤细胞株。这两个 杂交瘤细胞株分泌的HLA—G单克隆抗体同HLA—G反应具有不同的位点。
全文摘要
本发明公开化学发光免疫分析检测HLA-G的超敏感方法。本发明由人工合成的HLA-G抗原片段作为免疫原免疫BALB/c小鼠获得了杂交瘤细胞株。用该杂交瘤细胞株分泌的HLA-G单克隆抗体同化学发光免疫分析技术相结合组成广谱肿瘤诊断试剂盒。广谱肿瘤诊断试剂盒通过检测HLA-G用于临床诊断各种恶性肿瘤。广谱肿瘤诊断试剂盒通过双单抗夹心法或竞争法检测HLA-G。化学发光免疫分析技术采用酶促化学发光法或吖啶酯化学发光法。
文档编号G01N33/574GK101493462SQ20081002603
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者苏殿杰, 苏 韩, 魏桂梅 申请人:广州天美生物技术有限公司