专利名称：一种固醇类物质的衍生方法及其分析检测方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种化学分析过程中固醇类物质的衍生方法及其定性定量检测方法。
背景技术：
人体血清中除含有胆固醇外，还含有微量的角鲨烯和非胆固醇类固醇，非胆固醇类固醇包括胆固醇合成的前体物质，如24-脱氢胆甾烷醇(Desmosterol)，7-烯胆甾烧醇(Lathosterol),和源自膳食的植物固醇，如菜油固醇(Campesterol),豆固醇(Stigmasterol), ￠-谷固醇(P-sitosterol)和胆留烧醇(Cholestanol)。部分固醇类物
质的分子结构如下24-脱氢胆甾醇7-烯胆甾烷醇豆固醇胆甾烷醇新近研究发现，血清中的角鲨烯和胆固醇前体固醇可作为胆固醇合成标志物反映机体的内源性胆固醇合成效率，植物固醇可作为胆固醇吸收标志物反映机体的外源性胆固醇吸收效率。固醇类物质的常用测定方法为气相色谱法和气质联用法，由于固醇类物质的本身的高沸点和血清中含量极少的特性，检测前需要对目标物衍生处理转变为相应的硅醚。通常采用六甲基二硅胺(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等硅烷化试剂和吡啶的混合作为衍生试剂进行样品衍生。此类衍生试剂在衍生过程中容易产生副反应，易产生肉眼可见的沉淀，在检测中引入杂质，灵敏度也会受到影响。

发明内容
为了克服现有衍生方法副反应多、检测灵敏度差的缺陷，本发明的目的是提供一种固醇类物质的衍生方法。所述衍生方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)为衍生试剂，于30-80°C衍生 20-60min。
所述固醇类物质为非胆固醇的固醇类物质；优选人体血清中非胆固醇的固醇类物质。所述非胆固醇的固醇类物质为以胆固醇为前体的固醇类物质和/或植物固醇；优选24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇或胆留烷醇中的一种或多种。上述衍生方法优选采用MSTFA为衍生试剂，于50-70°C衍生30_50min ;进一步优选采用MSTFA为衍生试剂，于60°C衍生40min。
本发明进一步提供了上述衍生方法在固醇类物质分析检测中的用途。所述固醇类物质为人体血清中非胆固醇的固醇类物质；优选人体血清中24-脱氢胆甾醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇或胆留烷醇中的一种或多种；所述分析检测为气相色谱法或气相色谱-质谱联用法定性定量分析检测。本发明还提供了一种固醇类物质的定量分析测定方法，包括以下步骤(I)分别配制待测样品溶液及内标溶液，混合并吹干；(2)采用上述衍生方法任一项技术方案所述的方法进行衍生化处理；(3)衍生后的待测样品采用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法进行定性定量检测。所述的检测方法优选包括以下步骤(I)分别配制待测样品溶液及5 a -胆甾烷内标溶液，混合并于40 60°C氮气吹干;(2)加入100-300 ii L的N-甲基_N_三甲基硅基三氟乙酰胺，优选200 y L，于60°C衍生40min ；(3)衍生后的待测样品采用气相色谱-质谱联用法进行定性定量检测，所述质谱选择离子模式，选用5 a -胆甾烧m/z 217, 24-脱氢胆甾醇m/z 129,胆甾烧醇m/z 306,7-烯胆留烧醇m/z 255,豆固醇m/z 83为定性定量离子；所述待测样品为含有24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇和胆留烷醇的样品。上述步骤⑴优选为分别配置待测样品的正己烷溶液及5 a -胆甾烷正己烷内标溶液，再加入2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合并于40 60°C氮气吹干。上述待测样品优选为含有24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇和胆留烷醇的人体血清样品，所述步骤(I)为分别配置待测样品的正己烷溶液及5a-胆留烷正己烷内标溶液，再加入2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合后加入碱性醇溶液皂化，正已烷提取，提取液于40 60°C氮气吹干。本发明的技术方案采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)为衍生试剂，衍生后的固醇类物质在GC或GC-MS检测中，表现出了较好的可重复性，衍生后的样品连续检测的变异系数较小(见图2)，具有较高的灵敏度。此外，采用MSTFA作为衍生试剂，不产生肉眼可见的沉淀，而且使用单一衍生试剂，操作方便。本发明提供的分析检测方法，对待测固醇类物质的衍生效果好，有利于测定低含量的样品，如人体血清中微量的非胆固醇固醇类物质；用5 a-胆甾烷m/z 217，24-脱氢胆甾醇m/z 129，胆甾烷醇m/z 306，7-烯胆甾烷醇m/z 255，豆固醇m/z 83为定量离子，能有效避开胆固醇峰的干扰，检测效果好，所得的标准曲线线性相关系数均在0. 99以上。


图I是本发明所述衍生方法的工艺流程图；图2是不同衍生试剂相同条件下检测的定量离子的响应因子(RRF);其中，A-D分别为胆留烷醇、24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇衍生后的硅醚检测得到的RRF，1-3分别为衍生试剂 HMDS+TMCS+pyridine (3+1+9)、BSTFA+TMCS (99+1)、MSTFA 衍生后检测的RRF ；图3是本发明所述衍生方法在不同衍生时间下检测得到的RRF ；图4是本发明所述衍生方法在不同衍生温度下检测得到的RRF ；图5是本发明所述衍生方法在不同浓度下检测得到的RRF的线性关系图； 图3-5中1、24_脱氢胆甾醇；2、豆固醇；3、7_烯胆甾烷醇；4、胆甾烷醇；图6-1至图6-5分别为5 a -胆甾烷及胆甾烷醇、24-脱氢胆甾醇、7-烯胆甾烷醇、豆固醇衍生后硅醚的定性定量离子在质谱中的响应值。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I衍生方法的确定(I)试剂的配制2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液称取BHT粉末，以甲醇溶解，配制100ng/mL BHT甲醇溶液，检测过程中起抗氧化作用。固醇标准物质溶液分别称取I. 5 2. Omg 24-脱氢胆甾醇、7_烯胆甾烷醇、豆固醇、胆留烷醇标准物质，以少量正已烷溶解，所得的溶解液混匀，继续加入正已烷，配制一系列浓度(0. 001-1. 400mg/dL之间)的固醇标准溶液，人体血清中的非胆固醇类固醇物质通常含量在0. 02-1. 00mg/dL之间，本发明技术方案选取浓度涵盖了此浓度范围。5a-胆甾烷正已烷内标溶液称取5a-胆甾烷粉末，以正已烷溶解，配制
0.005mg/mL 5 a -胆甾烷正已烷溶液。取固醇标准溶液IOOuL,置于一 IOmL的离心管中，加入5 a -胆甾烷正已烷溶液80 ii L，并加入ImLBHT甲醇溶液，置于50°C沙浴中氮气吹至近干，加入MSTFA 200yL，置于烘箱中衍生，所得溶液以氮气吹干，再以300 y L正已烷定容，转移至400 y L内插管中，进样分析，工艺流程见图I。当分析检测样品为人体血清样品时，试剂的配制为以下步骤取人体血清IOOii L于5mL具塞刻度试管中，80iiL 5 a -胆甾烷正已烷内标溶液，ImL I. Omol/L的KOH甲醇溶液，I. OmL 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合，涡旋15s。置67°C水浴中皂化lh，冷却，加入ImL水，2mL正已烷萃取,重复2次，取合并的正已烷层，加水洗涤至中性,分离出正已烧层，并于40 60°C氮气吹干。(2)气相色谱质谱条件进样量Iii L进样口温度300°C进样模式不分流
柱流量恒线速度45cm/s色谱柱(5%苯基)甲基聚硅氧烷键合硅胶色谱柱(30mX0. 25mmX0. 25iim)，或同等类型的毛细管色谱柱柱温40°C，保持 I. 5min，后以 50°C /min 升温至 280°C，保持 12min，再以 30°C /min升温至300 °C,保持5min。接口温度290°C离子源EI源，70ev，23(TC。(3)定量离子的选择内标物质与四种固醇物质的定性定量离子分别为5a-胆甾烷(217，95，81)、24-脱氢胆甾醇(129，253，73)、胆甾烷醇(306，215，216)、7_烯胆甾烷醇(255，75，458)、豆固醇(83，55，129)。为了避开胆固醇峰的干扰，选用质荷比(m/z) 306为定量离子，m/z 306不受胆固醇峰的干扰(见图6)。从表I和图5可以看出，选用5 a -胆甾烷m/z217，24-脱氢胆留醇m/z 129，胆留烷醇m/z 306，7-烯胆留烷醇m/z255，豆固醇m/z 83为定量离子，四种固醇类物质可以得出较好的浓度线性关系，线性相关系数均在0. 99以上。表I四种固醇类物质的线性参数
权利要求
1.一种固醇类物质的衍生方法，其特征在于，该方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺为衍生试剂，于30-80°C衍生20-60min ;所述衍生方法优选于50_70°C衍生30-50min ;进一步优选于60°C衍生40min。
2.根据权利要求I所述的衍生方法，其特征在于，所述固醇类物质为非胆固醇的固醇类物质，优选人体血清中非胆固醇的固醇类物质。
3.根据权利要求2所述的衍生方法，其特征在于，所述非胆固醇的固醇类物质为以胆固醇为前体的固醇类物质和/或植物固醇；优选24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇或胆甾烷醇中的一种或多种。
4.权利要求1-3所述的衍生方法在固醇类物质分析检测中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述固醇类物质为人体血清中非胆固醇 的固醇类物质；优选人体血清中24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇或胆留烷醇中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述分析检测为气相色谱法或气相色谱-质谱联用法定性定量分析检测。
7.一种固醇类物质的分析检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)分别配制待测样品溶液及内标溶液，混合并吹干； (2)采用权利要求1-3任一项所述的方法进行衍生化处理； (3)衍生后的待测样品采用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法进行定性定量检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)分别配制待测样品溶液及5a -胆甾烷内标溶液，混合并于40 60°C氮气吹干； (2)加入100-300ii L的N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，优选200 y L，于60°C衍生40min ； (3)衍生后的待测样品采用气相色谱-质谱联用法进行定性定量检测，所述质谱采用离子模式，选用5 a-胆甾烷m/z 217，24-脱氢胆甾醇m/z 129，胆甾烷醇m/z 306，7-烯胆甾烧醇m/z 255,豆固醇m/z 83为定性定量离子； 所述待测样品为含有24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇和胆留烷醇的样品。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(I)为分别配置待测样品的正己烷溶液及5 a-胆留烷正己烷内标溶液，再加入2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合并于40 60°C氮气吹干。
10.根据权利要求7-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为含有24-脱氢胆留醇、7-烯胆留烷醇、豆固醇和胆留烷醇的人体血清样品；所述步骤(I)为分别配置待测样品的正己烷溶液及5a-胆留烷正己烷内标溶液，再加入2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合后加入碱性醇溶液皂化，正己烷提取，提取液于40 60°C氮气吹干。
全文摘要
本发明涉及一种固醇类物质的衍生方法，所述衍生方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)为衍生试剂，于30-80℃衍生20-60min。本发明还涉及了所述衍生方法在固醇类物质定性定量分析中的应用。本发明进一步涉及一种固醇类物质的分析检测方法，采用前述方法对待测样品进行衍生化处理。本发明采用MSTFA为衍生试剂，衍生后的固醇类物质在GC或GC-MS检测中，表现出了较好的可重复性，具有较高的灵敏度。此外，采用MSTFA作为衍生试剂，不产生肉眼可见沉淀，而且使用单一衍生试剂，操作方便。
文档编号G01N30/02GK102731557SQ20111008323
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者刘奕忍, 刘洋, 勾新磊, 周晓萍, 张经华, 徐康, 王启辉, 郑春巍, 陈瞾 申请人:北京市理化分析测试中心