专利名称：一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，具体涉及一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法。
背景技术：
哮喘存在有气道高反应性、Ig-E调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白，命名为TLR，最初发现的TLR4是目前研究最多的。研究证实，减毒活菌卡介苗其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合，促进巨噬细胞产生IL-12、IFN-Y，抑制IL-4、IL-5的产生，从而纠正哮喘中Thl/Th2亚群数目和(或)功能失衡。目前，减毒活菌卡介苗对哮喘TLR4表达的影响还未知。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，解决了目前减毒活菌卡介苗对哮喘影响还没相应的检测方法的问题。本发明的一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，具体步骤为步骤I)准备实验动物与试剂准备实验用小动物、卵白蛋白、减毒活菌卡介苗、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体和HRP标记的小鼠IgG抗体；步骤2)实验动物的分组及致敏模型制备实验小动物随机分为小动物只数相等的三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和减毒活菌卡介苗干预组，哮喘发病组第I、7、14天腹腔注射卵白蛋白致敏，以Al (OH) 3作为免疫佐剂，第15天开始雾化激发，建立哮喘模型；减毒活菌卡介苗干预组哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前I天和最后雾化激发I小时内进行减毒活菌卡介苗皮内注射；空白对照组用生理盐水代替卵白蛋白，所有小动物在最后一次激发24h后获取标本；步骤3)小动物肺组织TLR4蛋白的Western Blotting检测取各组实验小动物肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上；PVDF膜经封闭2h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，孵育过夜；再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X-光胶片感光检测蛋白信号；步骤4)数据统计所有实验结果进行统计分析。优选的，所述步骤2)中，注射的卵白蛋白致敏的浓度为O. 08%，注射量为O. 2ml。优选的，所述步骤2)中，减毒活菌卡介苗皮内注射每次的剂量为O. 025mg。优选的，所述步骤3)中，孵育过夜的温度为4°C。优选的，所述步骤4)中，对实验结果的统计分析采用的是SPSS10. O软件。。有益效果经本发明的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，分析得出，由于TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4蛋白的表达量较对照组略有升高，而减毒活菌卡介苗干预组中TLR4蛋白的表达量较前两组均有显著的增强，减毒活菌卡介苗可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Thl/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。
具体实施例方式实施例II材料与方法I)实验动物与试剂的准备昆明种小白鼠、卵白蛋白、减毒活菌卡介苗、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。2)实验动物的分组及致敏模型制备实验动物随机分为三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和减毒活菌卡介苗干预组，每组10只小鼠。哮喘发病组第1、7、14天腹腔注射O. 08% OVA致敏，每次O. 2ml，Al(OH)Jt为免疫佐剂。第15天开始雾化激发；减毒活菌卡介苗干预组哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前I天和最后雾化激发I小时内减毒活菌卡介苗皮内注射再次干预，每次剂量为O. 025mg ;空白对照组用生理盐水代替0VA。所有小鼠在最后一次激发24h后获取标本。3)小鼠肺组织TLR4蛋白的Western Blotting检测取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，4°C孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X-光胶片感光检测蛋白信号。4)数据统计

所有实验结果采用SPSS10. O软件进行统计分析，结果以 土 S的形式表示。组间差异米用t检验。2 结果TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达，哮喘发病组中TLR4蛋白的表达量较对照组略有升高，而减毒活菌卡介苗干预组中TLR4蛋白的表达量较前两组均有显著的增强。3.结论减毒活菌卡介苗为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实，TLR4的配体结合TLR4后，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应。通过实验发现经减毒活菌卡介苗干预后，TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。减毒活菌卡介苗可能是通过刺激TLR4表达上调，进而调节Thl/Th2平衡，在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。
权利要求
1.一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，其特征在于，具体步骤为 1)准备实验动物与试剂准备实验用小动物、卵白蛋白、减毒活菌卡介苗、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体和HRP标记的小鼠IgG抗体； 2)实验动物的分组及致敏模型制备实验小动物随机分为小动物只数相等的三组，分别为空白对照组、哮喘发病组和减毒活菌卡介苗干预组， 哮喘发病组第1、7、14天腹腔注射卵白蛋白致敏，以Al (OH)3作为免疫佐剂，第15天开始雾化激发，建立哮喘模型； 减毒活菌卡介苗干预组哮喘模型的建立同哮喘发病组，在每次致敏前I天和最后雾化激发I小时内进行减毒活菌卡介苗皮内注射； 空白对照组用生理盐水代替卵白蛋白， 所有小动物在最后一次激发24h后获取标本； 3)小动物肺组织TLR4蛋白的WesternBlotting检测取各组实验小动物肺组织提取总蛋白，测定浓度。各组蛋白样品SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上；PVDF膜经封闭2h后，用稀释后的TLR4单克隆抗体，孵育过夜；再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后，滴加化学发光底物，X-光胶片感光检测蛋白信号； 4)数据统计所有实验结果进行统计分析。
2.根据权利要求I所述的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，注射的卵白蛋白致敏的浓度为O. 08%，注射量为O. 2ml。
3.根据权利要求I所述的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，减毒活菌卡介苗皮内注射每次的剂量为O. 025mg。
4.根据权利要求I所述的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，孵育过夜的温度为4°C。
5.根据权利要求I所述的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中，对实验结果的统计分析采用的是SPSS10. O软件。
全文摘要
本发明公开了一种减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，通过对实验小动物建立哮喘模型并多次进行减毒活菌卡介苗接种，以Western Blotting检测实验小动物肺组织TLR4的表达。经本发明的减毒活菌卡介苗对哮喘影响的检测方法，分析得出，卡介苗对哮喘的治疗作用可能与肺组织TLR4上调有关，继而得出减毒活菌卡介苗对哮喘发病的治疗中发挥重要作用。
文档编号G01N21/76GK102654503SQ20111005178
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者张雅琴, 眭建 申请人:苏州卫生职业技术学院