专利名称：一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类用于可逆检测过氧化亚硝酰(0N00-)的荧光探针，具体的说，是一类在0N00_存在下荧光发生增强，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。
背景技术：
过氧化亚硝酰(0N00-)是一种具有强氧化性的短寿命活性物种，在人体内由一氧化氮和超氧负离子反应产生。0N00-能作用于被免疫系统识别的病菌等有害物质而使之失活，从而保护机体免受有害物质侵害，维持细胞和组织的正常功能。但是，在细菌感染等病理条件下，大量0N00—的产生会导致缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、败血症、中风、多发性硬化、动脉硬化、肠炎、癌症及多种神经退行性疾病。然而，长久以来，检测手段的缺乏阻碍了人们对0N00—在生命体系中作用行为的研究。荧光探针是有效检测生命体内0N00_的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、可用于实时可逆检测等优点。Tetsuo Nagano等公开了一类用以检测高反应性活性氧的荧光探针HPF及APF(结构见图 1，T.Nagano et.al，J. Bio. Chem，2003，278，3170)，与 ONOCT 作用后荧光增强从而检测0N00-的存在。但是这类荧光探针同时对羟自由基、次氯酸根等活性物种响应灵敏，不能用于专一性地检测0N00—，也不具有可逆性，不能用于0N00—的实时检测。Dan Yang等公开了一种检测 0N00_ 的荧光探针 HKGreen-I (结构见图 1，Dan Yang et. al, J. Am. Chem. Soc， 2006，128，6004)，次氯酸根不干扰0N00—的检测，但羟自由基对0N00—检测的干扰很大，并且这种探针不具有可逆性，不能用于0N00—的实时检测。最近，Dan Yang等公开了一种检测 ONOCT 的荧光探针 HKGreen-2(结构见图 l,Dan Yang et. al,0rg. Lett.，2009，11，1887)，该探针仍然对羟自由基有较强响应，并且不具有可逆性，不能用于0N00-的实时检测。由于不具有可逆性，上述探针无法准确提供生物体系中由0N00-引起的氧化应激随时间变化的情况，不具有应用前景。开发具有选择性，可用于生物体系中0N00-实时可逆检测的荧光探针具有重要意义。

发明内容
本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内0N00-的可逆荧光探针，此探针可以选择性地与0N00_作用，作用后荧光强度发生改变，在还原性物质如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与0N00—反应的活性中心，以实现选择性地检测0N00_ ；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。所述的荧光探针的通式为通式I =R1-Se-Ii2-Y-R7,通式I中，R1为CV20的烷基，R2为Ch5的烷基；Y 为 R' -C-R"，NR，，0，S，或 Se，其中 R，，R” 为 H 或 C1-Cltl 的烷基；R，、R” 相同或不同；R7为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。当R7为七甲川花菁时，所述荧光探针的通式为
权利要求
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的通式为 通式 I =R1-Se-R2-Y-R7,通式I中，R1为C"。的烷基，&为CV15的烷基；Y 为 R' -C-R“，NR，，0，S，或 Se，其中 R，，R，，为 H 或 C1-Cltl 的烷基；R，、R，，相同或不同；R7为染料母体，染料母体为一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，R7为七甲川花菁，所述荧光探针的通式为
3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，民最佳为C1 Cltl的烷基，R4最佳为 C1 C10的烷基。
4.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，&或&为环烷基，与各自相连的苯环以单键的方式连接或以并环的方式连接。
5.一种权利要求1所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，将通式I应用于检测0N00_时，其是与0N00_作用，生成具有通式II结构的化合物，从而导致荧光的改变；
6.根据权利要求5所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，所述还原性物质为半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白。
7.根据权利要求5所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，将通式III应用于检测0N00_时，其是与0N00_作用，生成具有通式IV结构的化合物，从而导致荧光的改变；
8.根据权利要求5所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，通式I可对0N00—进行定量检测。
9.根据权利要求5所述的荧光探针在实时可逆检测过氧化亚硝酰中的应用，其特征在于，用通式I测定生物体系中的0N00_，其荧光强度随生物体系的氧化还原电位而改变，能够对生物体系中的0N00_的进行实时可逆检测。
全文摘要
一种荧光探针及其在可逆检测过氧化亚硝酰中的应用涉及一类在ONOO-存在下荧光发生增强，在还原性物质存在下荧光又恢复原来状态的荧光探针。本发明提供了一种可用于选择性检测细胞内ONOO-的可逆荧光探针。本发明采用花菁染料作为荧光母体，在花菁母体上引入有机硒醚结构作为与ONOO-反应的活性中心，以实现选择性地检测ONOO-；利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系中的还原性小分子如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质，实现探针分子的可逆性；并同时利用有机硒醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧光性质的影响调变探针分子的荧光性质。
文档编号G01N33/52GK102344794SQ20101024087
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者于法标, 孙小飞, 李鹏, 韩克利 申请人:中国科学院大连化学物理研究所