专利名称：一种牛肝菌挥发性风味物质的鉴定方法
技术领域：
本发明属于食品科学技术领域，属于食用菌风味分析技术领域，具体涉及到顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和气相色谱-嗅觉测量技术。
背景技术：
牛肝菌为肉质大型真菌，是菌物界中大型担子菌的重要类群，其典型的外观特征为:具有菌盖及菌柄、肉质，与伞菌(蘑菇)外形相似，但菌盖下面的子实体层是密集的菌管而非片状菌褶。牛肝菌子实体粘软多汁，香滑可口，富含蛋白质维生素多糖类物质氨基酸和多种矿物元素，其提取物具有增强免疫力抗癌抗辐射等功能。除营养和药用外，食用牛肝菌的的风味也引人关注，其所特有的风味区别于芳香植物和一般食品。近年来，随着生活水平的提高和消费观念的转变，人们在追求摄入食品营养的同时，对食品风味的追求日益增加。野生食用牛肝菌满足了消费者对于营养和风味的双重需求，在中外消费市场中越来越受到重视。在云南及其他一些省份，很多餐馆开始用野生食用牛肝菌做汤，其味道鲜美，深受消费者喜爱。同时，牛肝菌是倍受欧洲市场欢迎的珍稀食品，其在意大利、法国、瑞士、德国等尤为推崇，是我国远销欧美各国的畅销上特产品。因此，对于野生食用牛肝菌风味成分的研究，对于阐明其呈味机理并且为开发新一代调味品奠定理论基础，具有深远的现实意义。目前，关于牛肝菌营养成分的研究较多，而对于其挥发性成分研究较少。顶空固相微萃取(headspace-solid phase micro-extraction, HS-SPME)是 20 世纪 90 年代新发展起来的一种用于食品风味物质分析检测的技术。这种方法最大的特点是把取样、萃取、富集、进样等过程在同一个装置完成，减少了实验的繁琐。与其他分离方法相比，此方法选择性好，不需要溶剂，所需样品用量少，且操作简单、快速、费用低，并可与气相色谱或液相色谱直接联用。目前已有国内外学者应用固相微萃取-气质联用技术(SPME-GC-MS)分析了金针菇、草菇、香菇等食用菌的挥发性物质。以上方法只是对食品的挥发性物质进行了分离鉴定，但是不能确定哪种成分对食品风味有贡献，这是因为在大量的挥发性化合物中，往往只有一小部分成分影响食品的风味，而且有些呈味物质阈值很低、在食品中含量很小，单纯使用GC-MS技术往往不能将这些痕量风味物质检测出来，气相色谱-嗅觉测量法(GC-O)使食品风味的研究有了很大的突破。本实验以美味牛肝菌为原料，通过HS-SPME技术萃取样品中的挥发性成分，并将GC-MS与GC-O以及Kovats保留指数(Kovats retention indices, KI)三种方法结合起来,对样品中的挥发性成分进行定性、定量分析，同时鉴定样品中的风味成分，为牛肝菌调味品的开发提供一定的理论基础。通过检索，尚未发现与本发明申请相关的公开专利文献。

发明内容
本发明的目的是提供一种牛肝菌挥发性风味物质的测定方法。本发明实现目的的技术方案是:
一种鉴定牛肝菌挥发性风味物质的方法，具体步骤是:(I)将牛肝菌干品粉碎，过40目筛；(2)采用顶空固相微萃取方法对挥发性成分进行吸附萃取；(3)利用气相色谱-气质联用技术对挥发性成分进行鉴定；(4)利用嗅觉辨别法对进一步确定挥发性成分，同时通过气味强度确定各物质对牛肝菌风味贡献的大小。而且，所述步骤(2)中采用65 μ m PDMS/DVB萃取头，最佳萃取时间为30min，最佳
萃取温度为45 °C。而且，所述步骤(3)中气相色谱条件为:色谱柱型号为VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，载气为高纯度氦气(99.999% )，流速为 lml/min，进样口温度为250°C，进样时以分流方式进样。采用两段式程序升温:起始温度为40°C，保持3min，然后以4.0°C min升温至150°C,并保持lmin,再以8V /min升温至250°C,保持6min。质谱条件为:电离源为EI，离子阱温度为220°C，GC-MS传输线温度为280°C，EI电子能量为70eV，溶剂延迟时间1.5min。扫描方式为全扫描(f μ μ )，范围为43_500m/z。而且，所述步骤(4)中的嗅觉辨别法具体步骤为:质谱与嗅觉计的分流比设置为1:1。本实验选择3名有经验的感官评价员进行嗅觉分析，记录风味特征和强度。在实验过程中至少有两名感官评价员在同一嗅闻时间处能得到相同的感官描述，则将该记录记入最终结果，气味的强度以星号个数做记号。本发明建立的方法能够简单快速的分析牛肝菌中的挥发性风味成分，采用HS-SPME方法不需有机溶剂，操作简单，避免了样品在加热过程中的挥发和生产其它物质，能有效地收集挥发性成分；利用质谱谱图分析、保留指数和嗅觉辨别三种方法结合准确鉴定了待测挥发性化合物，提高了结果的可信度；同时通过嗅觉测量法分析挥发性化合物的气味强度，确定对牛肝菌整体风味的影响。


图1是牛肝菌挥发性成分的总离子色谱图。
具体实施例方式下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。一种牛肝菌挥发性风味物质的检测方法，步骤是:(I)将牛肝菌干品粉碎，过40目筛；(2)称取样品粉末2.0g于15ml顶空样品瓶中，用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封，置于45°C水浴锅中平衡30min后，将经过老化处现的固相微萃取头通过瓶盖的橡皮垫插入到样品瓶中大约Icm处，推出纤维头，于45°C水浴中萃取30min，然后抽回纤维头，从样品瓶中取出萃取头后迅速插入GC-MS联用仪的进样口，于250°C下解析15min，同时启动仪器采集数据；(3) GC-MS 分析条件色谱条件:色谱柱型号为VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，载气为高纯度氦气(99.999% )，流速为lml/min，进样口温度为250°C，进样时以分流方式进样。采用两段式程序升温:起始温度为40°C，保持3min，然后以4.0°C min升温至150°C，并保持lmin，再以8°C /min 升温至 250°C,保持 6min。质谱条件:电离源为EI，离子阱温度为220°C，GC-MS传输线温度为280°C，EI电子能量为70eV，溶剂延迟时间1.5min。扫描方式为全扫描(f μ μ )，范围为43-500m/z。(4)定性分析实验数据处理由Xaclbiur软件系统完成，未知化合物纤计算机检索同时与NSIT05谱库(107k compounds)相匹配,仅当正反匹配度均大于800 (最大值为1000)的鉴定结果才予以报道。采用相同的升温程序，以C6-C2tl的正构烷烃作为标准，以其保留时间计算样品测试中的化合物的保留指数，再通过查阅相关文献，与文献中的化合物的保留指数(RI)相比较，与质谱数据库检索结果共同定性。化合物保留指数RI计算公式: RI 样品=RI 前 + (Rt 样品-Rt 前)X 100/ (Rt 后-Rt 前)式中RI #p——样品色谱峰的RI ;RI w——样品色谱峰前面烷烃标样的RI ; Rt样品——样品色谱峰的Rt ；Rtw—前面烷烃标样的Rt ；Rt后——后面烷烃标样的Rt ;Rt——色谱峰的保留时间。(5)定量分析通过Xaclbiur工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行定量分析，从而得出各化学成分在牛肝菌物质中的相对百分含量。(6) GC-O 分析质谱与嗅觉计的分流比设置为1:1。本实验选择3名有经验的感官评价员进行嗅觉分析，记录风味特征和强度。在实验过程中至少有两名感官评价员在同一嗅闻时间处能得到相同的感官描述，则将该记录记入最终结果，气味的强度以星号个数做记号。表I为牛肝菌中特 征性挥发性化合物的分析及鉴定结果。表I牛肝菌中特征性挥发性化合物的分析及鉴定结果
权利要求
1.一种牛肝菌挥发性性风味物质的鉴定方法，其特征在于:采用顶空固相微萃取技术提取牛肝菌中的挥发性成分，然后通过气相色谱-质谱仪对待测成分进行定量和定性分析，结合保留指数鉴定牛肝菌中的挥挥发性化合物，最后利用气相色谱-嗅觉测量法进一步确定挥发性组成成分，同时通过感官描述和气味强度确定各化合物对牛肝菌整体风味贡献的大小。
2.根据 权利要求1所述的牛肝菌挥发性风味物质的鉴定方法，其特征在于:所述顶空固相微萃取步骤中，萃取时间为20-40分钟，确定为30分钟，萃取温度为30°C -60°C，优选45°C，使用65μπι PDMS/DVB萃取头。取Ig样品置于15ml顶空瓶中，45°C水浴平衡30min后，将经过老化处理的固相微萃取头通过瓶盖的橡皮垫插入到样品瓶中大约Icm处，推出纤维头，于45 °C水浴中萃取30min。
3.根据权利要求1所述的牛肝菌挥发性风味物质的鉴定方法，其特征在于:气相色谱-质谱检测步骤中，萃取完成后将萃取头插入到气相色谱的进样口，于250°C下解析5min，同时启动仪器采集数据。色谱柱型号为VF-5ms(30mX0.25mmX0.25 μ m)，载气为高纯度氦气(99.999% )，流速为lml/min，进样口温度为250°C，进样时以分流方式进样。采用两段式程序升温:起始温度为40°C，保持3min，然后以4.(TC min升温至150°C，并保持lmin，再以8°C /min升温至250°C，保持6min。质谱条件:电离源为EI，离子阱温度为220°C，GC-MS传输线温度为280°C，EI电子能量为70eV，溶剂延迟时间1.5min。扫描方式为全扫描(f.μ μ)，范围为 43-500m/z。
4.根据权利要求1所述的牛肝菌挥发性风味物质的鉴定方法，其特征在于:特征性风味物质鉴定步骤中，质谱与嗅觉计的分流比设置为1:1。本实验选择3名有经验的感官评价员进行嗅觉分析，记录风味特征和强度。在实验过柞中至少有两名感官评价员在在同一嗅闻时间处能得到相同的感官描述，则将该记录记入最终结果，气味的强度以星号个数做记号。
5.根据权利要求1所述的牛菌挥发性风味物质的鉴定方法，其特征在于:挥发性成分的定性分析步骤中，利用质谱谱图分析、保留指数和嗅觉辨别三种方法结合准确鉴定了待测挥发性化合物。
全文摘要
本发明涉及一种测定牛肝菌中挥发性风味物质的方法，方法如下(1)采用顶空固相微萃取(HS-SPME)方法对牛肝菌中的挥发性成分进行萃取；(2)利用气相色谱-质谱联用技术结合Kovats保留指数(KI)对萃取到的挥发性成分进行分离鉴定；(3)利用气相色谱-嗅觉测量法(GC-O)对牛肝菌中的挥发性风味物质进行鉴定。该发明建立的方法能够简单快速的分析牛肝菌中的挥发性风味成分，采用HS-SPME方法不需有机溶剂，避免了样品在加热过程中的挥发和产生其它物质，有效地收集挥发性成分；利用质谱谱图分析、保留指数和嗅觉辨别三种方法结合准确鉴定了待测挥发性化合物，提高了结果的可信度。
文档编号G01N30/06GK103105440SQ20121043700
公开日2013年5月15日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者刘安军, 郑捷, 陈影, 曹蓓, 杜佳佳 申请人:天津科技大学