专利名称：基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及生化医药技术领域，特别涉及一种细胞生物传感器的制备方法。
背景技术：
癌症，又称恶性肿瘤，已经成为二十一世纪影响人类身体健康及生命的最大杀手。据统计显示，癌症的死亡已位居我国各类死因的第一位(2004年)。因此，癌症的准确诊断及有效治疗一直是生物学、医学等相关领域的研究重点。近几年，肿瘤切除和器官移植在癌症早期是比较有效的治疗手段，但最大问题是癌症诊断出来时一般都已到晚期，此时已经没有行之有效的治疗方法。因此，要提高癌症患者的生存期，最好的方法就是早发现、早诊断。目前，癌症早期诊断的方法很多，但是大多数检测手段繁琐复杂，往往需要很多步才能完成。因此，寻找更简便、快速的方法在癌症早期诊断中意义重大。 生物传感技术是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，生物传感器是一种将生物感应元件的专一性和一个能够产生与待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的分析装置。由于其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测的特点，已在生物、医学、环境监测、食品、医药、及军事医学等领域显示出广阔的应用前景。 纳米结构所具有的小尺寸效应、表面与界面效应等使纳米材料呈现出光学、光催
化、光电化学、力学、热学等许多独特的性能，在催化、滤光、光吸收、医药、磁介质及新材料
等方面有广阔的应用前景。由于纳米材料具有良好的生物相容性，耐腐蚀等优异的性能，受
到生物材料研究者广泛关注，其作为一种有潜力的生物材料已经被广泛地用于生物医药等
领域。纳米生物技术把纳米材料科学、化学与生物技术有机结合，在基因治疗、生物医学、生
物纳米结构的构建及生物大分子结构与功能关系的研究方面具有重要作用。 近年来，将纳米材料引入电化学生物传感器成为这一领域研究的热点。用于增强
电化学生物传感器性能的纳米材料的种类很多，如碳纳米管、纳米金、纳米铂等。二氧化钛
纳米颗粒由于具有化学性质稳定、光敏性高、生物相容性好等特点，已在污染物降解、太阳
能电池、医学、制药等方面得到广泛的应用。随着化学修饰电极的发展，人们发现纳米二氧
化钛的高比表面积，很好的生物相容性，相对较高的导电率等优异性能均使得其适于作为
一种优良的电极修饰材料，并可通过溶胶凝胶法、磁控溅射法、电化学沉积法和复合法等途
径制作成修饰电极，用于电化学生物传感器领域。纳米二氧化钛用于修饰电极可以改善生
物分子氧化还原可逆性，其高的比表面积有利于酶的固定化，提高酶分子的相对活性，还能
促进酶活性中心与电极表面的电子传递。纳米二氧化钛这些特性对于提高生物检测的灵敏
度和稳定性具有重大意义，为生物传感器领域开辟了广阔的前景。

发明内容
针对现有癌症诊断技术存在的分辨率不够高、诊断费用昂贵、检测周期长等缺点，本发明提出了一种集合二氧化钛纳米颗粒与氧化铟锡导电玻璃制成的基于二氧化钛纳米
3界面的细胞生物传感器的制备方法，这种传感器具有操作简便、检测快速、灵敏度高、检测限低等优点，可广泛应用于生物分子识别和癌细胞检测等生物医学领域。 本发明提供了一种基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备方法第一步，将二氧化钛纳米颗粒(P25)超声分散于十六烷基三甲基溴化铵CTAB中，得到质量浓度为0. 33mg/ml的乳白色纳米二氧化钛溶胶；第二步，用微量进样器取4 10 P L第一步制得的纳米二氧化钛溶胶，均匀滴涂于已超声清洗过的氧化铟锡IT0导电玻璃的导电面，置于干燥器中晾干即得Ti02/IT0修饰电极；第三步，将白血病细胞用磷酸盐缓冲溶液PBS洗涤并稀释至1.6X104cells/ml 1. OX 107cells/ml，得到细胞悬浮液，取lOiiL细胞悬浮液并均匀涂覆于第二步制备的修饰电极表面，并于培养箱中37t:恒温放置2h后即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。 其中，基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备方法中所述的白血病细胞可以为白血病敏感细胞K562/B.W.(以下简称K562)或白血病耐药细胞K562/A匿(以下简称KA)。 有益效果 实验研究结果表明，本发明采用分散法制备纳米二氧化钛溶胶以及使用滴涂法将二氧化钛溶胶修饰在ITO导电玻璃上的方法均简单且便于操作，在ITO表面形成了一层均匀致密的纳米颗粒薄膜，由此得到的基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器能显著提高白血病细胞的检测灵敏度；电化学探针在此修饰电极上的响应电流明显大于修饰纳米二氧化钛之前裸电极上所得响应电流值，同时这种生物传感器可以灵敏地检测和区分白血病敏感与耐药等不同种类的细胞；与一些常规生物学检测方法(如MTT和流式细胞术等)相比，此方法操作简单，检测快速，整个检测过程只需几个小时即可完成，而常规方法一般需要几十个小时甚至几天，大大縮短了检测周期，这对于白血病的早期诊断和早期治疗十分有利。
我们通过接触角检测研究了 ITO电极表面在修饰纳米二氧化钛前后的亲疏水性变化，又采用电化学法分析研究了白血病敏感和耐药细胞在此界面上的行为，最后以白血病耐药细胞为例，研究了此传感器对癌细胞的高灵敏检测。研究结果表明，修饰纳米二氧化钛之后，电极表面的亲水性大大增加，进而加快了电子传递速率，提高了传感器的检测灵敏度，且在此界面上不同种类白血病细胞之间探针的电化学性质也有明显的差异，从而可以达到快速检测与识别敏感和耐药等不同种类白血病细胞的目的。


下面结合

本发明的实施例。本发明保护范围不以实施例为限。
图l是电化学探针在纳米二氧化钛界面上的伏安图图1A为循环伏安图；图1B为
脉冲伏安图。 图2是修饰纳米二氧化钛前后，水滴在IT0电极表面上接触角图像。 图3A是不同浓度白血病耐药细胞KA在纳米二氧化钛界面上的交流阻抗谱图；图
3B是阻抗值与细胞浓度对数的关系曲线。
具体实施例方式
本发明的二氧化钛纳米颗粒(P25)购于Degussa公司，IT0导电玻璃购于金坛康
4达克应用薄膜中心，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购于国药集团化学试剂有限公司，磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钠5mM，磷酸氢二钠15mM，氯化钾0. 2M)pH = 7. 2。
本发明提供了一种基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备方法
第一步，将二氧化钛纳米颗粒(P25)超声分散于十六烷基三甲基溴化铵CTAB中，得到质量浓度为0. 33mg/ml的乳白色纳米二氧化钛溶胶； 第二步，用微量进样器取4 10 L第一步制得的纳米二氧化钛溶胶，均匀滴涂于已超声清洗过的氧化铟锡IT0导电玻璃的导电面，置于干燥器中晾干即得Ti02/IT0修饰电极； 第三步，将白血病细胞用磷酸盐缓冲溶液PBS洗涤并稀释至1. 6X104cellS/ml 1. OX 1()7cells/ml，取10 L均匀涂覆于第二步制备的修饰电极表面，并于培养箱中37°。恒温放置2h后即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。 电极表面的修饰方法种类很多，依其类型、功能和基底电极材料的性质和要求而不同。其中，滴涂法是制备薄膜修饰电极的最简单方法之一。具体操作就是取几微升修饰剂的溶液滴加到电极表面，使其挥发成膜。此法的主要优点在于修饰剂在电极表面的覆盖量可从其浓度和滴加体积得知。 实施例1 一种基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备将lmg 二氧化钛纳米颗粒(P25)溶于3ml十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) (2mM)中，
超声分散20min，得到乳白色纳米二氧化钛溶胶(质量浓度为0. 33mg/ml)。将ITO导电玻
璃按照使用要求的规格切割成条状，并依次分别在丙酮、无水乙醇和二次超纯水中超声清
洗5min，取出后用超纯水冲洗，氮气吹干。用微量进样器取4 lOii L纳米二氧化钛溶胶均
匀滴涂于ITO导电面，置于干燥器中晾干即得修饰电极(Ti02/IT0)。其中，量取的二氧化钛
溶胶的体积可以是4 10 L中的任一数值。 实施例2 —种基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备将lmg 二氧化钛纳米颗粒(P25)溶于3ml十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) (2mM)中，
超声分散20min，得到乳白色纳米二氧化钛溶胶(质量浓度为0. 33mg/ml)。将ITO导电玻
璃按使用要求的规格切割成条状，并依次在丙酮、无水乙醇和二次超纯水中超声清洗5min，
取出后用超纯水冲洗，氮气吹干。用微量进样器取6 L纳米二氧化钛溶胶均匀滴涂于ITO
导电面，置于干燥器中晾干即得修饰电极(Ti02/IT0)。 实施例3电化学探针在二氧化钛纳米界面上的电化学响应 采用三电极体系，以银丝为参比电极，钼丝为辅助电极，分别以修饰二氧化钛纳米颗粒前后的ITO电极为工作电极，用电化学方法研究铁氰化钾在这两种界面上的电化学性质。结果发现，与ITO导电玻璃本身的氧化铟锡膜界面相比，该二氧化钛纳米界面能显著加速电子传递速率，提高检测灵敏度。图1(A)和(B)分别为铁氰化钾的循环伏安图和脉冲伏安图，其中曲线a为ITO电极的、曲线b为TiO乂ITO修饰电极的，从图1中可以看出与裸电极相比，铁氰化钾在二氧化钛纳米界面上的峰电流明显增强，表明这种生物传感器能够有效促进电子传递，具有高灵敏性。
实施例4 二氧化钛纳米界面的亲疏水性 ITO导电玻璃本身的氧化铟锡膜界面的疏水性很好，如图2 (a)(接触角大小为77° )，这限制了电化学探针与电极表面的接触，而在此表面上进一步修饰一层纳米二氧化钛后，界面变得十分亲水，如图2(b)(接触角大小为20° )，这就使得电化学探针与电极表面的接触面积大大增加，从而大大提高检测的灵敏度。 实施例5在基于二氧化钛纳米界面上白血病敏感和耐药细胞的区分
本实施例中，分别将培养基中的白血病敏感细胞K562和白血病耐药细胞KA以1200rpm的速度离心5min，取离心管底部细胞沉淀用0. 02M pH = 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再离心，如此重复操作2 3次后，用计数板计数，再根据细胞数目用PBS将两种细胞均稀释至5. OX 106cells/ml。分别取10 P L稀释后的细胞悬浮液均匀涂覆在修饰纳米二氧化钛前后的ITO电极的导电面上，并于培养箱中37t:恒温放置2h后在电极表面形成一层细胞膜，即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。 采用三电极体系，以银丝为参比电极，钼丝为辅助电极，分别以覆盖有K562和KA细胞的裸IT0电极和Ti02/IT0修饰电极(即KA/IT0和K562/IT0， KA/Ti02/IT0和K562/Ti02/IT0)为工作电极，用电化学方法测量电化学探针铁氰化钾在这几种不同界面上的脉冲伏安图。结果表明，由于修饰纳米二氧化钛前后界面性质发生了变化，进一步覆盖上两种细胞后，铁氰化钾的电化学性质也有了很大差异。在IT0导电玻璃本身的氧化铟锡膜界面上覆盖两种不同细胞后，铁氰化钾的峰电流大小基本相同，峰电位也基本一致；而在修饰有二氧化钛纳米界面的IT0电极上覆盖两种不同细胞后，铁氰化钾的峰电流均明显增加，且在两种细胞膜界面上增加的幅度有很大差异，白血病敏感细胞K562增加的幅度远大于白血病耐药细胞KA，并且铁氰化钾的峰电位也由在原来界面上的基本一致变为有明显的位移。由于细胞膜不具有导电性，且与白血病敏感细胞相比，耐药细胞由于其细胞表面P-糖蛋白(P-gp)的过度表达而更容易吸附在界面上，从而阻碍了铁氰化钾的电子传递，因此峰电流比覆盖了敏感细胞后所得到的要小，进而细胞所吸附的界面的亲水性越好，两种细胞之间的这种差别也就越明显。由此，就可以达到快速检测与识别敏感和耐药这两种不同种类癌细胞的目的，从而达到对癌症的早期诊断。 实施例6基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的高灵敏检测研究
本实施例中，以白血病耐药细胞KA作为研究对象，进一步研究该类细胞传感器的检测灵敏度。首先，将培养基中的白血病耐药细胞KA以1200rpm的速度离心5min，取离心管底部细胞沉淀用0. 02M pH = 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再离心，如此重复操作2 3次后，用计数板计数，再根据细胞数目用PBS将其依次稀释至5个不同的浓度。取各个浓度的10 ii L细胞悬浮液分别均匀涂覆在纳米二氧化钛修饰的IT0电极上，并于培养箱中37°C恒温放置2h后在电极表面形成一层细胞膜，即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。
采用三电极体系，以饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为对电极，分别以覆盖有不同浓度KA细胞的纳米二氧化钛修饰电极(即KA/Ti02/IT0)为工作电极，用交流阻抗法测得覆盖有不同浓度细胞的界面上阻抗谱如图3A所示，图中从a到f，纳米二氧化钛修饰电极上覆盖的KA细胞浓度依次为0cells/ml， 1. 6X 104cells/ml，8. 0X 104cells/ml，4. 0X105cells/ml，2. 0X106cells/ml，l. 0X107cells/ml。由图中高频区半圆直径的大小可以看出，在纳米二氧化钛修饰电极表面上，随着细胞浓度的增加，阻抗值也随之增加(图3A中内插图为此电极反应过程的等效电路图)。为了更进一步得出定量关系，作了阻抗值R。t与细胞浓度对数值的线性关系(如图3B)，它们之间的线性方程为R。t(Q)=505. Q81gC (cells/ml)-1543. 55 (R = 0. 996)，检测限为1. 3 X 103cells/ml (S/N = 3)。由此可看出，我们制备的基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器实现了对癌细胞的高灵敏检测， 对于临床上实现癌症的早期诊断具有重要意义。
权利要求
一种基于二氧化钛纳米界面的细胞生物传感器的制备方法，其特征在于第一步，将二氧化钛纳米颗粒(P25)超声分散于十六烷基三甲基溴化铵CTAB中，得到质量浓度为O.33mg/ml的乳白色纳米二氧化钛溶胶；第二步，用微量进样器取4～10μL第一步制得的纳米二氧化钛溶胶，均匀滴涂于已超声清洗过的氧化铟锡ITO导电玻璃的导电面，置于干燥器中晾干即得TiO2/ITO修饰电极；第三步，将白血病细胞用磷酸盐缓冲溶液PBS洗涤并稀释至1.6×104cells/ml～1.0×107cells/ml，得到细胞悬浮液，取10μL细胞悬浮液并均匀涂覆于第二步制备的TiO2/ITO修饰电极表面，并于培养箱中37℃恒温放置2h后即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。
全文摘要
本发明提供了一种基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器的制备方法。第一步，将二氧化钛纳米颗粒超声分散于十六烷基三甲基溴化铵中，得到质量浓度为0.33mg/ml的纳米二氧化钛溶胶；第二步，用微量进样器取4～10μL第一步制得的纳米二氧化钛溶胶，均匀滴涂于超声清洗过的氧化铟锡导电玻璃的导电面，置于干燥器中晾干即得TiO2/ITO修饰电极；第三步，将白血病细胞用磷酸盐缓冲液洗涤并稀释至1.6×104～1.0×107cells/ml，得到细胞悬浮液，取10μL悬浮液均匀涂覆于第二步制备的修饰电极表面，并于培养箱中37℃恒温放置2h即得基于二氧化钛纳米界面的细胞传感器。其中，所述的白血病细胞可以为白血病敏感细胞K562/B.W.或白血病耐药细胞K562/ADM。这种细胞生物传感器制备简单，检测快速，灵敏度高。
文档编号G01N27/327GK101776638SQ20101001831
公开日2010年7月14日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者吴春惠, 吴晓静, 周研研, 姜晖, 李景源, 王雪梅, 赵娟 申请人:东南大学