专利名称：一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法
技术领域：
本发明属于啤酒质量评价技术领域，更详细地说，涉及用于检测功能啤酒中牛磺 酸的高效液相色谱法。
背景技术：
牛磺酸(Taurine)是一种广泛存在于人和动物体内的含硫？氨基酸，早在1827年 就被从牛的胆汁中发现并分离出来，并因此而得名。牛磺酸作为人体内一种条件性必需氨 基酸有着广泛的生物学活性，是调节机体正常生理功能的重要物质。研究表明，牛磺酸因其 对运动机体内的自由基代谢、Ca2+转运等具有良好的调节作用，从而表现出良好的抗运动疲 劳效果。目前，市场上已推出了多种添加牛磺酸的功能饮品，如含有牛磺酸的运动啤酒、运 动饮料等为对这些功能啤酒进行严格的质量控制，需要建立准确的啤酒中牛磺酸测定方 法。目前定量检测食品中牛磺酸含量常用的方法有酸碱滴定法、氨基酸自动分析法、薄层色 谱法和高效液相色谱法等，而专门针对啤酒检测的多为荧光光度法，其它方法没有应用到 啤酒检测，由于各种方法和样品的差异性，在样品前处理、分析步骤以及所使用的试剂等方 面都有所不同。荧光光度法采用强酸性阳离子树脂分离出啤酒中的牛磺酸，与邻苯二 甲醛(OPA)/2巯基乙醇衍生化后进行荧光法测定。由于牛磺酸是磺化氨基酸 (NH2-CH2-CH2-SO3H)，含有磺酸根(SO3H)，与树脂结合最不紧密，当经过阳离子树脂柱的时候 首先被洗脱下来，可能存在样品中与树脂结合较弱的其它氨基酸共流出，从而导致测定值 偏高。此外，阳离子树脂处理操作较为繁琐，不利于常规检测。而且由于啤酒中存在几十种 不同种类的游离氨基酸，易对牛磺酸的检测产生干扰，仅靠单一的荧光光度法很难将牛磺 酸从其它氨基酸中完全分离，从而影响其准确定量。

发明内容
本发明的目的是建立一种能对功能啤酒中牛磺酸进行准确定性和定量的高效液 相色谱法，用于该类型啤酒的质量控制。本发明采用高效液相色谱法(英文简称HPLC)，利 用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(英文缩写AQC)柱前衍生，二极管阵列或 紫外检测器和荧光检测器串联检测，通过调节缓冲液浓度、PH以及溶剂梯度淋洗，实现啤酒 中牛磺酸与其它氨基酸的完全分离，从而对其进行准确定性和定量。本发明所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，包括下述步 骤(一)衍生前处理程序6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生；本发明还包括下述步骤( 二)梯度洗脱程序流动相A为139. 92mmol/L三水乙酸钠+16. 39mmol/L三乙 胺的缓冲液，用50%磷酸调节pH至4. 98，流动相B为纯水，流动相C为乙腈，分别针对标样 和啤酒样品优化梯度洗脱程序，使得牛磺酸与啤酒中其它干扰物质完全分离；
(三)色谱分析和数据处理程序样品分析所使用的色谱柱为美国Waters公司的AccQ-Tag氨基酸分析C18柱， 3. 9mm*50mm，4um，将待测啤酒和牛磺酸标样谱图对比，以保留时间定性，色谱峰峰面积定
量，计算公式如下
权利要求
1.一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其特征是包括下述步骤 (一)衍生前处理程序6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯柱前衍生。
2.如权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其特征 是还包括(二)梯度洗脱程序流动相A为139. 92mmol/L三水乙酸钠+16. 39mmol/L三乙 胺的缓冲液，用50%磷酸调节pH至4. 98，流动相B为纯水，流动相C为乙腈，分别针对标样 和啤酒样品优化梯度洗脱程序，使得牛磺酸与啤酒中其它干扰物质完全分离；(三)色谱分析和数据处理程序样品分析所使用的色谱柱为美国Waters公司的AccQ-Tag氨基酸分析C18柱， 3. 9mm*50mm，4um,将待测啤酒和牛磺酸标样谱图对比，以保留时间定性，色谱峰峰面积定量。
3.如权利要求2所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其特 征是所述的步骤(二)梯度洗脱程序为(1) (To. 5分钟内，流动相为100%缓冲液A，进行 等度洗脱；(2)0. 5分钟时，流动相瞬间切换为99%缓冲液A+1%乙腈；(3)0. 5 27. 0分钟， 流动相由99%缓冲液A+1%乙腈线性变换为95%缓冲液A+5%乙腈，逐渐增大有机相(乙 腈)比例以减小流动相极性；(4) 27. (Γ33. 0分钟，遵循曲线8所代表的为非线性换相方式， 流动相由95%缓冲液A+5%乙腈逐渐变换为91 %缓冲液A+9%乙腈，进一步减小流动相 极性，使在色谱柱上保留较强的组分洗脱下来；(5)33. (Γ33. 5分钟，流动相由91%缓冲液 A+9%乙腈线性变换为60%纯水+40%乙腈，开始冲洗色谱柱；(6) 33. 5^34. 0分钟，流动相 从60 %纯水A+40 %乙腈变为40 %纯水+60 %乙腈，进一步加大有机相比例以增强冲洗强 度；(7) 34. 0 37· 0分钟，以40%纯水+60%乙腈冲洗色谱柱3分钟；(8) 37. 1分钟，流动相变 换为100%缓冲液A，开始平衡色谱柱；(9)37.广45. 0分钟，以100%缓冲液A平衡色谱柱至 初始状态，为分析下一个样品做好准备。
4.如权利要求2或3所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特征是步骤(二)前包括二极管阵列或紫外和荧光双检测器串联检测程序，即将二极管阵 列或紫外检测器和荧光检测器串联在色谱柱后，样品中的牛磺酸衍生产物与其它干扰物质 在色谱柱上实现分离，并依次通过二极管阵列或紫外检测器和荧光检测器，分别利用待测 物质的紫外和荧光特性进行检测，从而实现牛磺酸的双重定性和定量。
5.如权利要求2或3所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特征是步骤(三)计算公式如下式中C样——待测啤酒中牛磺酸的含量，mg/L ； Cfe标样中牛磺酸的含量，mg/L;A#------待测啤酒中牛磺酸的峰面积；A标------标样中牛磺酸的峰面积；f——待测啤酒的稀释因子。
6.如权利要求2或3所述的一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，其 特征是步骤(三)后包括验证程序，方法评价指标包括加标回收率、重现性和最小检出限等达到啤酒样品的分析要求。
全文摘要
一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法，包括下述步骤(一)衍生前处理程序6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯柱前衍生；(二)梯度洗脱程序流动相A为139.92mmol/L三水乙酸钠+16.39mmol/L三乙胺的缓冲液，用50％磷酸调节pH至4.98，分别针对标样和啤酒样品优化梯度洗脱程序，使得牛磺酸与啤酒中其它干扰物质完全分离，样品分析所使用的色谱柱为美国Waters公司的AccQ-Tag氨基酸分析C18柱，3.9mm*50mm，4um；(三)数据处理程序将待测啤酒和牛磺酸标样谱图对比，以保留时间定性，色谱峰峰面积定量。本发明实现了啤酒中牛磺酸与其它氨基酸的完全分离，从而对其进行准确定性和定量。方法操作简单，准确可靠，具有较高的灵敏度。
文档编号G01N30/02GK102147397SQ201010301398
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者单连菊, 李梅, 杨朝霞, 杨梅, 董建军, 郝俊光 申请人:青岛啤酒股份有限公司