专利名称：核酸杂交检测方法
相关申请的交叉参考本申请基于在2001年7月25日和2002年7月23日向韩国工业产权局提交的申请号为10-2001-44971和10-2002-43389的申请进行的，其内容这里引入作为参考。
背景技术：
发明领域本发明涉及一种核酸杂交的检测方法，以及更具体地，一种利用单链核酸或双链核酸特异的核酸结合物质进行核酸电荷状态改变的电化学检测方法。
相关技术描述核酸杂交的检测是核酸芯片领域最重要的技术。通常的检测方法是激光诱导荧光光谱方法，该方法通过检测用激光照射荧光标记的核酸时激发出来的光。Affymetrix和Nanogen提供了基于激光诱导的荧光光谱方法检测的DNA芯片。但是，存在几个问题(a)用荧光分子标记核酸较繁琐；(b)方法复杂；以及(c)荧光分子昂贵。
最近，已经研究出了数种不用荧光的核酸杂交检测方法，已经开发出利用表面等离子体共振、石英晶体微天平(quartz crystal microbalance)、质谱以及电化学的方法。
但是，除了电化学方法，这些方法仍然有如费用高以及费力的问题，而电化学方法简单，因此没有专业知识的人都可以进行操作，并且较低的价格就可以购得大多数所需设备。
发明概述本发明的一个目标是提供一种用于检测核酸杂交的电化学方法。
本发明的另一个目标是提供一种操作简单且费用低廉的核酸杂交检测万法。
为了实现这些目标，本发明提供了一种检测核酸杂交的方法，包括(a)将捕获探针固定到工作电极表面制备寡核苷酸板(oligo-plate)；(b)将捕获探针与靶探针杂交；(c)使之与单链核酸或双链核酸特异的核酸结合物质反应，以及(d)在电活化电解条件下用电化学方法测定工作电极表面的电荷状态的改变。
附图简述

图1示意性地显示寡核苷酸板的制备流程。
图2和3显示多重阵列(multi-array)。
图4a显示带有杂交核酸的寡核苷酸板。
图4b显示嵌入对电极表面负电荷的中和作用。
图5a显示电极表面的氧化/还原反应，其中负电荷由于嵌入而被中和。
图5b显示带负电的电极表面对[Fe(CN)6]3-的静电排斥。
图6a为嵌入前工作电极的循环伏安图。
图6b为嵌入后固定有单链的工作电极的循环伏安图。
图6c为嵌入后固定有DNA杂交体的工作电极的循环伏安图。
图7为被吖啶化合物嵌入后工作电极的循环伏安图。
发明详述本发明涉及核酸杂交的检测方法，包括用特异的核酸结合物质嵌入固定在工作电极表面的单链核酸或双链核酸，并测定单链核酸或双链核酸的负电荷改变。
本发明的核酸为DNA或RNA。
术语″杂交体″指互补结合的双链核酸。
本发明的核酸结合物质为可以共价或非共价结合到双链核酸或单链核酸的化合物。核酸结合物质可选自能插入到DNA双链沟中的化合物，能在堆积碱基对之间嵌入的化合物，单链核酸特异结合的化合物，双链核酸特异结合的化合物以及DNA双链大沟或小沟特异结合的化合物。核酸结合物质为带电分子，因此其与核酸的结合改变了工作电极表面的电荷状态，更优选地，核酸结合物质为带有正电荷并对双链核酸和单链核酸有特异性的化合物。
核酸结合物质的实例为嵌入剂、嵌入荧光染料、吖啶化合物、氯喹、奎宁、米托蒽醌(novanatrone)、阿霉素、单链结合蛋白以及Rec A蛋白。
嵌入剂对双链核酸具有特异性，并且包括嵌入荧光染料、吖啶化合物、氯喹、奎宁、米托蒽醌和阿霉素。
嵌入荧光染料可选自1，1′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基]]双[4-[(3-甲基-2(3H)-苯并恶唑亚基)甲基]]-，四碘化物(YOYO-1)、1，1′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基]]双[4-[3-(3-甲基-2(3H)-苯并恶唑亚基)-1-丙烯基]]-，四碘化物(YOYO-3)、4-[(3-甲基-2(3H)-苯并恶唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]-，二碘化物(YO-PRO-1)、4-[3-(3-甲基-2(3H)-苯并恶唑亚基)-1-丙烯基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]-，二碘化物(YO-PRO-3)、2，2′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基-1(4H)-吡啶基-4-亚基次甲基]]双[3-甲基]-，四碘化物(POPOTM-1)、2，2′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基-1(4H)-吡啶基-4-亚基-1-丙烯-1-基-3-亚基]]双[3-甲基]-，四碘化物(POPOTM-3)、EtBr(3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基-溴化物)、3-甲基-2-[[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-4(1H)吡啶亚基]甲基]-，二碘化物(PO-PROTM-1)、3-甲基-2-[3-[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-4(1H)-吡啶亚基]-1-丙烯基]-，二碘化物(PO-PROTM-3)以及SYBR绿(Molecular Probes)。吖啶化合物可选自3，6-二氨基吖啶、3，6二氨基-10-甲基吖啶鎓氯化物、吖啶橙以及吖啶黄。
本发明的优选核酸杂交的检测方法包括(a)将捕获探针固定在工作电极表面制备寡核苷酸板，(b)将捕获探针与靶探针杂交，(c)使之与单链核酸或双链核酸特异的核酸结合物质反应，以及(d)在电活化电解条件下用电化学方法测定工作电极表面电荷状态的改变。
核酸杂交的检测方法还包括在步骤(c)之前将寡核苷酸板与表面活性剂反应的步骤。表面活性剂可以液体使用，将其溶解在嵌入溶液使用的同样缓冲液中。表面活性剂的浓度不受限制，但优选为约10mM。使用的表面活性剂可为通用的表面活性剂，例如十二烷基磺酸钠或triton-x。
参考图1的实例对寡核苷酸板进行更详细的解释。寡核苷酸板可通过将捕获探针(2)固定在工作电极表面((D)进行制备，或通过电极表面与捕获探针5′或3′-端的巯基((3))或氨基之间的化学结合而实现。此外，为了防止捕获探针和工作电极表面之间的直接接触，在其之间进一步插入碳链连接臂(9))。碳链连接臂的碳原子数不受限制，但优选为6～12。
捕获探针和靶探针为DNA或RNA，且工作电极为导电金属，选自金、铂、银、碳、铜、镍、铬以及钯。工作电极可为薄膜或条，可将金属电镀在芯片的通用基质上进行制备。
在本发明的工作电极上，每个电极可固定一种捕获探针。因此，为了固定数种捕获探针，可以制备多层的多重阵列(图2和3)。可在多重阵列上有规律的间隔布置辅助电极(5)。辅助电极也已知为反电极，且其为没有在其上固定捕获探针的空白电极，金或铂可用作其基质。辅助电极可以在化学反应期间防止参比电极和工作电极之间的电压下降，并且其有助于工作电极传输精确且稳定的电压。参比电极提供了一种能控制电压大小的标准，通常由银/氯化银(Ag/AgCl)制备得到，后者用AgCl掺杂银进行制备。参比电极可放置在溶液中的其他位置。参比电极还可保持恒定的电压，不用考虑周围的电反应。
在核酸杂交检测方法的杂交步骤(b)中，当靶探针与固定在工作电极表面的捕获探针反应时，与靶探针互补的捕获探针将产生核酸杂交体(图4a)，但不互补的捕获探针不与靶探针结合，因此保持单链核酸状态。
杂交反应可依据探针特性、大小等进行，且更优选地，杂交反应可依照常规方法进行。为了稳定捕获探针和靶探针之间形成的核酸杂交体，可以使用包含氯化钠的缓冲液。杂交后，去除残留的非特异的结合靶探针和靶探针。
在步骤(c)的反应中，单链核酸特异的或双链核酸特异的核酸结合物质与工作电极表面的捕获探针或核酸杂交体反应。因此，带正电荷的核酸结合物质特异地与核酸杂交体或单链核酸结合，从而减少负电荷(图4b)。
同时，在步骤(c)后可以利用表面活性剂、加热、电压或超声波等方法以将非特异结合减小到最小。例如，双链核酸特异的嵌入剂插入到堆积碱基对，但其也具有与单链核酸产生离子相互作用的倾向。在电极表面上应用表面活性剂、加热、超声波或电压可以消除这种非特异性结合。优选加热的温度为65～95℃，用超声波处理时可按常规方法或通过超声进行，电压可以加到电极上。
在步骤(d)中，将寡核苷酸板浸没在电解条件下以利用电化学方法测定工作电极表面的电荷状态改变。此时，若表面电极上的核苷酸的负电荷减少或被核酸结合物质中和，带负电的电解质会迁移到电极表面附近，从而导致带负电的电解质的表面浓度增加，发生氧化/还原反应。但是如果核苷酸的负电荷没有减少或被中和，带负电的电解质被静电斥力推离电极表面，从而不发生氧化/还原反应(图5b)。
电解质为带负电化合物，并优选为包含[Fe(CN)6]3-的溶液。电解质的实例为包括50mM NaCl、10mM磷酸盐(pH7.0)以及3mM K3Fe(CN)6的溶液。
电化学方法的实例为循环伏安法、电流分析法以及计时库仑分析法。循环伏安法是一种研究电极上电势改变的电化学技术，利用电势扫描，然后对刚通过的电势区域进行反向扫描，从而产生三角形的波形。电流分析法为使用测定电流的技术，计时库仑分析法为一种电分析方法，通过测定工作电极上电流随时间的变化速率。
例如，当用循环伏安法测量工作电极的电流改变时，嵌入前工作电极的循环伏安图如6a所示，嵌入后固定有未被嵌入的DNA链的工作电极的循环伏安图如6b所示，且固定有嵌入的DNA链的工作电极的循环伏安图如6c所示。即，嵌入后的捕获探针在电极表面的负电荷被中和或下降，因此带负电的电解质很易接近电极表面，容易发生还原/氧化反应。
因此，当双链核酸特异的嵌入剂与捕获探针反应的时候，如果得到如图6b所示的循环伏安图，则表示捕获探针不与靶探针互补。但是如果得到如图6c所示的循环伏安图，则表示捕获探针与靶探针互补。
如上所述，本发明的核酸杂交检测方法提供了一种检测核酸杂交的电化学方法，并且该技术可用于DNA芯片或生物芯片，费用低廉且操作简单。
下述实施例将用来对本发明进行进一步的说明。但是，这些实施例只是为了更好地理解本发明，而不对其范围进行任何限制。
实施例1寡核苷酸板的制备金条用作工作电极。
金条首先用1500和2000号砂纸抛光，然后用5μm、1μm和0.05μm粒径的氧化铝糊进行连续抛光，然后在去离子水中超声5分钟。
将电极表面在饱和的氢氧化钠溶液中煮沸1小时，在硫酸中浸没24小时，并且用去离子水彻底洗涤。代替将其浸入硫酸中的方法是，可将电极表面在piranha溶液中浸没3-4小时。
用作捕获探针的5′端有巯基的寡核苷酸从Sigma-Aldrich购买，序列为SEQ ID NO1。
将10ng/mL的捕获探针溶解在蒸馏水中或10mM磷酸盐溶液(pH7.0)中，后者包含50mM的NaCl。将混合物滴在金电极表面上并孵育超过8小时，然后用蒸馏水清洗。然后将金电极浸没在包含50mM的NaCl 10mM的磷酸盐溶液(pH 7.0)中，且24小时后，用同样的溶液洗涤，从而制备出寡核苷酸板。
实施例2将与捕获探针互补的寡核苷酸用作靶探针，靶探针具有SEQ ID NO2序列。
将10μg/ml的靶探针加入到缓冲液(1×TE，400mM NaCl，pH7.0)中以配制靶探针溶液。将实施例1中制备的寡核苷酸板在靶探针溶液45℃浸泡15小时。降温后，将寡核苷酸板用包含50mM NaCl的10mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，并且在将寡核苷酸板在包含7mM SDS的1×TBE(pH，7.0)或包含50mM NaCl和7mM SDS的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中浸泡后，用1×TBE(pH 7.0)洗涤。
将寡核苷酸板在包含10-7M的SYBR绿的1×TBE(pH7.0)中浸泡10分钟，并将其用包含50mM NaCl的10mM磷酸盐(pH 7.0)洗涤。
实施例3将捕获探针的非互补的寡核苷酸用作靶探针，且靶探针序列为SEQ IDNO3。用如实施例2中描述的相同方法将SEQ ID NO3的靶探针与实施例1的寡核苷酸板进行反应。
实施例4利用EG&G Potentiostat/Galvanostat Model 273A(Princeton AppliedResearch)在室温进行实施例2和实施例3电极的循环伏安测定。Ag/AgCl[3MNaCl]参比电极(BAS)以及铂丝辅助电极用于循环伏安法测量，并且包含50mM NaCl、10mM磷酸盐(pH7.0)以及3mM K3Fe(CN)6)的[Fe(CN)6]3-溶液用作缓冲溶液。电压扫描范围为0.6V～-0.5V(相对Ag/AgCl参比电极)，且扫描速率为100mV/秒。实验前向[Fe(CN)6]3溶液中通入氮气5分钟从而除去氧气。
图6a-c显示循环伏安图，其中图6a为空白金电极的循环伏安图，图6b为实施例3电极的循环伏安图，且图6c为实施例2电极的循环伏安图。
图6a-c表明捕获探针与实施例2的靶探针杂交，但是捕获探针不能与非互补的实施例3靶探针杂交，并且捕获探针保持单链DNA状态。结果与预测一致。
实施例5用吖啶化合物进行杂交检测用实施例1中描述的相同方法制备寡核苷酸板，并进行杂交反应。将寡核苷酸板在包含0.5-5mM SDS、50mM NaCl以及10mM磷酸盐(pH7.0)的缓冲液中浸没10分钟。用50mM NaCl和10mM磷酸盐(pH7.0)洗涤后，将寡核苷酸板在1mg/mL的3，6-二氨基吖啶、50mM NaCl以及10mM磷酸盐(pH7.0)中浸没10分钟，清洁后测定循环伏安图。
图7为用吖啶化合物嵌入后的工作电极的循环伏安图。固定有捕获探针并产生DNA杂交体的工作电极的循环伏安图，如①所示，测定的只固定有单链DNA的工作电极循环伏安图，如②所示。
序列表<110> POHANG IRON_STEEL CO.，LTD.
学校法人 浦项工科大学校(Pohang University of science and Technology)<120> 核酸杂交检测方法<130> DPP021550<150> KR 10-2001-44971<151> 2001-07-25<150> KR 10-2002-43389<151> 2002-07-23<160> 3<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 捕获探针序列<400> 1gttttcccag tcacgacggg 20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 靶探针序列<400> 2
cccgtcgtga ctgggaaaac 20<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 靶探针序列<400> 3ctcgccatgt ctgtgaccac 20
权利要求
1.一种核酸杂交的检测方法，包括(a)将捕获探针固定在工作电极表面上制备寡核苷酸板；(b)将捕获探针与靶探针杂交；(c)使之与单链核酸或双链核酸特异的核酸结合物质进行反应，以及(d)在电活化电解条件下用电化学方法测定工作电极表面电荷状态相关的电化学指标。
2.根据权利要求1的方法，其中核酸为DNA或RNA。
3.根据权利要求1的方法，其中核酸结合物质为带电分子，其与核酸的结合改变工作电极表面的电荷状态。
4.根据权利要求1的方法，其中捕获探针在其末端还包含巯基。
5.根据权利要求1的方法，其中捕获探针在其末端还包含胺基。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的工作电极选自金、铂、银、碳、铜、镍、铬以及钯。
7.根据权利要求1的方法，其中核酸结合物质选自嵌入剂、嵌入荧光染料、吖啶化合物、氯喹、奎宁、米托蒽醌、阿霉素、单链结合蛋白以及RecA蛋白。
8.根据权利要求7的方法，其中嵌入荧光染料选自1，1′-[1，3亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基]]双[4-[(3-甲基-2(3H)苯并恶唑亚基)甲基]]-，四碘化物、1，1′-[1，亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基]]双[4-[3-(3-甲基-2(3H)苯并恶唑亚基)-1-丙烯基]]-，四碘化物、4-[(3-甲基-2(3H)苯并恶唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]-，二碘化物、4-[3-(3-甲基-2(3H)-苯并恶唑亚基)-1-丙烯基]-1-[3-(三甲基氨基)丙基]-，二碘化物、2，2′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基-1(4H)-吡啶基-4-亚基次甲基]]双[3-甲基]-，四碘化物、2，2′-[1，3-亚丙基双[(二甲基亚氨基)-3，1-亚丙基-1(4H)-吡啶基-4-亚基-1-丙烯-1-基-3-亚基]]双[3-甲基]-，四碘化物)、EtBr(3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基-，溴化物、3-甲基-2-[[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-4(1H)-吡啶亚基]甲基]-，二碘化物、3-甲基-2-[3-[1-[3-(三甲基氨基)丙基]-4(1H)-吡啶亚基]-1-丙烯基]-，二碘化物以及SYBR绿。
9.根据权利要求7的方法，其中吖啶化合物选自3，6-二氨基吖啶、3，6-二氨基-10-甲基吖啶鎓氯化物、吖啶橙以及吖啶黄。
10.根据权利要求1的方法，其中检测方法还包括在步骤(c)之前用表面活性剂处理寡核苷酸板的步骤。
11.根据权利要求10的方法，其中表面活性剂为十二烷基磺酸钠或triton-x。
12.根据权利要求1的方法，其中检测方法还包括正在步骤(c)之后将加热、电压、表面活性剂或超声波应用于寡核苷酸板的步骤。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的电化学方法为循环伏安法、电流分析法或计时库仑分析法。
全文摘要
本发明涉及一种检测DNA杂交的方法，包括(a)将捕获探针固定到工作电极表面制备寡核苷酸板，(b)将捕获探针与靶探针杂交，(c)使之与单链核酸或双链核酸特异的核酸结合物质反应，(d)核酸结合物质改变工作电极表面的电荷状态，以及(e)在电活化电解条件下用电化学方法测定工作电极表面电荷状态相关的电化学指标。
文档编号G01N27/48GK1558957SQ02818727
公开日2004年12月29日 申请日期2002年7月25日 优先权日2001年7月25日
发明者韩宗勋, 朴鲁境 申请人:Posco公司, 学校法人浦项工科大学校