专利名称：远程控制的能量转移染料复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及根据权利要求1的前言的至少两种用于配置荧光共振能量转移对 (FRET对)的不同荧光团的用途。此外，本发明涉及一种荧光共振能量转移复合物(FRET复合物)，其包括至少一种 作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一种作为受体荧光团的第二荧光团(B)，及连接 荧光团(A)和(B)的特定有机基。
本发明还涉及一种荧光共振能量转移系统(FRET系统)。此外，本发明涉及根据本发明的不同目的的FRET复合物和FRET系统的用途，尤其 是用于样品中项目检测，或用于与靶分子或靶结构的相互作用，和/或用于检测或鉴定，或 用于靶分子或靶结构的确定。此外，本发明涉及根据本发明的FRET复合物和FRET系统的用途的进一步应用， 例如作为一种染料，尤其是一种荧光染料，或在生物传感器中，或作为(生物)探针，尤其是 FRET探针。最后，本发明涉及一种荧光共振能量转移对(FRET对)，其包括至少两种不同荧光 团，在FRET对中有至少一种作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一种作为受体荧光团 的第二荧光团(B)。
背景技术：
有机金属稀土复合物，特别是β - 二酮化合物(β -diketonates)及其芳香族羧酸 盐，已应用于各个领域中，其独特的发光机制(或“天线效应”)例如在生物传感器中是有利 的。荧光共振能量转移(FRET)是现有技术中已知的一种物理过程，其中一个受激发 的荧光染料(也称为供体或供体荧光团)的能量一般能被转移到第二个荧光染料(同义也称 为受体或受体荧光团或猝灭剂)。能量转移或FRET的强度尤其取决于两个荧光团的距离。 FRET的基本原理是，在两个荧光染料中，受激发的供体荧光团的能量能被转移到受体荧光 团，该到荧光受体的能量转移不以荧光的形式发生，而以非辐射的方式，例如通过偶极/偶 极相互反应发生。为了使这种类型到受体的非辐射能量转移使用FRET，必须满足各种标准。一方面， 供体的发射光谱应与受体的吸收光谱重叠。另一方面，供体和受体的偏振电子平面应该平 行，且最后供体和受体间的距离应该只有1纳米或几纳米因为FRET信号的强度与两个荧光 团的距离的6次方成反比。由于FRET的强度尤其取决于两个荧光团的距离，在一定程度上， FRET的使用已确立在光学纳米级，特别是在生物化学和细胞生物学，其可检测蛋白质/蛋 白质，蛋白质/核酸和核酸/核酸的相互作用，尤其是空间结构的变化，例如生物分子中的 构象变化。在这方面的相互作用之间，同源和异源二聚作用或蛋白质的低聚作用也可依据 FRET现象测定。如果供体和受体荧光团耦合到同一分子，也可以测量蛋白质的构象变化。 同样，在分子生物学中，FRET的原理在使用实时PCR (实时聚合酶链反应)核酸定量中通过特殊的探针的使用在实践中实现。在这方面，可以利用FRET和“LightCycler ”探针定量核酸，“LightCycler ”探针 是特殊的水解探针，其中每个不同的核苷酸都标记一个供体或受体，与核酸分子的靶序列 并排连接，从而使供体和受体相互接近，以使FRET当成PCR产物定量的探针使用。另一种常用的FRET包含了 “TaqMan ”探针的应用，“TaqMan ”探针是特殊的水解 探针，其中，探针的一端标记一个受体或猝灭剂，另一端标记一个供体或报告荧光染料。受 体荧光与完整的水解探针的连接由于非辐射能量转移(FRET)被猝灭剂抑制。在PCR循环 中，探针与互补DNA链相杂交，而受体荧光仍被抑制。在PCR循环中，Taq聚合酶形成了探 针的5’末端。供体的荧光团不再被猝灭剂猝灭，并且可被测量。将“分子信标”作为探针使用是利用FRET进行PCR产物实时定量的另一个选择。 分子信标是与供体和猝灭剂或受体均连接的寡核苷酸。由于探针的5’端核苷酸和3’核苷 酸相互补，所以可形成以环状二级结构为特征的分子信标。在这种状态下，被称为茎环，供 体由于与受体相接近而不显示荧光。通过PCR循环中环状区域与互补DNA序列的结合，供 体与受体的距离增加，通过这种方式可观察到供体荧光。分子信标的结构和功能原理在Tyagi和Kramen (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14, 303—308 中被 详细描述。它们也是美国专利5，925，517的主题，在此其被完全参考用于公开分子信标的 结构和功能。5’端的5’-(2_氨乙基)_氨基萘-1-磺酸(EDANS)作为荧光团/猝灭剂对，且3’ 端的4’-(4_ 二甲基氨基)偶氮苯甲酸(DABCYL)作为猝灭剂。使用DABCYL在5’端与荧光 素相结合也是可行的(G. Leone, von Schijndel H. , van Gemen B. , Kramen R. F. and Schon D. (1998) "Molecular Beacon Probes Combined with Amplification by NASBA Enable Homogeneous Real-time Detection of RNA" Nucleic Acids Research 26, 9, 2150-2155)。因此，由于FRET引起的猝灭，分子信标不发出或发出很少的荧光辐射，或使用两 个荧光团产生光谱移动，从而当样品序列与靶序列未杂交时去除测量区域的信号，最近证 实分子信标在检测系统中作为探针是极其有效的，在该检测系统中多余探针的清洗是不 必要的或不可能的。该应用尤其适用于实时PCR技术或活细胞中核酸的检测(Liu X.， Farmerie W. , Schuster S. , Tan W. (2000) "Molecular beacons for DNA Biosensors with a Micrometer to Submicrometer Dimension，， Analytical Biochemistry 283, 56-63)。即使在复杂的生物系统中，如活细胞，例如细胞成分的非特异性荧光已证明是错 误的一个重要系统源，这些错误一般显著地降低了检测方法本身的有效性和特异性，即使 使用已知的分子信标或FRET探针。例如，血红蛋白或芳香烃在被紫外光激发时显示非特异 性荧光，且这种荧光可能负面地显示为其自身的背景辐射。因此实际的测量信号被叠加。这 种背景辐射也被称作样品环境或样品介质的自发荧光。在FRET过程的范围中，尤其是关于分子生物学的应用，很有必要增加各自的FRET 探针的效率。不仅是这种情况下染料的特异性选择和调节有重要意义，而且鉴于染料之间 空间间距，探针结构也很重要。如上所述，FRET现象只发生在供体与受体的间距较小时，且与染料或荧光团间距离的六次方成反比。鉴于此，尤其是(并不总是完全)，现有技术中先前 已成功尝试提供高效的探针，尤其是分子信标。现有技术的探针并不总是具有一个最佳发 射光谱，其特别影响测量样品或样品介质的自发荧光的发射光谱的分化。另外，在这方面发 射时间通常不是最理想的，因为它们一般在激发后几纳秒减弱，所以FRET探针的发射必须 在激发信号的同时在时间分辨测量范围内检测，其不利于信号的检测和评估。另外，现有技 术的FRET探针通常不产生最佳的FRET，所以供体的猝灭不总是最佳的。德国专利DE 102 59 677 B4，其可追溯到申请人，涉及一种识别和定量样品中微 生物的方法，微生物分离后并将分离的微生物转移到PCR管中进行靶核苷酸的扩增，使用 一种特殊的探针确定靶核苷酸，该探针包括至少两个形成FRET对的探针。使用的探针只有 在与靶核苷酸杂交后才发出识别信号，该信号存在的时间比样品环境的荧光发射时间长， 所以该测量信号可通过时间分辨荧光测量与样品环境的自发荧光相区分。在这一点上，关 于使用的FRET探针，之前应用一种基于EuTTAPhen和Cy5的特殊FRET对。这种类型的荧 光染料的结合在发射行为方面比现有技术有相当大的改善，但是这方面的属性并不总是最 佳的。特别是，德国专利描述的探针是一种“单色分析”，这使得可以确立两个相应的荧光 染料的距离，特别是即使在一个有限的范围内。

发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种FRET复合物或FRET系统，其适用于上述应 用，并且特别是，避免至少一些现有技术的缺点，或至少减少这些缺点。特别是，本发明的一个目的在于提供一种FRET复合物或FRET系统，其能够适用 于，例如，用于定性和定量测量如核酸分子的靶分子的分子生物学分析方法，例如在实时 PCR的范围下，用于结构变化的测定，如蛋白质。特别是，在该例子中提供一种具有改善的发 射行为，特别是具有改善的发射持续时间和发射带宽的FRET复合物或FRET系统，它可能特 定地区分或辨别样品的自发荧光。另外，改进的染料复合物之间的距离的定性确立并从而 使与靶分子或靶结构相互作用成为可能，其基于根据本发明的FRET复合物或复合系统。为了解决上述问题，本发明(根据第一方面)根据权利要求1提出至少两种不同的 用于配置荧光共振能量转移对(FRET对)的荧光团的用途。根据本发明的该用途的另一个 有利的结构是相关从属权利要求的主题。本发明的另一个主题(根据第二方面)是根据本发明权利要求39的荧光共振能量 转移复合物(FRET复合物)。根据本发明的FRET复合物的另一个有利的结构是相关从属权 利要求的主题。此外，本发明的另一个主题(根据第三方面)是根据本发明权利要求42的共振能量 转移系统(FRET系统)。本发明这方面的另一个有利的结构是相关从属权利要求的主题。本发明的另外的主题(根据第四方面)是根据本发明权利要求46的用于检测样品 中项目的FRET复合物或FRET系统的应用。根据本发明第四方面的应用的另一个有利的结 构是相关从属权利要求的主题。本发明的另一个主题(根据第五方面)是根据本发明权利要求M的与靶分子或靶 结构相互作用的FRET复合物或FRET系统的应用。根据本发明的这方面的应用的另一个有 利的结构是相关从属权利要求的主题。
此外，本发明的另一个主题(根据第六方面)是根据本发明权利要求57的作为用于 标记或类似目的的染料的FRET复合物或FRET系统的应用。根据本发明的这方面的应用的 另一个有利的结构是相关从属权利要求的主题。此外，本发明的另一个主题(根据第七和第八方面)是根据本发明权利要求58的作 为生物传感器或在生物传感器中，或者作为(生物)探针或在(生物)探针中，特别是FRET探 针的FRET复合物或FRET系统的应用。根据本发明的这方面的应用的另一个有利的结构是 相关从属权利要求的主题。最后，本发明的还一主题(根据第九方面)是根据权利要求60的荧光共振能量转移 对(FRET 对)。为了避免重复，不言而喻的是，下文描述的只关于本发明一方面的结构、实施例和 优势等当然也适用于本发明的其他方面。申请人:惊奇地发现，上述问题可通过使用至少两种特殊的、不同的荧光团解决，该 荧光团定义如下，用于荧光共振能量转移对(也同义地称为FRET对)的结构。该FRET对包 括一作为供体荧光团的第一荧光团(A)和作为受体荧光团的第二荧光团(B)。根据本发明 的应用，其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素 的有机金属复合物为基础进行配置。在本发明的范围内，荧光团(A)和(B)以这样的方式选 择，即它们包括彼此不同的稀土元素。根据本发明在应用范围内配置的FRET尤其适用于生物化学或分子生物学分析 方法的范围内的应用，例如特定靶分子或靶结构的检测，特别是生物分子如样品中的DNA， RNA，蛋白质等，从而有效地作为FRET探针，在这种情况下根据本发明在应用范围内配置的 FRET对也可能包括能与靶分子或靶结构相互作用的特定部分或组分。另外，在本发明的范 围内制备的FRET对适用于例如蛋白质或核酸的分子构象变化的确定或检测。生物分子的 裂解和连接过程可由根据本发明制备的FRET对检测。另外，还可能用作一种染料。在本发明的范围内，可通过带有不同稀土元素的荧光团(A)和(B)的特异性选择 成功制备一高效的系统或复合物，而且FRET系统的进一步特殊的结构(下文描述)，特别是 关于荧光团(A)和(B)相对于彼此的空间排列，所述系统或复合物尤其适用于FRET分析或 FRET检测应用的范围，特别是在分子生物学或生化分析中用于检测或发现，和用于特定靶 分子或靶结构构象变化的分析。在这种情况下，在本发明范围内制备的FRET对，其特征是包括一具有很窄发射带 的界定的发射光谱，其产生优良的检测性，特别是由于根据本发明制备的FRET对的发射光 谱与样品环境的非特异性荧光发射有显著区别，因此在这种方式下，可实现所需测量信号 的自发荧光和非特异性背景辐射的有效区分。由于根据本发明制备的FRET对具有很长的发射时间，所以根据本发明的FRET对 或FRET探针的特性及下文描述的本发明的FRET复合物或FRET系统还可进一步改善，也就 是说，根据本发明的FRET对或FRET探针在被合适的激发信号激发后，发出一暂时延长的发 射信号，该发射信号进一步改善检测性。因此，根据本发明的FRET对的信号发射持续时间 为几毫秒，而例如在终止激发信号后基于样品环境的自发荧光的不希望得到的干扰荧光下 降到纳秒内(例如大约200纳秒)。这导致测量信号和干扰信号之间的可辨性和区别的进一 步改善。
根据本发明的FRET对或FRET系统的另一个决定性优势是，在这种情况下，由于 包括不同稀土元素的荧光团(A)和(B)的特异性选择导致其是双色检测的，所述检测适用 于相互反应或结构变化等的定性或定量分析。根据本发明的一优选实施例，根据本发明的 FRET系统在荧光团(A)和(B)距离较短时，使用荧光团(A)和(B)的特异性铽和铕复合物发 红光，从而产生最大的能量转移，而在较长距离时荧光团发黄光。在中间状态下，即，荧光团 间的平均距离，根据本发明的FRET对或FRET探针发光在橙色区域内，更具体的是根据荧光 团间的距离，从红色到黄色发生相应的颜色变化。这也对根据本发明的FRET对作为染料使 用特别有利。鉴于此，在本发明范围内制备的FRET对或FRET探针和FRET系统或FRET复合物 尤其适用于生物化学或分子生物学和细胞生物学领域的应用。在这方面，根据本发明制备 的FRET对特别适用于蛋白质/蛋白质，蛋白质/核酸和核酸/核酸相互作用的测定，生物 分子的构象变化和裂解过程的检测，或生物分子中的构象变化和裂解过程的检测，由于作 为两色分析的具体结构甚至可能对相关项目进行定量分析。根据本发明的FRET系统特别 适用于核酸定量的范围内，例如在实时PCR的范围内。根据第一方面，因此本发明的主题是至少两种不同的用于配置荧光共振能量转移 对(FRET对)的荧光团的应用，在FRET对中存在至少一种作为供体荧光团的第一荧光团(A) 和至少一种作为受体荧光团的第二荧光团(B)。根据本发明的应用，其特征在于，第一荧光 团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金属复合物为基础配置， 荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。因此本发明的基本原理事实上是，关于FRET对，第一荧光团(A)作为供体，其包括 来自稀土元素组中的中心原子。另外，根据本发明使用的第二荧光团(B)同样包含一种稀 土元素作为中心原子，在这种情况下，该稀土元素与第一荧光团(A)的元素不同。关于第一 荧光团(A)和第二荧光团(B)的稀土元素的选择性应用，规定该组中的不同元素应用于各 自的荧光团，完全出乎意料地产生根据本发明应用范围制备的FRET对关于其发射特性的 优异性能，如窄发射带，长发射或发光持续时间，定量改变发射光谱，作为在两色分析范围 内荧光团(A)和(B)的距离函数，优良的FRET具有短距离的荧光团，该荧光团具有供体信号 的最佳猝灭。在本发明的范围内，已证明如果第一荧光团(A)和第二荧光团(B)以下种方式选 择，即从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移在激发能量的影响和/或作用和/或 应用下发生是极其有利的，特别是从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移至少以 一种实质上非辐射方式发生。这种类型的能量转移发生，特别是，在FRET意义下，荧光团间 具有短距离。随着距离增加，FRET减弱。关于激发能量，可使用具有特定波长的电磁辐射， 该波长是供体优化或导向的。这对于本领域技术人员本身是已知的。可能发生从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移，例如，通过偶极/偶极 相互作用。能量转移的存在可尤其通过荧光团(A)或供体荧光团的荧光减弱和/或第二荧 光团(B)或受体荧光团的荧光增强检测。荧光显微镜，荧光计等是检测和测量单元的非限制性例子。从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移因此可能取决于荧光团(A)和(B) 间的距离。在这方面，能量转移，尤其是能量转移的强度和/或效率，可能随着荧光团(A)和(B)空间间距的减小而增加。换言之，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)间距的增加导致能 量转移的减弱，伴随着发射光谱的改变。例如，这种类型的荧光团(A)和(B)间距的改变可 能发生在相互反应或相互作用，或FRET对与靶分子或靶结构的连接的范围内，这种相互反 应或相互作用，或FRET对与靶分子或靶结构的连接引起距离改变，特别是增加两个荧光团 (A)和(B)间的距离。具体结果可从发射光谱的变化中看出，随着间距增加供体信号增强和 /或受体信号减弱。如果距离减小，作为受体猝灭效应的结果是供体信号相应地减弱且受体 信号增强。在这点上，从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移因此能够导致第一荧 光团(A)的荧光的减弱和第二荧光团(B)的荧光的增强。根据本发明，荧光团(A)和荧光团(B)具有至少基本上平行的偏振电子平面是有 利的，其在荧光团(A)固定于一边且荧光团(B)固定于另一边时(例如固定于相同蛋白质上) 尤其重要。在与蛋白质相互作用的范围内伴随着荧光团(A)和(B)相对于彼此位置变化的 FRET信号的变化或蛋白质本身的构象变化，因此能够解释偏振平面的变化及两个荧光团相 对于彼此的位置变化。前面已经解释，荧光团(A)和荧光团(B)应该只间隔很短的距离，以产生能量转 移，尤其是荧光共振能量转移，间距一般测量为几个纳米。这是因为FRET信号的强度与荧 光团间距离的六次方成反比。在这点上，能量转移的效率取决于荧光团对的“转移半径”。 荧光团(A)和荧光团(B)之间短距离的标准使根据本发明的应用范围制备的FRET对，在 一定程度上，可能充当“光学纳米尺度”，因此适用于，例如，在分子生物学或生物化学方法 的范围内荧光团间间距的定性和定量检测，以得出关于根本的主要的项目的定性和定量结 论，如与靶分子或靶结构的相互作用和构象变化。关于能量转移，特别是荧光共振能量转移，特别是荧光团(A)和(B)间距较短时， 也可能第一荧光团(A)的状态与第二荧光团(B)的状态重叠，或至少部分重叠。此外，第一荧光团(A)和/或第二荧光团(B)，相互独立，每一个都应该包括一种染 料，尤其是荧光染料。在本发明的范围内，对于相互独立的第一荧光团(A)和/或第二荧光团(B)，每个 包括至少一个核心，优选为一个由一种稀土元素组成形成的核心是有利的。特别优选的是， 相互独立的第一荧光团(A)和/或第二荧光团(B)，以配合物或配位化合物或螯合物形式存 在，其中心原子由稀土元素组成。在本发明的范围内，特别优选的是，(如果使用多核配合 物)基于相同稀土元素的核心用于复合物中，从而用于荧光团中。如果稀土元素从钪、钇、镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥组中 选择，根据本发明的应用范围制备的FRET对的上述性质可达到极好的效果。在本发明的范围内，特别可能从镧系元素中提供稀土元素，尤其是选自由铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥组成的组中。镧系元素是银色的，有光泽的，相对较软的，当暴露在空气中迅速氧化且变为无光 泽的活性金属。在水中，它们或多或少地与释放的氢气快速反应。镧系元素是元素周期表 中来自于第六周期的14个元素的总和，也被看作第三副族的一个亚类。由于价电子层相似 的结构，镧系元素在化学上以与元素周期表第三组中的元素，即钪和钇相同的方式作用。镧 系元素与它们一起构成了稀土元素组。
如果稀土元素从铕和铽组中选择，在本发明范围内制备的FRET对获得极好的效果。在这方面，申请人完全出乎意料地发现，如果荧光团(A)含有铽作为稀土金属，特 别是以铽(III)的形式，FRET对能具有优异特性。在这点上，也同样证明，如果荧光团(B)含有铕作为稀土金属，特别是以铕(III) 的形式，是极其有利的。因此，在本发明范围内极其优选的是，根据本发明使用范围制备的FRET对包括一 荧光团(A)和一荧光团(B)，荧光团(A)含有铽作为稀土金属，特别是以铽(III)的形式，且 荧光团(B)含有铕作为稀土金属，特别是以铕(III)的形式存在。这种类型的FRET对在能 量转移的猝灭中具有优异特性，尤其是荧光共振能量转移，荧光团(A)和(B)间距较短，具 有窄发射带的限定发射行为和延长的发射时间，以这种方式，基于铽和铕的FRET在一定程 度上适用于生物化学和分子生物学领域的分析应用。根据本发明应用范围制备的FRET对的荧光团的配置，优选为，荧光团(A)和(B)每 个都与稀土元素结合，特别是至少与一个配体结合，特别是络合剂和/或螯合剂，特别是多 个配体，优选为四配体，和/或相互独立的荧光团(A)和(B)中的稀土元素以离子键，配位键 和/或共价键，特别是共价键，连接到至少一个配体，尤其是多个配体，优选为四配体。在这点上，配体尤其是络合剂和/或螯合剂，应该以多齿方式，尤其是双齿方式形 成。在这方面，该配体可与基于一种稀土金属的核心或中心原子采取多元化的配位键，离子 键或共价键方式连接。原则上，在本发明范围内，荧光团(A)和(B)可能使用相同或不同的 配体。该相同或不同的配体还可用于各自的荧光团(A)或(B)本身。根据本发明的一优选实施例，配体特别是络合剂和/或螯合剂，是甲基吡啶酸、吡 啶甲酸和/或其衍生物，尤其是取代型衍生物，优选为羟基衍生物。为了使荧光团与至少一个其他分子或有机基间的结合键存在，配体，尤其是络合 剂和/或螯合剂，尤其是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，应该包括特别的取代基和/ 或官能团更好地与优选有机分子共价结合和/或耦合。在这方面，该取代基和/或官能团 应该选自氨基、羧酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和羟基。对于其他分子或至 少一个有机基的“连接点”因此由各自的荧光团(A)或(B)提供。例如，如下所述，有机分子 可能是一与靶分子或靶结构互补或相互作用的单元。根据一特别的优选实施例，取代基或官能团应该是羟基。此外，在本发明的范围内，配体，尤其是络合剂和/或螯合剂是羟基甲基吡啶酸和 /或羟基吡啶甲酸是极其有利的。在这方面，至少一个配体应该由上述化合物形成，尤其是 优选有机分子与荧光团(A)和/或(B)间的共价键或耦合存在时。此外，在本发明的范围内，荧光团(A)尤其优选为根据图5所示的有机金属配合 物。另外，根据本发明提供的荧光团(A)可从以下组中选择四(4-羟基吡啶-2-羧酸) 铽(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III)、二 (吡啶-2 -羧酸)-二 (4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III)、(吡啶-2 -羧酸)-三(4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III) 和/或其衍生物。关于用于荧光团(A)的化合物，相应的盐类，尤其是钠盐，也可被特殊应用。
另外，荧光团(A)可以是一通式为[Tbx (Pic)y (Pic-Y) J (4_3!￡)_的化合物，在这个通 式中，
Tb 是铽(III)， Pic是吡啶，
Y是一个官能团，特别地选自氨基、羧酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和羟 基，优选为羟基，
χ是1到4的整数，特别为1或2，优选为1，且 y和ζ都是0到4的整数，其中y+z=4。关于荧光团(B)，其可为根据图4所示的有机金属配合物。在这点上，根据本发明，荧光团(A)尤其优选为根据图5所示的有机金属配合物， 且荧光团(B)尤其优选为根据图4所示的有机金属配合物。此外，荧光团(B)可从以下组中选择四(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)、三(吡 啶-2 -羧酸)-(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)、二 (吡啶-2 -羧酸)-二(4-羟基吡 啶-2-羧酸)铕(III)、(吡啶-2 -羧酸)_三(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)和/或其衍 生物。关于有关荧光团(B)的化合物，例如相应的盐类，尤其是钠盐，也可被应用。关于荧光团(B)，可提供通式为[Eux，(Pic’)y，(Pic’ -Y’)z，] (4_3x’)_的化合物，在这 个通式中，
Eu 是铕(III)， Pic’是吡啶，
Y’是一个官能团，特别地选自氨基、羧酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和 羟基，优选为羟基，
χ’是1到4的整数，尤其为1或2，优选为1，且 y’和ζ’都是0到4的整数，f +ζ’ =4。例如，FRET对或FRET探针的荧光团(A)和荧光团(B)可通过荧光团与一个分子耦 合或连接而配置，尤其是与一个生物分子耦合或连接，例如蛋白质或其类似物，发生荧光共 振能量转移，如前所述，产生短的空间距离，且随着荧光团(A)和荧光团(B)间距的增加发 射光谱改变，并减少能量转移，这可用作例如分子构象变化的尺度或指标。同样并特别地作为FRET对或FRET探针的配置，在本发明的范围内，荧光团(A)和 荧光团(B)可能通过特别的二价和/或双键有机基，尤其是连接子和/或间隔子相互耦合 和/或连接。在这点上，由此产生一分子或分子复合物，其包括荧光团(A)和荧光团(B)及其自 由基。有机基的目的性选择和特定荧光团(A)和(B)的调整可优化或调整FRET对或FRET 探针，因为荧光团(A)和(B)间距较短，在供体信号最大限度猝灭时发生最优的荧光共振能 量转移，随着间距增加，获得具有窄带和较长发射持续时间的发射光谱的清晰可辨的变化。在本发明范围内，有机基应该以这样一种方式选择，即荧光共振能量转移发生在 荧光团(A)和荧光团(B)之间。这尤其适用于当荧光团(A)和(B)间距短时，例如靶分子或 靶结构没有相互反应时。因此，荧光共振能量转移能通过间距的目标性选择而被校正或调 整，小间距，特别是具有短链的分子，导致荧光团(A)和(B)间的短间距，伴随着高荧光共振能量转移。然而，长自由基或间隔子也可能导致(A)和(B)间的短间距，例如通过折叠和/ 或连接或杂交过程，其可以分子信标为例。由于有机基引起的荧光团(A)和(B)之间间距的分别调整，因此发射光谱可被特 定地调整，特别是有特定波长或发射带的发射光谱也由FRET产生，其在生产范围内或染料 应用中相当重要，因为颜色属性可根据荧光团(A)和(B)之间间距的选择性调整而被各自调整。总的来说，荧光团(A)和(B)的间距和荧光共振能量转移及FRET对的发射波长因 此可通过有机基的长度，或结构，空间排列或结构而被调整。有机基可能通过这样一种方式 与荧光团连接或耦合，例如，有机基可与络合剂和/或配体的各自的取代基和/或各自的官 能团相结合，尤其是如上所述的方式。在本发明范围内，优选为有机基与荧光团(A)和/或荧光团(B)共价结合，尤其是 有机基优选地与荧光团(A)和/或(B)的配体的官能团共价连接和/或耦合，和/或包含官 能团的有机基能够与配体的官能团结合和/或耦合，优选为共价结合和/或耦合。有机基特别以这样一种方式与官能团连接或耦合，即相互独立的荧光团(A)和 (B),与有机基结合或耦合，优选为末端结合或耦合，因此，在一定程度上，与各自的有机基 末端结合或耦合。在这方面，有机基可与荧光团(A)和/或荧光团(B)共价连接，例如，末端聚氨酯基 团的形成，尤其与有机基相关。根据本发明，同样可能提供相互独立的荧光团，每个包括一有机基，例如，根据本 发明范围内制备的FRET对用作杂交探针的一 FRET探针的例子中。在这种情况下，有机基 可能是，例如一寡核苷酸。优选地，有机基与荧光团(A)和(B)末端结合或耦合是存在的，例 如，如果根据本发明的应用制备的FRET对提供为或用作杂交探针的一 FRET探针。一般情况下，关于有机基，其可能是以一能够与靶分子和/或靶结构相互反应的 自由基。该有机基可能是这样的，其是一能与靶分子和/或靶结构相互作用的自由基。在本发明范围内，可能提供有机基与靶分子和/或靶结构的相互作用和/或相互 反应以引起变化，尤其是荧光团(A)到荧光团(B)的荧光共振能量转移的减少。这可能尤其这样完成，由于相互作用或相互反应，第一荧光团(A)和第二荧光团 (B)的间距增加，以这种方式，荧光团间的能量转移减少且发射行为因此改变。因此，可通过 样品发射光谱的确定(变化)检测相互作用或相互反应。例如，有机基可能是，或可能包括一核苷酸序列，特别是一 DNA或RNA序列，优选为
一寡核苷酸。例如，实施例可能是这样的，根据本发明应用范围制备的FRET对用作杂交探针、 水解探针和/或分子信标。特别是根据本发明制备的FRET对用作分子信标时，它可能由核苷酸序列提供，优 选包括5’端和3’端互补的核苷酸序列部分，优选以这样一种方式，即在核苷酸序列与靶分 子和/或靶结构不发生相互反应时，存在互补核苷酸序列的杂交。在一定程度上，核苷酸序 列末端的自杂交的发生是上述结构的核苷酸序列的互补末端部分的结果，该结构是分子信 标的特征，以茎环的形式存在。在这种状态下，荧光团(A)由于与荧光团(B)的距离很短，其 不显示荧光或荧光较弱。如果环状区域与作为靶分子或靶结构的互补DNA序列相结合，例如在PCR循环中，荧光团(A)与荧光团(B)的距离增加，在这种情况下，荧光或由减弱的荧光 共振能量转移引起的荧光的变化产生了荧光团(A)，且这可由本领域技术人员通过已知的 仪器或方法观察或检测，发射光谱的变化伴随着供体荧光的增加和受体荧光的减少。如上所述，根据本发明的应用制备的FRET对可能是，例如，一分子信标(MB)。在这 点上，荧光团(A)和荧光团(B)优选通过共价键与具有互补核苷酸序列部分的核苷酸序列 相连接构成了分子信标(MB)，优选在5’端和3’端。同样，在本发明范围内，有机基还可能是或包括肽和/或氨基酸序列，特别是寡 肽。在这种情况下，它可能是，例如，酶或定向于各自的靶结构或靶分子的确定的氨基 酸。此外，它还可能是肽或已确定空间结构的氨基酸序列。此外，在本发明的范围内，有机基还可能被提供为或包括饱和或不饱和烃基，优选 不饱和的支链或直链烃基。在这方面，优选有利的是烃基的链长度含有至少2个碳原子，尤其是2-20个碳原 子，优选为2-15个碳原子，更优选为2-12个碳原子。如上所述，在这种情况下，烃基的长度应该根据能量转移而选择，尤其是发生在荧 光团(A)和荧光团(B)之间的荧光共振能量转移。根据本发明一特别优选的实施例，荧光团(A)和荧光团(B)与一有机基，一起构成 了根据图3所示的通式的复合物，其中在这个通式中，η是从1到20的整数，尤其是2到15， 优选为2到12。根据图3到5所示的通式，荧光团(A)由带有4个羟基吡啶甲酸的铽复合物构成， 荧光团(B)由带有4个羟基吡啶甲酸的铕复合物构成。荧光团通过烃基末端的氨基甲酸乙 酯键互相连接。有机基还可能是包括核苷酸序列和/或氨基酸序列和/或烃基的混合分子。


将参考附图，以实施例的方式进一步说明本发明，尽管本发明不局限于此，其中 图1示出了根据本发明的FRET复合物或FRET系统，其包括作为供体荧光团的铽复合
物(Tb)和作为受体荧光的铕复合物(Eu)。这两个荧光团通过有机基(间隔子或连接子) 相互连接，在这种情况下，所述有机基优选可能是在其两端包括互补杂交核苷酸的核苷酸 序列。该核苷酸序列的非杂交部分形成了一环状区域。图1所示的复合物优选代表一目前 为闭合状态的分子信标(ΜΒ)，在这种情况下，从铽复合物到铕复合物的特别的非辐射能量 转移(ET)发生于激发能量的辐射并伴随着通过铕复合物的特异性发射。图2示出了图3所示的根据本发明的FRET复合物或FRET系统的光谱。作为从铽 复合物到铕复合物的有效能量转移的结果，通过铽复合物发射的能量显著减少或只有很少 的发射。图3示出了根据本发明的基于铽复合物作为荧光团(A)和铕复合物作为荧光团 (B)的FRET复合物或FRET系统，复合物通过氨基甲酸乙酯键由直链烃基形式的有机基连 接。图4示出了在本发明范围内用作荧光团(B)的铕复合物，并且其包括4个羟基吡啶甲酸作为配体。图5示出了在本发明范围内用作荧光团(A)的铽复合物，并且其包括4个羟基吡 啶甲酸作为配体。本发明还涉及(根据第二方面)一荧光共振能量转移复合物(FRET复合物)，其包 括至少一个作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一个作为受体荧光团的第二荧光团 (B)，荧光团(A)和荧光团(B)通过特别的二价和/或双键有机基，尤其是连接子和/或间 隔子相互耦合和/或连接。根据本发明的FRET复合物的特征在于，第一荧光团(A)和第二 荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金属复合物为基础配置，荧光团(A)和 (B)包括彼此不同的稀土元素。根据本发明一优选实施例，根据本发明的FRET复合物可对应于通式 DF-S-AF
其中，在这个通式中，
DF是一供体荧光团，优选为荧光团(A)，
AF为一受体荧光团，优选为荧光团(B)，
S是一特别的二价和/或双键有机基，优选是连接子和/或间隔子。关于根据本发明的FRET复合物的进一步结构，可参考上述本发明的应用的相关 结构，这些结构同样适用于根据本发明的FRET复合物。例如，关于分析方法，根据本发明的FRET复合物可以例如杂交探针、水解探针或 分子信标的形式配置。而且，本发明还涉及(根据第^方面)荧光共振能量转移系统(FRET系统)，其包 括至少一个作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一个作为受体荧光团的第二荧光团 (B)0根据本发明的FRET系统，其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每 个都以一种稀土元素的有机金属复合物为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀 土元素。根据本发明的这个方面，FRET系统可以例如各自的复合物DF，-M和AF’ _M’的形 式存在，DF'是一供体荧光团，优选荧光团(A)，AF'是一受体荧光团，优选荧光团(B)，M和 M，相互独立，其是有机基，各自的自由基M和M’与供体荧光团或受体荧光团相结合，优选共 价结合。根据本发明的这个实施例，荧光团(A)和荧光团(B)每个都包括一适用的有机基， 例如，其适用于与靶结构或靶分子(例如核苷酸序列或氨基酸序列)的相互作用和/或相互 反应和/或结合。在这点上，可参考上述有机基的定义。根据本发明的这个实施例，根据本 发明的FRET系统可以是，例如杂交探针。根据本发明的这个方面，因此可能提供为荧光团(A)和荧光团(B)相互独立，每个 含有一有机基，特别是如上所定义的。可选地，还可能提供荧光团(A)和荧光团(B)通过特别的二价和/或双键有机基， 尤其是连接子和/或间隔子相互耦合和/或连接，特别是其如上所定义的。例如，根据这个实施例，相应地，可包含分子信标。总地来说，根据本发明的FRET复合物或FRET系统可以是如上所述的杂交探针、水 解探针和分子信标。在这方面，根据本发明的FRET复合物或FRET系统的能量转移性质或参数可由荧光团(A)和(B)及有机基的特异性选择而调整。因此，调整后的能量转移性质可 用于校准杂交核苷酸分子的分子间距离或间隔，尤其是以分子信标的形式，各自的末端配 置有特异性荧光团(A)和(B)，从而寡核苷酸形式的有机基作为间隔子或连接子。使用合适 的靶序列或靶结构的生化感应打开环状闭合核苷酸序列，以这种方式，当环的末端分开或 分离时，产生了由改进的能量转移引起的改进的发射反应。尤其是，根据本发明的FRET复合物或FRET系统包括清晰可辨的发射光谱，发射 持续时间在被合并信号激发后的毫秒范围内，因此与非特异性自发荧光的其他区别是可能 的。这两个因素使免除分析测量信号的复杂的激光和评估系统成为可能。此外，荧光团间 的小间距提供最佳猝灭，其进一步提高了信号质量。此外，根据本发明的FRET复合物或FRET系统，可在相应地用作生物传感器的范围 内进行一特异性并有意义的实时检测，例如在靶核酸扩增时，降低检测阈值，特别是在小巧 简单的温度循环器中进行实时PCR。根据本发明的FRET复合物或FRET系统的使用不局限于核酸耦合。因此，根据本 发明的FRET复合物或FRET系统还可以蛋白质的形式存在，作为连接荧光团(A)和(B)的 有机基，在蛋白质裂解或其他由于构象变化的示例中，例如与配体结合的示例中，因为荧光 团(A)和(B)的空间间距的变化而产生发射光谱的变化。在这种情况下，供体荧光及荧光团 (A)的发射荧光也可被确定。因此，根据本发明的FRET复合物或FRET系统也可用于蛋白质 或肽分析。此外，根据本发明的FRET复合物或FRET系统也可用于等温扩增方法，如依赖核酸 序列的扩增(NASBA)。根据本发明的FRET复合物或FRET系统还可用于阵列技术。此外，根 据本发明的FRET复合物或FRET系统可与固体基质结合或连接，例如用于生物芯片或生物 传感器。此外，同样可以考虑将根据本发明的FRET复合物或FRET系统以适配体的形式应 用。总之，根据本发明的FRET复合物或FRET系统可广泛应用于医学、分子生物学和生物化 学分析及诊断领域。对于与本发明第三方面有关的实施例，可参考上述关于本发明第一和第二方面的 实施例，其可被相应地应用。本发明的另一个主题(根据第四方面)是根据本发明上述的FRET复合物或FRET系 统用于样品中的项目检测的应用。在本发明的范围内使用的术语“项目”，可被解释为多种含义。例如，该项目可能是 FRET复合物或FRET系统及DNA序列或RNA序列或寡核苷酸之间的相互作用和/或反应和 /或杂交，例如在核酸检测的范围内。在这种情况下，根据本发明的FRET复合物或FRET系 统的有机基优选地包括或由核苷酸序列组成。相似地，该术语“项目”还包括根据本发明的 FRET复合物或FRET系统与(多)肽或酶的相互作用和/或相互反应和/或结合。相似地，该 项目也可是肽的裂解或肽与配体的连接。在这种情况下，根据本发明的FRET复合物或FRET 系统的有机基应该优选为或包括氨基酸序列或寡肽或多肽。相似地，该项目也可是结构变 化，例如蛋白质或类似物的构型或构象变化。因此，一般地，在一定程度上，该项目是测试样 品的活性，其尤其导致了荧光团(A)与荧光团(B)相对彼此间的空间排列或间距的变化，特 别是，由于这种变化，可优选地鉴别检测改变的测量信号，尤其是，FRET复合物或FRET系统 的发射光谱发生变化，可将这种变化追溯到作为供体的荧光团(A)的信号增强和受体荧光的信号减弱，是由荧光团(A)与(B)的空间间距的增加及荧光共振能量转移的减少引起的。根据本发明这个方面的应用，当该项目发生和/或作为该项目的结果，FRET复合 物和/或FRET系统从而可改变其自身的发射光谱，尤其是在激发能量的影响和/或作用和 /或应用下。此外，当该项目发生和/或作为该项目的结果，FRET复合物和/或FRET系统 可发出可检测的信号，尤其是在激发能量的影响和/或作用和/或应用下。根据本发明，荧光团(A)与(B)的相对排列可由于该项目被改变，尤其是以这样的 方式，即FRET复合物和/或FRET系统的发射光谱被改变和/或发出可检测的信号。根据本发明，相对于该项目改变发射光谱和/或暂时延迟检测信号，和/或在该项 目发生后改变发射光谱和/或产生可检测的信号。此外，发射光谱的改变和/或可检测的信号可由时间分辨荧光测量确定。在这方 面，可以区别与自发荧光的发射光谱的改变或可检测的信号。在这点上，有利于将FRET复合物和/或FRET系统的可检测的信号相比较于自发 荧光延长2倍，尤其是延长5倍，特别是延长10倍，优选地延长100倍。最后，如上所述，该项目可能是FRET复合物和/或FRET系统与靶分子和/或靶结 构，尤其是核苷酸序列，优选为DNA或RNA序列，或肽和/或氨基酸序列的相互反应和/或 相互作用和/或杂交。此外，该项目可以是空间变化，尤其是FRET复合物和/或FRET系统 的构型和/或构象变化。本发明的另一个主题(根据第五方面)是根据本发明上述的FRET复合物或FRET系 统用于与靶分子和/或靶结构的相互作用及靶分子和/或靶结构的检测和/或识别和/或 测定，尤其通过是FRET复合物和/或FRET系统与靶分子和/或靶结构的相互作用。因此，靶分子或靶结构可以是核苷酸序列，优选为DNA或RNA序列，(多)肽和/或 氨基酸序列，尤其是酶或抗体。相似地，在本发明的范围内还可检测或识别基于根据本发明的FRET复合物或 FRET系统的病毒和微生物(尤其是细菌)。在这点上，相应的根据本发明的FRET复合物或 FRET系统的有机基应该以这种方式配置，以使可能存在病毒、微生物(尤其是细菌)，抗体及 类似物与前述的生物系统的特异性靶结构的相互作用。例如，根据本发明的FRET复合物或FRET系统用作或实施于微生物的识别或量化， 尤其是食品中的微生物的识别或量化，例如第一次发生的微生物富集。通过非限制性示例， 还可能发生的是存在包被有配体的载体，所述配体对待识别或待定量的微生物具有特异 性。此外，还可能通过抗体包被的微粒发生富集。在可选的裂解和纯化后，相应的靶核酸可 使用根据本发明的FRET复合物或FRET探针扩增。本发明同样包括识别或检测样品环境中靶寡核苷酸的方法，其包括以下步骤首 先使用根据本发明的FRET复合物或FRET系统培养靶核酸，随后培养物形成放射物并且检 测荧光发射，优选通过时间分辨荧光测量检测。在这点上，例如，实时PCR可用于靶核酸的 扩增。同样地，在这方面，靶核酸或根据本发明的FRET复合物或FRET系统能够作为FRET 探针与载体相结合。最后，本发明涉及(根据第六方面)根据本发明上述的FRET复合物或FRET系统用 作染料的用途，尤其是荧光染料，特别是用于标记的目的。由于伴随着基于稀土金属的特殊荧光的特殊结构的结果，荧光团能以特殊的方式产生特定颜色，作为荧光团选择和荧光团之间间距的调整的结果，以这种方式根据本发明 的FRET复合物或FRET系统也特别适合用作染料。关于染料，作为精确且窄的发射光谱的结果，特定的颜色可能在窄谱内。总的来说，本发明利用铽复合物和铕复合物之间的能量转移或荧光共振能力转移 的基本原理可作为研究结构，调节发射及改善生物传感器或染料复合物的性质的有价值的 方法。这是本发明的一明显优势。此外，本发明涉及(根据第七方面)根据本发明上述的FRET复合物或FRET系统用 作生物传感器或探针，尤其是FRET探针的用途。最后，本发明涉及(根据第八方面)一荧光共振能力转移对(FRET对)，其包括至少 两个不同的荧光团，在FRET中，至少一个作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一个作 为受体荧光团的第二荧光团(B)，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一 种稀土元素的有机金属复合物为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。对于其他关于本发明第五到第九方面的实施例，可参考上述与本发明其他方面相 关的实施例，其可被相应地应用。在不偏离本发明范围的情况下，通过阅读说明书，本发明的其他形式、变型和变化 对于本领域技术人员是容易辨别并可重现的。将参考下述不限制本发明的实施例对本发明进行解释说明。
具体实施例配体改性
将3-氨基吡啶甲酸或3-羟基吡啶甲酸溶解于蒸馏水中，用相应数量的IM NaOH溶液 中和，结晶出3-氨基吡啶甲酸钠盐或3-羟基吡啶甲酸钠盐。将0. 3222g的3_氨基吡啶甲酸钠盐或3_羟基吡啶甲酸钠盐(2 mmol)于真空下 (2 · 10_2毫巴)110°C下干燥3小时，溶解于大约30mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF)，例如， 0. 162mL六亚甲基二异氰酸酯(HDI或OCN-(CH2)6-CNO),或0. U9mL十二亚甲基二异氰酸酯 (DMDI或OCN-(CH2)12-CNO),向惰性气体中添加(1 mmol)。在惰性气体存在时，于90°C下与 3-羟基吡啶甲酸钠盐反应M小时或70小时。90°C在真空下去除DMF。该产品由NaOOC-C5H4N-NH-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-NH-C5H4N-COONa (n = 6 产品为 HDI且η = 12产品为DMDI)与3-氨基吡啶甲酸钠盐反应，及NaOOC-C5H4N-O-CO-NH-(CH2) n-NH-C0-0-C5H4N-C00Na与3-羟基吡啶甲酸钠盐反应组成。比较配体与单异氰酸酯(苯异氰酸酯或异氰酸丁酯)及丁基异硫代氰酸酯的改性， 在相同的反应中相应地制备2 mmol异氰酸酯试剂。络合物的合成 四吡啶甲酸复合物
将0. 4350g吡啶甲酸钠盐(3mmol)和0. 1600g 3-氨基吡啶甲酸钠盐(或3-羟基吡啶甲 酸钠盐)(Immol)溶解于约30mL的DMSO中并加热(合成只有一种配体类型的复合物，相应 地制备4mmol对应的钠盐)。0. 3664g EuCl3 · 6H20 (或用于混合复合物的0. 3730g TbCl3 6H20 或 0. 18324g EuCl3 · 6H20 及 0. 1865g TbCl3 · 6H20) (lmmol)溶解于少量 DMSO 中 并添加配体溶液。该混合物90°C下反应2小时，然后在真空，相同的温度下蒸馏出DMS0。由此得到的米黄色粉末于四氢呋喃(THF冲煮沸回流1小时，真空80 ° C下过滤干燥1小 时。合成具有改性配体的络合物，相应的制备0.5mmol 二异氰酸酯的改性配体(或 Immol异氰酸酯或异硫氰酸酯的改性配体)，代替Immol 3-氨基吡啶甲酸钠盐。由于DMDI-改性配体的溶解性较差，异氰酸酯被稀土复合物改性将0. 35 mmol复 合物 NaEuxTb (1-x) (Pic) 3 (Pic-Y) (x = O 到 l,Pic =吡啶甲酸且 Pic-Y = 3-氨基吡啶甲 酸或3-羟基吡啶甲酸)于真空(2 · 10-2毫巴)110°C下干燥3小时，溶解于约20mL DMSO 中，并在惰性气体环境下添加0. 094mL DMDI (0.088 mmol)。该反应于氩气存在时90 ° C 下进行M小时(或与3-羟基吡啶甲酸反应70小时)。真空中相同温度下蒸馏出DMS0。该 获得的米黄色粉末于四氢呋喃(THF)中煮沸回流1小时，真空80°C下过滤干燥1小时。三吡啶甲酸复合物
将0. ^OOg吡啶甲酸钠盐(2mmol)和0. 1600g 3-氨基吡啶甲酸钠盐(或3-羟基吡啶 甲酸钠盐)(Immol)溶解于约30mL DMSO中并加热(合成只有一种配体类型的复合物，相应 地制备3mmol对应的钠盐)。0. 3664g EuCl3 · 6H20 (或用于混合复合物的0. 3730g TbCl3 6H20 或 0.1832g EuCl3 · 6H20 及 0. 1865g TbCl3 · 6H20) (lmmol)溶解于少量 DMSO 中并 添加配体溶液。将产生的沉淀过滤，用乙醇清洗并于真空重50°C下干燥1小时。合成改性配体的络合物，相应的制备0. 5mmol 二异氰酸酯的改性配体(或Immol 异氰酸酯或异硫氰酸酯的改性配体)，代替Immol 3-氨基吡啶甲酸钠盐。合成特定改性配体的络合物，例如Eu2[Na00C-C5H4N-0-C0-NH_(CH2) n-NH-C0-0-C5H4N-C00]3，产生的沉淀只在 90-100°C下加热。标记异氰酸酯改性的DNA
将复合物NaEuXTb(1_x) (Pic)3(Pic-Y)(例如χ = O时只标记为绿色发光复合物；χ = 1 时只标记为红色发光复合物；χ = 0. 5时标记为绿色和红色发光复合物；Pic =吡啶甲酸； Pic-Y =3-氨基吡啶甲酸或3-羟基吡啶甲酸)于真空(2 · 10-2毫巴)110°C下干燥3小时， 溶解于DMSO中，并在惰性气体环境下向添加合适量的在干燥的DMSO (摩尔比率Pic-Y: NCO =1:1)中的DNA溶液。该反应于氩气存在时90°C下进行M小时(或与3-羟基吡啶甲酸反 应70小时)。如有必要，在真空中相同温度下蒸馏出DMS0。标记异硫氰酸酯改性的DNA
将复合物NaEuxTb(1_x) (Pic)3(Pic-Y)(例如χ = 0时只标记为绿色发光复合物；χ = 1 时只标记为红色发光复合物；χ = 0. 5时标记为绿色和红色发光复合物；Pic =吡啶甲酸； Pic-Y =3-氨基吡啶甲酸或3-羟基吡啶甲酸)溶解于DMSO中，加入适量的水、DMSO或DMSO/ 水溶液(摩尔比率Pic_Y:NCS = 1:1)的DNA溶液。该反应于氩气存在时90°C下进行24小 时(或与3-羟基吡啶甲酸反应70小时)。如有必要，在真空中相同温度下蒸馏出DMSO或水。
权利要求
1.一种至少两种不同的用于配置荧光共振能量转移对(FRET对)的荧光团的应用，在 FRET对中存在至少一种作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一种作为受体荧光团的 第二荧光团(B)，其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀 土元素的有机金属复合物为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)以下种 方式选择，即从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移在激发能量的影响和/或作用 和/或应用下发生是极其有利的，特别是从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能量转移至 少以一种实质上非辐射方式发生。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，从第一荧光团(A)到第二荧光团(B)的能 量转移取决于荧光团(A)和(B)间的距离，能量转移，尤其是能量转移的强度和/或效率，可 能随着荧光团(A)和(B)空间间距的减小而增加。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，能量转移导致第一荧光团(A)的荧光 的减弱和第二荧光团(B)的荧光的增强。
5.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，第一荧光团(A)的状态与第二 荧光团(B)的状态重叠，或至少部分重叠。
6.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，第一荧光团(A)和/或第二荧光 团(B)，相互独立，每个都应该包括一种染料，尤其是荧光染料。
7.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，相互独立的第一荧光团(A)和/ 或第二荧光团(B)，每个包括至少一个核心，优选为一个由一种稀土元素组成的核心。
8.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，稀土元素选自钪、钇、镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥组成的组中。
9.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，稀土元素是选自镧系元素，尤其 是选自由铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥组成的组中。
10.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，稀土元素选自铕和铽组成的组中。
11.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)含有铽作为稀土金 属，特别是以铽(III)的形式存在。
12.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(B)含有铕作为稀土金 属，特别是以铕(III)的形式存在。
13.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)和(B)每个都与稀 土元素结合，特别是至少与一个配体结合，特别是络合剂和/或螯合剂，特别是多个配体， 优选为四配体，和/或相互独立的荧光团(A)和(B)中的稀土元素以离子键、配位键和/或 共价键，特别是共价键，连接到至少一个配体，尤其是多个配体，优选为四配体。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，配体尤其是络合剂和/或螯合剂，是多 齿配体，尤其是双齿配体。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的应用，其特征在于，配体特别是络合剂和/ 或螯合剂，是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，尤其是取代型衍生物，优选为羟基衍 生物。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的应用，其特征在于，配体，尤其是络合剂和/或螯合剂，尤其是甲基吡啶酸、吡啶甲酸和/或其衍生物，包括特别的取代基和/或官能团 更好地与优选有机分子共价结合和/或耦合，特别是，该取代基和/或官能团选自氨基、羧 酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和羟基。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，取代基或官能团是羟基。
18.根据权利要求13到17中任一项所述的应用，其特征在于，配体，尤其是络合剂和/ 或螯合剂是羟基甲基吡啶酸和/或羟基吡啶甲酸。
19.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)为根据图5的式中 的有机金属配合物。
20.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)可从以下组中选 择四(4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羟基吡啶-2-羧酸)铽 (III)、二 (吡啶-2 -羧酸)_ 二(4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III)、(批啶-2 -羧酸)-三 (4-羟基吡啶-2-羧酸)铽(III)和/或其衍生物。
21.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)是一通式为 [Tbx (Pic)y (Pic-Y) J (4_3x)-的化合物，其中，在这个通式中，Tb 是铽(III)， Pic是吡啶，Y是一个官能团，特别地选自氨基、羧酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和羟 基，优选为羟基，χ是1到4的整数，特别为1或2，优选为1，且 y和ζ都是0到4的整数，其中y+z=4。
22.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(B)，是根据图4的式中 的有机金属配合物。
23.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(B)可从以下组中选 择四(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)、三(吡啶-2 -羧酸)-(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕 (III)、二(吡啶-2 -羧酸)_ 二(4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)、(卩比啶-2 -羧酸)-三 (4-羟基吡啶-2-羧酸)铕(III)和/或其衍生物。
24.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(B)，是一通式为 [Eux, (Pic，)y，(Pic，-Y’)z，] (4_3x’)_的化合物，其中，在这个通式中，Eu 是铕(III)， Pic’是吡啶，Y’是一个官能团，特别地选自氨基、羧酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧树脂、巯基和 羟基，优选为羟基，χ’是1到4的整数，尤其为1或2，优选为1，且 y’和ζ’都是0到4的整数，其中，y’ +ζ’ =4。
25.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)和荧光团(B)通过 特别的二价和/或双键有机基，尤其是连接子和/或间隔子相互耦合和/或连接。
26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，有机基应该以这样一种方式选择，以使 荧光共振能量转移发生在荧光团(A)和荧光团(B)之间。
27.根据权利要求25或26中任一项所述的应用，其特征在于，有机基与各自的配体的取代基和/或各自的官能团相耦合和/或结合，尤其是如前述权利要求所限定的络合 剂和/或螯合剂。
28.根据权利要求25到27中任一项所述的应用，其特征在于，优选有机基与荧光团 (A)和/或荧光团(B)共价结合，特别是有机基优选地与荧光团(A)和/或(B)的配体的官 能团共价连接和/或耦合，和/或特别地有机基包含能够与配体的官能团结合和/或耦合 的官能团，优选为共价结合和/或耦合。
29.根据权利要求25到洲中任一项所述的应用，其特征在于，有机基与荧光团(A) 和/或荧光团(B)通过(聚)尿烷基的形成而共价连接。
30.根据权利要求25到四中任一项所述的应用，其特征在于，有机基是一能够与靶分 子和/或靶结构相互反应的自由基，和/或该有机基是能与靶分子和/或靶结构相互作用 的自由基。
31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，有机基与靶分子和/或靶结构之间的相 互作用或相互反应，导致从荧光团(A)到荧光团(B)的荧光共振能量转移的改变，特别是减 少。
32.根据权利要求25到31中任一项所述的应用，其特征在于，有机基是，或包括一核苷 酸序列，特别是一 DNA或RNA序列，优选为一寡核苷酸。
33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，核苷酸序列，尤其是在5’端和3’端包 括互补的核苷酸序列部分，优选以这样一种方式，即在核苷酸序列部分与靶分子和/或靶 结构不发生相互反应时，存在互补核苷酸序列部分的杂交。
34.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)和荧光团(B)优选 通过共价键与具有互补核苷酸序列部分的核苷酸序列相连接构成了分子信标(MB)，优选在 5’端和3’端。
35.根据权利要求25到31中任一项所述的应用，其特征在于，有机基是或包括肽和/ 或氨基酸，特别是寡肽。
36.根据权利要求25到31中任一项所述的应用，其特征在于，有机基是饱和或不饱和 烃基，优选不饱和的支链或直链烃基。
37.根据权利要求36的应用，其特征在于，烃基的链长度含有至少2个碳原子，尤其是 2-20个碳原子，优选为2-15个碳原子，更优选为2-12个碳原子。
38.根据在前任一项权利要求所述的应用，其特征在于，荧光团(A)和荧光团(B)与一 有机基，一起构成了根据图3所示的通式的复合物，在这个通式中，η是从1到20的整数， 尤其是2到15，优选为2到12。
39.一荧光共振能量转移复合物(FRET复合物)，其包括至少一个作为供体荧光团的第 一荧光团(A)和至少一个作为受体荧光团的第二荧光团(B)，荧光团(A)和荧光团(B)通过 特别的二价和/或双键有机基，尤其是连接子和/或间隔子相互耦合和/或连接，其特征在 于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金属复合物 为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
40.根据权利要求39所述的荧光共振能量转移复合物，其特征在于，FRET复合物对应 于通式DF-S-AF其中，在这个通式中，DF是一供体荧光团，优选为荧光团(A)，AF为一受体荧光团，优选为荧光团(B)，S是一特别的二价和/或双键有机基，优选是连接子和/或间隔子。
41.根据权利要求39或40所述的荧光共振能量转移复合物，其特征在于，具有权利要 求1-39的特征部分中的一个或更多特征。
42.一荧光共振能量转移系统(FRET系统)，其包括至少一个作为供体荧光团的第一荧 光团(A)和至少一个作为受体荧光团的第二荧光团(B)，根据本发明的FRET系统，其特征在 于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金属复合物 为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
43.根据权利要求42所述的荧光共振能量转移系统，其特征在于，荧光团(A)和荧光团 (B)彼此独立，每个包括一个有机基，优选如权利要求沈到37中任一项所限定。
44.根据权利要求42或43所述的荧光共振能量转移系统，其特征在于，荧光团(A)和 荧光团(B)通过特别的二价和/或双键有机基，尤其是连接子和/或间隔子相互耦合和/或 连接，特别是如权利要求25到37中任一项所限定。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的荧光共振能量转移系统，其特征在于，具有权 利要求1-38的特征部分中的一个或更多特征。
46.根据权利要求39到41中任一项所述的FRET复合物或根据权利要求42到45中任 一项所述FRET系统用于样品中的项目检测的应用。
47.根据权利要求46所述的应用，其特征在于，FRET复合物的荧光团(A)和荧光团(B) 和/或FRET系统的荧光团(A)和荧光团(B)形成样品中的FRET对。
48.根据权利要求46或47所述的应用，其特征在于，当该项目发生和/或作为该项目 的结果，FRET复合物和/或FRET系统改变其自身的发射光谱，尤其是在激发能量的影响和 /或作用和/或应用下，和/或当该项目发生和/或作为该项目的结果，FRET复合物和/或 FRET系统发出可检测的信号，尤其是在激发能量的影响和/或作用和/或应用下。
49.根据权利要求46到48中任一项所述的应用，其特征在于，荧光团(A)与(B)的相 对排列可由于该项目被改变，尤其是以这样的方式，即FRET复合物和/或FRET系统的发射 光谱被改变，和/或发出可检测的信号。
50.根据权利要求46到49中任一项所述的应用，其特征在于，相对于该项目发射光谱 和/或检测信号的改变被暂时延迟，和/或在该项目发生后改变发射光谱和/或产生可检 测的信号。
51.根据权利要求46到50中任一项所述的应用，其特征在于，发射光谱和/或可检测 的信号的改变可由时间分辨荧光测量确定，特别是，其可以区别发射光谱或可检测的信号 的改变与样品的自发荧光。
52.根据权利要求46到51中任一项所述的应用，其特征在于，FRET复合物和/或FRET 系统的可检测的信号相比较于自发荧光被延长2倍，尤其是延长5倍，特别是延长10倍，优 选地延长100倍。
53.根据权利要求46到52中任一项所述的应用，其特征在于，所述项目是FRET复合物 和/或FRET系统与靶分子和/或靶结构的相互反应和/或相互作用和/或杂交，尤其是核苷酸序列，优选为DNA或RNA序列，或肽和/或氨基酸序列，和/或该项目是空间变化，尤其 是FRET复合物和/或FRET系统的构型和/或构象变化。
54.一种根据权利要求39到41中任一项所述的FRET复合物或根据权利要求42到45 中任一项所述的FRET系统用于与靶分子和/或靶结构的相互作用及靶分子和/或靶结构 的检测和/或识别和/或测定，尤其是FRET复合物和/或FRET系统与靶分子和/或靶结 构的相互作用。
55.根据权利要求M所述的应用，其中，靶分子和/或靶结构是核苷酸序列，优选为 DNA或RNA序列。
56.根据权利要求M所述的应用，其中，靶分子和/或靶结构是(多)肽和/或氨基酸 序列，尤其是酶或抗体。
57.一种根据权利要求39到41中任一项所述的FRET复合物或根据权利要求42到45 中任一项所述的FRET系统用作染料的用途，尤其是荧光染料，特别是用于标记的目的。
58.一种根据权利要求39到41中任一项所述的FRET复合物或根据权利要求42到45 中任一项所述的FRET系统用作生物传感器或探针，尤其是FRET探针的用途。
59.根据权利要求M、57和58所述的应用，其特征在于具有权利要求1到38和46到 53的特征部分中的一个或多个特征。
60.一荧光共振能力转移对(FRET对)，其包括至少两个不同的荧光团，在FRET对中，至 少一个作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一个作为受体荧光团的第二荧光团(B)， 其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金 属复合物为基础配置，荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
全文摘要
本发明涉及一种至少两种不同的用于配置荧光共振能量转移对(FRET对)的荧光团的应用，其中，在FRET对中存在至少一种作为供体荧光团的第一荧光团(A)和至少一种作为受体荧光团的第二荧光团(B)，其特征在于，第一荧光团(A)和第二荧光团(B)相互独立，每个都以一种稀土元素的有机金属复合物为基础配置，其中荧光团(A)和(B)包括彼此不同的稀土元素。
文档编号G01N21/64GK102131893SQ200980133260
公开日2011年7月20日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年6月26日
发明者彼得·克劳斯, 曼弗雷德·里茨 申请人:Inbio 于尔根·布德菲尔德-彼得·克劳斯-曼弗雷德·里茨公司