专利名称：一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种奶油中达氟沙星定性快速检测的方法，特别涉及使用萃取技术结合达氟沙星金标试纸条的检测方法。
背景技术：
达氟沙星作用机制为抑制细菌的DNA旋转酶(desoxyribonucleic acid gyrase)， 从而影响DNA的正常形态与功能，阻碍DNA的正常复制、转录、转运与重组，从而产生快速杀菌作用，长期以来一直被广泛使用。但食品质量安全中，抗生素滥用一直是一个关注的焦点ο目前，有多种检测达氟沙星的方法，例如液相质谱法、酶联免疫法、试纸条法，其中试纸条法检测成本最低、操作最简单且检测时间最短，但是目前只有液相质谱法和酶联免疫法可以检测奶油，试纸条法由于其本身固有的特性，一直无法进行奶油中达氟沙星检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种奶油中达氟沙星定性快速检测的方法，其简便易行并且适用于规模化初筛达氟沙星超标的奶油。本发明提供了一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法，其包括
(1)使用纯水，或确定不含有达氟沙星或其分解酶的复原乳萃取奶油中的达氟沙星；
(2)使用达氟沙星试纸条检测纯水或复原乳中的达氟沙星含量。在一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法的再一种示意性的实施方式中，步骤 (1)中首先将奶油置于70°c的水浴锅中完全熔融为液体，再将纯水或复原乳添加到熔融为液体的奶油中涡旋混勻得到混合液，将混合液放入冷冻离心机离心得到萃取清液。在一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法的另一种示意性的实施方式中，涡旋混勻的时间为5秒，涡旋速度为2500转/分。冷冻离心机的操作条件为5000g，离心6分钟， 离心温度4°C。吸取IOOuL的萃取清液用于测试。在一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法的又一种示意性的实施方式中，复原乳中奶粉和纯水的体积比为1:7。使用一种奶油中达氟沙星定性快速检测的方法，操作简单，检测时间短，成本低， 适合于企业大规模使用。
具体实施例方式一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法，其包括
(1)使用纯水，或确定不含有达氟沙星或其分解酶的复原乳萃取奶油中的达氟沙星；
(2)使用达氟沙星试纸条检测纯水或复原乳中的达氟沙星含量。使用纯水萃取奶油中达氟沙星
由于达氟沙星的水溶性好于脂溶性，且达氟沙星是为数不多的热稳定性抗生素，因此决定使用70°C纯水从奶油中抽提达氟沙星，具体步骤如下
A.分别吸取0.5mL奶油的样品到1. 5mL离心管中，同时加入0. 5mL70°C纯水；
B.涡旋混勻5秒，涡旋转速2500转/分，再放入70°C水浴锅中，让离心管中实验样品始终保持在70°C左右；
C.在5分钟内，重复B操作3-5次，使纯水与熔融的奶油充分混勻得到混合液，并让 70°C纯水将达氟沙星从奶油中充分抽提出来；
D.放入冷冻离心机，5000g，6分钟，4°C离心；
E.去除上层奶油，得到萃取清液，吸取萃取清液IOOyL进行实验。使用达氟沙星金标试纸条检测
吸取IOOul萃取清液和IOOul稀释液加入加样槽中，枪头吹打混均后插入试纸条于加样槽中，加样后室温孵育3分钟时观察结果。结果判断
阴性(-):τ线(测试线，靠近样品溶液的一端)比C线(质控线)深或一样深，表示牛奶样品中达氟沙星浓度低于检测限度(检测限度为50μ g/kg)。阳性(+ ) :T线无显色，表示牛奶中达氟沙星浓度高于检测限度(检测限度为 50 μ g/kg)ο无效未出现C线，表明不正确的操作过程或试剂卡已变质失效。使用复原乳萃取奶油中达氟沙星 1)复原乳的制备
将奶粉和纯水按1-J比例加入，涡旋混勻，得到复原乳。2)复原乳不含达氟沙星及其分解酶的检测
在1. 5mL离心管中加入990 μ L复原乳和10 μ L、10mg/kg浓度达氟沙星标准溶液，涡旋混勻，得到浓度为100yg/kg复原样品。用现有的技术方法，例如酶联免疫法，检测复原样品中达氟沙星的含量。结果判定
如果检测到复原样品中达氟沙星的含量大于100 μ g/kg，说明复原乳中含有达氟沙星， 此种奶粉及其复原乳不可用；
如果检测到复原样品中达氟沙星的含量小于100 μ g/kg，说明复原乳中含有达氟沙星分解酶，此种奶粉及其复原乳不可用；
如果检测到复原样品中达氟沙星的含量等于100 μ g/kg，说明复原乳中不含达氟沙星或达氟沙星分解酶，可以作为萃取奶油中的复原乳使用。3)萃取步骤
A.分别吸取0.5mL奶油的样品到1. 5mL离心管中，同时加入0. 5mL70°C复原乳；
B.涡旋混勻5秒，涡旋转速2500转/分，再放入70°C水浴锅中，让离心管中实验样品始终保持在70°C左右；
C.在5分钟内，重复B操作3-5次，使复原乳与熔融的奶油充分混勻得到混合液，并让 70°C纯水将达氟沙星从奶油中充分抽提出来；
D.放入冷冻离心机，5000g，6分钟，4°C离心；
E.去除上层奶油，得到萃取清液，吸取萃取清液100μ L进行实验。
4)使用达氟沙星金标试纸条检测
吸取IOOul萃取清液和IOOul稀释液加入加样槽中，枪头吹打混均后插入试纸条于加样槽中，加样后室温孵育3分钟时观察结果。5)结果判断
阴性(-):τ线(测试线，靠近样品溶液的一端)比C线(质控线)深或一样深，表示牛奶样品中达氟沙星浓度低于检测限度(检测限度为50μ g/kg)。阳性(+ ) :T线无显色，表示牛奶中达氟沙星浓度高于检测限度(检测限度为 50 μ g/kg)ο无效未出现C线，表明不正确的操作过程或试剂卡已变质失效。检测奶油中达氟沙星灵敏度实验 1)配置达氟沙星标准溶液
称取达氟沙星标准品(纯度0. 999)粉末0. Olg,加入IOmL纯水，配制成1000mg/kg浓度的达氟沙星溶液，依次10倍稀释得到100mg/kg、10mg/kg和lmg/kg浓度达氟沙星标准溶液待用。2)制备梯度待测样品
将确定不含有达氟沙星及其分解酶的奶油置于70°C水浴锅中，完全融化为液体，添加达氟沙星标准溶液到奶油中，制备得到浓度分别为0 μ g/kg、15 μ g/kg、25 μ g/kg、50 μ g/ kg、100 μ g/kg、200 μ g/kg、500 μ g/kg和1000 μ g/kg的待测样品，将上述待测样品涡旋混勻10秒。3)使用纯水和复原乳萃取待测样品中的达氟沙星
各达氟沙星浓度的待测样品的萃取过程与实施例1和实施例2相同，在此不再赘述。4)使用达氟沙星金标试纸条检测及结果判断
各达氟沙星浓度的待测样品使用达氟沙星金标试纸条的检测过程与实施例1和实施例2相同，在此不再赘述。5)检测结果
使用纯水萃取奶油中的达氟沙星，其检出限为50μ g/kg;使用复原乳萃取奶油中的达氟沙星，其检出限为100yg/kg。本领域技术人员可以理解，纯水或复原乳与达氟沙星试纸条的反应特性不同。由于复原乳中含有大量的蛋白质成分且这些蛋白成分会减缓复原乳与达氟沙星试纸条之间的反应，由此导致在规定的检测时间内检出限偏高。采用70°C纯水萃取，奶油中达氟沙星检出限为50 μ g/kg ；采用复原乳萃取，奶油中达氟沙星检出限为100 μ g/kg。中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，奶油中达氟沙星残留限量是100 μ g/kg。因此，以上两种方法都符合国家标准，适合大量初筛奶油中达氟沙星。在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何图示、实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法，其包括(1)使用纯水，或确定不含有达氟沙星或其分解酶的复原乳萃取奶油中的达氟沙星；(2)使用达氟沙星试纸条检测所述纯水或所述复原乳中的达氟沙星含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述步骤(1)中首先将所述奶油置于70°C的水浴锅中完全熔融为液体，再将所述纯水或所述复原乳添加到熔融为液体的所述奶油中涡旋混勻得到混合液，将所述混合液放入冷冻离心机离心得到萃取清液。
3.如权利要求2中所述的检测方法，其中所述涡旋混勻的时间为5秒，涡旋速度为 2500转/分。
4.如权利要求2中所述的检测方法，其中所述冷冻离心机的操作条件为5000g离心6 分钟、离心温度4°C。
5.如权利要求2中所述的检测方法，其中吸取IOOuL的所述萃取清液用于测试。
6.如权利要求1中所述的检测方法，其中所述复原乳中奶粉和纯水的体积比为1:7。
全文摘要
一种奶油中达氟沙星定性快速检测方法，包括(1)使用纯水、或确定不含有达氟沙星或其分解酶的复原乳萃取奶油中的达氟沙星；(2)使用达氟沙星试纸条检测所述纯水或所述复原乳中的达氟沙星含量。使用一种奶油中达氟沙星定性快速检测的方法，操作简单，检测时间短，成本低，适合于企业大规模使用。
文档编号G01N1/34GK102478576SQ201010564298
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘卫星, 刘志楠, 刘晓川, 喻东威, 李梅, 薛志清, 赵源 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司