专利名称：结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，也涉及到传染病分子诊断技术领域，具体涉及3 种结核分枝杆菌抗原蛋白及在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。
背景技术：
动物细菌性传染病对人类健康的威胁日益严重，给国民经济和社会稳定造成冲击和影响。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，结核病的主要致病菌)是一种严重危害人类健康的病原菌，全世界有三分之一人口携带处于潜伏状态的结核分枝杆菌，每年大约有两百万人死于结核病(Raviglione M C. TheTB epidemic from 1992 to 2002. Tuberculosis (Edinb)，2003，83 :4-14.)。近年来，结核分枝杆菌合并人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染及多重耐药结核菌株的出现，对人类公共卫生事业的威胁更加严峻。因此，开发结核病及耐药结核病的简单、快速、敏感的诊断技术，成为当前控制结核病的重要策略和手段。到目前为止，临床上结核病的诊断标准主要是在显微镜下直接观察结核分枝杆菌的痰涂片法。但是，痰标本细菌学检查的灵敏度非常低，临床上主要还根据临床症状和影像学资料来综合诊断结核病。而另一个诊断标准结核杆菌培养作为结核病诊断的“金标准”， 需要耗费大量的时间，同时还需要有高水平的技术人员操作，限制了其在临床结核病诊断中的应用。研究人员利用各种新兴的分子生物学以及现代免疫学理论和技术，已经开发出一些有希望的检测方法，比如快速分枝杆菌全自动培养和检测、噬菌体生物扩增法和噬菌体生物发光法、利用DNA或者RNA的扩增技术、利用新型免疫学方法等。但是，这些技术均需要高成本以及高技术水平的操作人员，限制了它们在低收入国家的推广的和应用，而这些国家的结核病感染率往往都比较高。鉴于此，本发明申请人根据前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到的三个抗原蛋白编码基因，将其在大肠杆菌中克隆表达纯化，并进一步应用于结核病的体外分子诊断。本发明建立了一种快速、低成本、易于操作的基于ELISA技术的结核病诊断方法，该方法与在中国市场上应用较为广泛使用的两种同类试剂盒TB-DOT(上海奥普生物医药有限公司)和TB-check-1 (法国VEDA LAB公司)相比，敏感性和特异性都得到了显著提高。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分子生物学技术和方法，制备三种适用于诊断检测结核病的新型结核分枝杆菌抗原蛋白，将所述的三种新型抗原蛋白应用于结核病的ELISA诊断检测。本发明是这样实现的申请人:前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段，它们能够强烈的与结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0:l，3，5所示，它们编码的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID N0:2，4，6所示。其中从Rvl987基因(NCBI 登录号NP_216503. 1，GeneID :885815，基因注释为可能的几丁质酶)中筛选得到如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，序列长度为0.4291Λ，从Rv3807c基因(NCBI登录号 NP_218324. 1，GeneID :886134，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，序列长度为0. 498kb,从Rv3887c基因(NCBI登录号 NP_218404. 1，GeneID :886211，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，序列长度为1.531Λ。申请人通过基因克隆方法，获得含有这三个抗原蛋白的重组大肠杆菌。然后，在大肠杆菌中表达纯化这三个结核分枝杆菌抗原蛋白。最后，利用获得的抗原蛋白进行结核病的检测，并与市售的结核病诊断试剂盒的检测结果进行比较。生物学试验表明，本发明克隆的上述三个基因编码的抗原蛋白可以作为特异性抗原蛋白应用于结核病的检测。在本发明的实施例中，申请人提供了三种结核分枝杆菌抗原蛋白的详细制备方法，并描述了这三个抗原蛋白在结核病诊断中的应用前景。本发明的优点是，操作成本低，并能够快速、便捷、准确的检测结核病。本发明更详细的技术方案参见《具体实施方式
》。


序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的Rvl987基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的Rvl987基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3是本发明克隆的Rv3807c基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0:4是本发明克隆的Rv3807c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 5是本发明克隆的Rv3887c基因片段的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0:6是本发明克隆的Rv3887c基因片段编码的蛋白质的氨基酸序列。图1 本发明的技术流程图。图2 本发明使用的抗原基因序列在结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中所处的位置(括号内显示为有下划线的为所述的抗原序列在NCBI数据库中的编号，其后的冒号后的数字为该编号所示序列在结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字为所述的结核分枝杆菌的菌株号)。图3 是本发明使用的pET48a(+)载体图谱。图4 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的PCR扩增结果。从左到右样品依次是Marker、Rv 1987、Rv3807c、Rv3887c。图5 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的双酶切验证结果。从左到右样品依次是Marker、Rvl987、Rv3807c、Rv3887c。图6 :是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的纯化结果。从左到右样品依次是 Marker、Rvl987、Rv3807c、Rv3887c、Mutiple-antigen (即混合抗原蛋白将 Rvl987、Rv3807c和Rv3887c按浓度比为1 1 1的比例混合)。图7 是本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白的western-blot结果。从左到右样品依次是Rvl987、Rv3807c、Rv3887c。图8 本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-D0T 和ΤΒ-check-l)在结核病诊断中的敏感性的比较结果。从左到右样品依次是 MutipIe—Eintigen、Rv3807c>Rv3887c>Rvl987>TB-DOT>TB_check_l0图9 :本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-D0T 和ΤΒ-check-l)在结核病诊断中的特异性的比较结果。从左到右样品依次是 MutipIe—Eintigen、Rv3807c>Rvl987>Rv3887c>TB_check—1、TB_D0To图10:本发明的结核分枝杆菌抗原蛋白与两种商购的试剂盒(TB-D0T 和ΤΒ-check-l)在结核病诊断中的准确性的比较结果。从左到右样品依次是 MutipIe—Eintigen、Rv3807c>Rv3887c>Rvl987>TB-DOT>TB_check_l0
具体实施例方式实施例1 结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的PCR扩增申请人:前期从结核分枝杆菌基因组序列中筛选得到三个基因片段，它们能够强烈的与结核病人的血清发生反应。它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0:l，3，5所示， 它们编码的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID N0:2，4，6所示。其中从Rvl987基因(NCBI 登录号NP_216503. 1，GeneID :885815，基因注释为可能的几丁质酶)中筛选得到如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，序列长度为0.4 ,从Rv3807c基因(NCBI登录号 NP_218324. 1，GeneID :886134，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，序列长度为0. 498kb,从Rv3887c基因(NCBI登录号 NP_218404. 1，GeneID :886211，基因注释为可能的保守的跨膜蛋白)中筛选得到如序列表 SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，序列长度为1. 53kb01、结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的引物设计方法根据NCBI提供的结核分枝杆菌H37Rv(结核分枝杆菌H37Rv菌株的公众获得来源中国医学细菌保藏管理中心， 菌种编号为93004。网址http://www. cmccb. org. cn/)基因组核酸序列(NCBI登录号 AL123456. 2)获得结核分枝杆菌抗原蛋白编码基因的核苷酸序列，根据编码基因内部的酶切位点，选择基因内部没有的酶切位点组合(使用McI和NotI的酶切位点组合)，从编码基因的前后各取20bp设计引物，具体引物序列如下(下划线所示为酶切位点序列)R1987forward=ATAT GAGCTC ATGGCCGGACTGAACATTTA,R1987reverse =GAGCG GCGGCCGC CTAGGTGCAAGGATATTGCC ；R3807cforward=GATG GAGCTC ATGGTGGCCGTGCAGTCGGC,R3807creverse =GAGAG GCGGCCGC TCATCTCTTCCGGGCCCTTT ；R3887cforward=TTAT GAGCTC GTGACTGCGCCGCATAAGGT，R3887creverse :CGAGC GCGGCCGC TTAGTGGCGAAGCCATGCAA。对应基因的PCR结果参见图4。PCR反应体系和反应条件如表1和表2 表IPCR反应体系
权利要求
1.结核分枝杆菌抗原蛋白，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 1, SEQ ID NO :3和 SEQID NO 5 所示。
2.权利要求1所述的抗原蛋白，它编码的氨基酸序列如序列表SEQID NO 2, SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 6 所示。
3.权利要求1或2所述的抗原蛋白在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，与传染病分子诊断技术领域有关。本发明具体涉及三种结核分枝杆菌抗原蛋白的制备及其在制备结核病诊断检测试剂盒中的应用。所述的结核分枝杆菌抗原蛋白，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO1，3，5所示，它们编码的蛋白质的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO2，4，6所示。生物学试验表明本发明制备的三种结核分枝杆菌抗原蛋白能够在制备结核病诊断检测试剂盒中应用。
文档编号G01N33/569GK102260328SQ20101023157
公开日2011年11月30日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者何正国, 李雨庆 申请人:华中农业大学