专利名称：蛋白质测定用试验片及其制造方法
技术领域：
本发明涉及测定含蛋白质试样(例如血液和尿等体液、含蛋白质饮料、工厂废水)中存在的蛋白质所使用的蛋白质测定用试验片及其制造方法。
背景技术：
测定生物体试样中的蛋白质，在病理学的诊断方面是重要的。例如，在肝脏功能低下的情况下，血清白蛋白量下降，而另一方面，在肾炎、肾变病综合症、结石、肿瘤等的肾-尿路疾病、循环系统及中枢神经系统的疾病等的情况下，尿中的蛋白质的量增加。因而，测定白蛋白等蛋白质，在这些疾病的诊断中可以成为重要的指标。
在蛋白质测定的领域中，已知使用蛋白质误差指示剂的简便的测定方法。在该测定方法中，作为蛋白质误差指示剂，例如使用着四溴酚蓝(TBPB)，如果举一个例子，使用TBPB的尿试纸，作为一次性筛选用被广泛地使用着。当存在蛋白质时，在pH3附近，就引起TBPB的酚性羟基的解离，从黄色变为蓝色，就可以检测出蛋白质。
但是，将TBPB作为指示剂使用的试纸，因为对于临床必须的10～20mg/dl的低浓度蛋白质的检测灵敏度不够，所以有时不能正确地检测蛋白质。例如，在与色表比较而进行的目测判断中，因为阴性蛋白质与痕迹蛋白质的颜色相近，所以难以区别而判断有困难。另一方面，即使在使用尿试纸的测定装置时，因为TBPB的灵敏度低，而经常有判断错误的情况。
因此，希望有灵敏度更高的可以定量低浓度蛋白质的技术。

发明内容
为了解决上述课题，本发明者进行了深入研究，结果本发明者发现，如果使试验片上含有表面活性剂，就可以以高灵敏度测定低浓度的蛋白质，从而完成了本发明。
即，由本发明第一方面提供的蛋白质测定用试验片，是用于定量或半定量地测定蛋白质、且含有酸性pH指示剂的蛋白质测定用试验片，其中，作为用于提高蛋白质发色灵敏度的增感剂，含有表面活性剂。
本发明的第二方面提供一种蛋白质测定试验片的制造方法，是制造用于定量或半定量地测定蛋白质的蛋白质测定用试验片的方法，其中在使含有酸性pH指示剂和增感剂的含浸液含浸于吸收性载体之后、通过使其干燥来制造蛋白质测定用试验片的方法中，作为上述增感剂，使用表面活性剂。
作为本发明中可以使用的酸性pH指示剂来说，可以列举出例如三苯甲烷类指示剂。作为三苯甲烷类指示剂来说，典型的可以列举出用下述化学式(1)表示的物质。
在化学式(1)中，X1是卤素、硝基或亚硝基，X2和X3是相同或不同的卤素。
在本发明中，作为三苯甲烷类指示剂，优选使用由下述化学式(2)表示的四溴酚蓝(TBPB)。
含浸液中的酸性pH指示剂(例如TBPB)的浓度，没有特别的限定，但典型的是0.1～5mM，优选为0.3～0.1mM。
作为表面活性剂(增感剂)来说，优选使用阳离子型表面活性剂，也可以除此以外还使用非离子型表面活性剂、或者取代其而使用非离子型表面活性剂。
作为阳离子型表面活性剂来说，例如可以使用季铵盐。作为季铵盐来说，可以列举例如烷基二甲基苄基铵、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、苄烷铵盐和咪唑盐。作为阳离子型的表面活性剂来说，也可以使用脂肪族胺盐。
作为非离子型表面活性剂来说，可以使用醚型、醚酯型、酯型和含氮型中的任意一种。
作为醚型表面活性剂来说，可以列举例如聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯仲醇醚、聚氧化乙烯烷基苯醚、聚氧化乙烯甾醇醚、聚氧化乙烯含水羊毛脂衍生物、烷基酚甲醛缩合物的氧化乙烯衍生物、聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物和聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基醚。
作为醚酯型表面活性剂来说，可以列举例如聚氧化乙烯脂肪酸甘油酯、聚氧化乙烯蓖麻籽油、聚氧化乙烯硬化蓖麻籽油、聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯和聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。
作为酯型表面活性剂来说，可以列举例如聚乙二醇脂肪酸酯、脂肪酸单甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。
作为含氮型表面活性剂来说，可以列举例如脂肪酸烷醇酰胺、聚氧化乙烯脂肪酰胺、聚氧化乙烯烷基胺和烷基胺氧化物。
作为本发明中的阳离子型表面活性剂来说，典型的是使用苄基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十四烷基二甲基苄基氯化铵(Zephiramine)，作为非离子型表面活性剂来说，典型的是使用聚乙二醇。当然，也可以同时使用多种表面活性剂，在此时，优选将阳离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂组合起来使用。典型的是，将作为阳离子型表面活性剂的苄基三甲基溴化铵与作为非离子型表面活性剂的聚乙二醇组合起来使用。
含浸液中的增感剂(表面活性剂)的浓度，没有特别的限制，典型的是0.01～5wt％、优选为0.01～1wt％。
作为增感剂来说，除了表面活性剂以外，还可以使用聚碳酸酯或聚乙烯醇等的高分子材料。
含浸液的pH值，设定为比酸性pH指示剂的pKa值稍低的值。在使用TBPB作为酸性pH指示剂时，含浸液的pH值为2.0～4.5、优选为2.0～3.5。
作为缓冲剂来说，在含浸液的pH(例如pH2.0～4.5的范围)中，具有良好的缓冲能力，只要是不阻碍酸性pH指示剂与蛋白质反应的物质，什么物质都可以。作为缓冲剂来说，可以使用例如甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、苹果酸缓冲液或酒石酸缓冲液。含浸液中的缓冲剂的浓度，没有特别的限制，典型的是0.1～1.5M、优选为0.3～1M。
作为吸收性载体来说，可以使用不含蛋白质成分的多孔性物质，例如可以使用片状或膜状形态的材料。作为多孔性物质来说，可以列举例如纸状物、泡沫(发泡体)、织布状物、无纺布状物与编织状物。作为用于形成吸收性载体的材料来说，可以列举例如棉、麻、纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、石棉、玻璃纤维、二氧化硅纤维、碳纤维、硼纤维、聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、再生纤维素(人造丝)、聚酯、尼龙、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚烯烃。这些吸收性载体的形状，没有特别的限定，通常是矩形、长方形、圆形或椭圆形。
本发明的蛋白质测定用试验片，可以直接使用，也可以粘接在非吸收体上来使用。
作为非吸收体来说，可以使用例如片状或膜状形态的非吸收体。作为用于形成非吸收体的材料来说，可以列举例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯与聚苯乙烯。
具体实施例方式
实施例(实施例1)在本实施例中，使白蛋白浓度为0.3mg/dl(阴性)或15mg/dl(阳性)的尿含浸于试验片中，对其分别测定了反射率。试验片是通过使含浸液含浸于滤纸(Whatman社製“3MMChr”)中之后再使其干燥而制成。作为含浸液来说，使用了相对于表1所示的基本组成添加了0.2wt％作为增感剂的阳离子型表面活性剂的苄基三甲基溴化铵的含浸液。使用色差计，以630nm作为测定波长测定反射率。测定结果如表2所示。
(实施例2)在本实施例中，除了使用相对于表1的基本组成添加0.01wt％作为增感剂的阳离子型表面活性剂即十六烷基三甲基溴化铵来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(实施例3)在本实施例中，除了使用相对于表1的基本组成添加0.01wt％作为增感剂的阳离子型表面活性剂即十二烷基三甲基溴化铵来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(实施例4)在本实施例中，除了使用相对于表1的基本组成添加0.5wt％作为增感剂的非离子型表面活性剂即聚乙二醇来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(实施例5)在本实施例中，除了同时使用相对于表1的基本组成添加作为增感剂的0.2wt％阳离子型表面活性剂即苄基三甲基溴化铵和0.5wt％非离子型表面活性剂即聚乙二醇来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(实施例6)在本实施例中，除了同时使用相对于表1的基本组成添加作为增感剂的0.01wt％阳离子型表面活性剂即十二烷基三甲基溴化铵和0.5wt％非离子型表面活性剂即聚乙二醇来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(实施例7)在本实施例中，除了同时使用相对于表1的基本组成添加作为增感剂的0.01wt％阳离子型表面活性剂即十四烷基二甲基苄基氯化铵和0.5wt％非离子型表面活性剂即聚乙二醇来作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
(比较例1)在本比较例中，除了使用基本组成(不含表面活性剂(增感剂))作为含浸液以外，与实施例1同样地测定了反射率。其结果示于表2。
表1基本组成

表2测定结果 由表2可知，白蛋白浓度为15mg/dl时的反射率，含有表面活性剂时，与不含表面活性剂时相比较小。因此，阴性时(0.3mg/dl)与阳性时(15mg/d1)的差分 含有表面活性剂时是不含表面活性剂时的2倍左右。因此可以说，在含有表面活性剂的情况下，针对白蛋白的灵敏度变高，即使白蛋白浓度为10～20mg/dl左右的低浓度，也能够适当地检测白蛋白。特别是，单独使用阳离子型表面活性剂、或者除此之外再同时使用非离子型表面活性剂的情况下，白蛋白的检测灵敏度变高。由此出发，作为增感剂来说，可以说优选的是使用阳离子型表面活性剂。
另外，各实施例中的实验结果是关于尿样的，但本发明不限于尿，也可以适用于定量测定含有蛋白质的各种试样例如血液、含蛋白质饮料、工厂废水中的蛋白质的情况。
权利要求
1.一种蛋白质测定用试验片，用于定量或半定量地测定蛋白质，并且含有酸性pH指示剂，其特征在于作为用于提高蛋白质发色灵敏度的增感剂，含有表面活性剂。
2.如权利要求1所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于所述酸性pH指示剂是三苯甲烷类指示剂。
3.如权利要求2所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于所述三苯甲烷类指示剂是用下述化学式(1)表示的四溴酚蓝，
4.如权利要求1所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于作为所述增感剂，含有阳离子型表面活性剂。
5.如权利要求4所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于所述阳离子型表面活性剂是选自苄基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵和十四烷基二甲基苄基氯化铵中的至少一种。
6.如权利要求1所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于作为所述增感剂，含有非离子型表面活性剂。
7.如权利要求6所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于所述非离子型表面活性剂是聚乙二醇。
8.如权利要求1所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于作为所述增感剂，将阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组合起来使用。
9.如权利要求8所述的蛋白质测定用试验片，其特征在于所述阳离子型表面活性剂是苄基三甲基溴化铵，所述非离子型表面活性剂是聚乙二醇。
10.一种蛋白质测定用试验片的制造方法，它是制造用于定量或半定量地测定蛋白质的蛋白质测定用试验片的方法，其特征在于在使含有酸性pH指示剂和增感剂的含浸液含浸于吸收性载体之后、通过使其干燥来制造蛋白质测定用试验片的方法中，作为上述增感剂，使用表面活性剂。
11.如权利要求10所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于作为所述表面活性剂，使用选自苄基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵和聚乙二醇中的至少一种。
12.如权利要求11所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于作为所述表面活性剂，将苄基三甲基溴化铵和聚乙二醇组合起来使用。
13.如权利要求10所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述表面活性剂的含量，设定为0.01～5wt％。
14.如权利要求13所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述表面活性剂的含量，设定为0.01～1wt％。
15.如权利要求10所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于作为所述酸性pH指示剂，使用由下述化学式(2)表示的四溴酚蓝，
16.如权利要求10所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于所述含浸液中的所述酸性pH指示剂的浓度，设定为0.1～5mM。
17.如权利要求16所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于所述含浸液的pH值，设定为所述酸性pH指示剂pKa以下。
18.如权利要求17所述的蛋白质测定用试验片的制造方法，其特征在于所述含浸液的pH值设定为2.0～4.5。
全文摘要
本发明涉及用于定量或半定量地测定蛋白质、并且含有酸性pH指示剂的蛋白质测定用试验片。该蛋白质测定用试验片，含有表面活性剂作为提高针对蛋白质的发色灵敏度的增感剂。作为酸性pH指示剂来说，使用例如三苯甲烷类指示剂。本发明还提供一种蛋白质测定用试验片的制造方法。该制造方法是，使含有酸性pH指示剂和增感剂的含浸液含浸于吸收性载体之后、通过使其干燥来制造蛋白质测定用试验片。作为增感剂来说，使用表面活性剂。
文档编号G01N33/68GK1675552SQ0381903
公开日2005年9月28日 申请日期2003年8月4日 优先权日2002年8月9日
发明者小坂秀子 申请人:爱科来株式会社