专利名称：一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法，尤其涉及一种用于 纳米-微米尺度细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法，属于生物技术领域。
背景技术：
合成生物学通过分子生物学手段，对细胞软件(以DNA为代表的遗传物质)和 硬件(以核糖体为代表的细胞器)进行系统改造，使之具备特定功能。这些活体细胞能 自我复制并作为“合成工厂”，将简单和低价的能量和物质(例如阳光与二氧化碳)转化 为具有高附加值的药物、材料和生物能源，或用于消除难降解污染物。正如2009年英国 皇家工程学会报告所言，合成生物学带来的突破和效益“必将成为国家财富的重要组成 部分”。但是，合成生物学技术的发展首先取决于具有创新功能的生命组分(基因、蛋 白、细胞、群落等)的获得，而在此领域现有研究面临三大技术瓶颈。
首先，微生物大约占据了全球生物量的一半，其中蕴含着大量未知的功能基 因，而自然环境中超过99%的微生物为不可培养微生物，不能通过传统的培养方法分离 和研究。例如，Craig Venter在百慕大Sargasso海域研究中，仅在数百升海水中就发现了 148种新的微生物和大约120万个未知基因。另有研究表明，1克土壤中就含有超过18000 种微生物，超过已知原核生物总数(16177种)。基于此，人们逐渐认识到不可培养微生 物作为一种尚未被开发的生物资源，在生物能源、工业生物催化、环境修复、医药等领 域具有难以估量的价值。因此，建立单细胞水平(微米尺度)或纳米尺度颗粒的识别与 分选平台，对于探究不可培养微生物中所蕴含的基因资源具有重大意义。
其次，传统的基于细胞群体水平性状测量的信息并不能真实反映细胞内部的生 物过程及机制。传统微生物学对微生物细胞表征的研究基于群体细胞水平，而最近研究 表明，同一种群内具有相同基因型的细胞可展现出显著表现型差异性，这在很大程度上 归结于胞内分子碰撞所导致的基因表达随机性。这种分子水平上所存在的DNA表达与调 控的时间和空间随机性，产生了群体内细胞的表征存在个体差异性。对单细胞个体差异 性机制的研究，可以揭示癌症发病机制，理解细胞分化与组织发育原理，识别基因表达 特性与细胞特征。现有单细胞研究技术主要基于宏基因组焦磷酸测序和荧光活化细胞分 选。前者是研究基因表达和不可培养微生物的主要手段，但显著依赖DNA测序分析， 不仅不能直接揭示基因表达机制，而且不能分离具有特定功能基因的微生物。后者是分 离细胞的有效手段，然而由于绝大多数活体细胞本身荧光效应较弱或没有荧光，外加荧 光标记过程会导致细胞死亡，因此该方法无法用于活体细胞筛选。尤为重要的是，无论 是宏基因组测序还是荧光活化细胞分选方法，都不能有效地建立在不同环境条件下基因 表达与环境因素之间的关系，进而无法获得不可培养微生物与其生态功能之间的联系。 因此，只有通过在活体单细胞水平实现性状识别和分选，才可以真正了解和改进细胞功 能。
最后，现有活体细胞分选技术主要基于流式细胞仪，而其核心技术在于细胞信息的识别。在信息识别过程中，由于扫描时间与所获得信息量成正比，即长时间的信 号扫描可以获得高信息量和分辨率，短时间的信号扫描可以获得高识别效率和通量。因 此，选择合适的信号扫描时间以获得足够的信息量和较高的识别效率，是信息识别的技 术核心。现有传统流式细胞仪中，细胞和颗粒信息的识别主要采用普通光信号，单位 时间对目标的信息获得率较低，因此在满足工程应用的识别效率前提下，缺乏足够信息 量，只能对细胞/颗粒的形态、折光率、反射率或荧光强度等有限指标进行区分。拉曼 光谱作为一种高效、高通量的信息识别技术，可在细胞/颗粒分选技术领域带来一系列 变革。通过对特定入射光线对化合物的非弹性散射谱线分析，拉曼显微光谱可以直接检 测化合物分子振动或转动能级，通过对拉曼特征谱线的分析，可以获得化合物分子构成 和结构的信息，具有如下三大优点首先，拉曼显微光谱在获得整个单细胞的化学物质 指纹图谱时并不需要任何标记，提供细胞内包括核酸、蛋白质、糖类和脂类等大量化合 物的信息，因此可以帮助我们识别活体细胞的细胞类型、生理特性和表征变化；其次， 最新研究表明结合拉曼光谱和共聚焦显微拉曼技术，可以构建拉曼光钳进行单细胞分 析，不仅可以识别单细胞水平的同位素标记拉曼位移而且可以与原位荧光杂交技术相结 合，对微生物群落的结构和功能进行分析；最后，拉曼光谱信号识别速度较快，在微秒 至毫秒水平即可获得足够强度的目标拉曼光谱，满足高通量快速检测的需求。基于此， 拉曼光钳筛选技术可以提供纳米-微米级细胞/颗粒的高通量信息快速识别技术，这种不 基于外源标记的观测技术，可以对活体细胞内代谢产物和细胞外细胞和颗粒之间相互作 用进行有效分析，提供单细胞水平的基因表达、细胞代谢功能和细胞间相互作用等重要 fn息ο
综上所述，针对合成生物学研究所存在的瓶颈问题，构建单细胞水平(纳米-微 米级)的细胞/颗粒分选系统，可以将把现代合成生物学思路和系统生物学手段拓展到单 细胞层面和不可培养微生物体系层面，不仅适用于细胞(包括病毒、微生物细胞、真菌 细胞、植物细胞和动物细胞)，也适用于其他纳米材料、颗粒和细胞内含物的分选，对于 材料学、环境微生物学、医学、分子生物学、生物工程学和生物能源开发等领域具有重 大的科研与工程意义。发明内容
本发明针对合成生物学研究的所存在的瓶颈问题，即不能对单细胞水平纳 米-微米级的细胞/颗粒进行分选，使得现代合成生物学思路和系统生物学手段还不能拓 展到单细胞层面和不可培养微生物体系层面的不足，提供一种用于纳米-微米尺度细胞 和颗粒分离的分选仪及分选方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种用于细胞和颗粒分离的分选仪 包括拉曼光谱采集分析系统、微流控制系统和细胞/颗粒分选系统；所述微流控制系 统和拉曼光谱采集分析系统相连，用于使目标细胞/颗粒在拉曼激光激发下产生拉曼信 号，以及对目标细胞/颗粒进行分选；所述拉曼光谱采集分析系统和细胞/颗粒分选系统 相连，用于接收目标细胞/颗粒的拉曼信号并产生目标细胞/颗粒的拉曼光谱信号；所述 细胞/颗粒分选系统和微流控制系统相连，用于根据接收的拉曼光谱信号控制所述微流 控制系统对目标细胞/颗粒进行分选。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述拉曼光谱采集分析系统包括拉曼光谱仪，所述微流控制系统包括 载物台、微流控器件和微流控制泵，所述细胞/颗粒分选系统包括控制终端、场力控制 器和场力发生器；所述拉曼光谱仪分别与微流控器件和控制终端相连；所述载物台和微 流控器件相连，所述微流控器件和微流控制泵相连，所述控制终端和场力控制器相连， 所述场力控制器和场力发生器相连，所述场力发生器和微流控器件相连；所述载物台用 于向微流控器件输送目标细胞/颗粒和保护液；所述微流控制泵用于调控所述载物台向 所述微流控器件输送目标细胞/颗粒和保护液的速度；所述控制终端用于对生成的拉曼 光谱信号进行特异性识别同时生成并发送状态信号；所述场力控制器用于根据接收的状 态信号，生成控制信号，并将所述控制信号发送给所述场力发生器；所述场力发生器用 于根据接收到的控制信号，执行关闭或开启操作。
所述微流控制泵根据样品特征，将目标细胞/颗粒和保护液的流动状态保持在 层流状态，流速范围为O.lmm/s 100mm/s。
进一步，所述微流控器件包括注入通道、检测与分选区域和收集通道；所述注 入通道和检测与分选区域相连，用于将目标细胞/颗粒和保护液注入并进行混合；所述 检测与分选区域和收集通道相连；所述检测与分选区域包括拉曼光谱分析区域和细胞分 选区域，所述拉曼光谱分析区域用于使混合后的目标细胞/颗粒和保护液在拉曼激光激 发下产生拉曼信号，所述细胞分选区域用于对目标细胞/颗粒进行分选；所述收集通道 用于将分选后的目标细胞/颗粒进行收集。
所述细胞分选区域内的目标细胞/颗粒被受调控的可变光学、磁场或电场控 制，不同类型的细胞/颗粒产生运动路径差异。
进一步，所述保护液为pH = 5 10的缓冲溶液。
使用保护液的目的在于能够使待分选的细胞或颗粒持续处于稳定的pH条件下， 同时在双通道保护液混合和运移过程中，待分选的细胞或颗粒可以稳定在通道中间运 动，便于后续拉曼光谱识别与分选。因此，任何pH范围在5 10之间的缓冲溶液均 可在本发明所涉及的拉曼流式分选仪中使用，例如通过将KXSeilgNa2HPO4 · 2H20和 6.0860gNaH2P04 · 2H20溶解于IOOmL纯水中，振荡至晶体全部溶解，再加入纯水定容 至1.0L制成保护液。
进一步，所述注入通道包括目标细胞/颗粒通道、第一分选保护液通道和第二 分选保护液通道，所述第一分选保护液通道和第二分选保护液通道位于目标细胞/颗粒 通道的两侧并和目标细胞/颗粒通道相连通；所述检测与分选区域包括检测与分选通 道，所述检测与分选通道和目标细胞/颗粒通道、第一分选保护液通道以及第二分选保 护液通道相连通；所述收集通道包括第一收集通道和第二收集通道，所述第一收集通道 和第二收集通道均和检测与分选通道相连通。
所述分选保护液通道为两个可以保证样品溶液在与保护液汇合后，受到两个方 向的保护液平衡作用，样品溶液可以在保护液层内保持层流状态，以保证样品溶液中待 分选的细胞或颗粒均勻、逐个、稳定地在通道中央运动，可以有效提高分选效率与准确率。
进一步，所述场力控制器为声光调制器，所述场力发生器为光学场力发生器。
优选地，所述光学场力发生器使用400nm 1500nm精确时间延迟TTL脉冲激光。
进一步，所述场力控制器为电场调制器，所述场力发生器为电场力发生器。
优选地，所述电场力发生器使用延迟脉冲单稳态触发器。
进一步，所述场力控制器为电磁铁控制器，所述场力发生器为磁场力发生器。
优选地，所述场力发生器使用电磁耦合器。
本发明还提供一种解决上述技术问题的技术方案如下一种用于细胞和颗粒分 离的分选方法包括
1)将细胞/颗粒样品和分选保护液混合形成混合液；
2)将所述混合液在拉曼激光激发下产生拉曼信号；
3)根据所述拉曼信号生成相应的拉曼光谱信号；
4)对所述拉曼光谱信号进行特异性识别，并根据识别结果生成且发送状态信 号；
5)接收所述状态信号，并根据所述状态信号生成且发送控制信号；
6)根据接收到的控制信号控制不同类型的细胞/颗粒样品的运动轨迹，从而对 不同类型的细胞/颗粒样品进行分选。
进一步，所述步骤1)具体包括
11)准备目标细胞/颗粒样品以及配制分选保护液；
对于活体细胞样品，在经过细胞培养过程后，需经离心分离，最终转移至液体 矿物质培养基中，以避免不同培养基的背景光谱对分选结果产生影响；
所述离心分离的次数以及转数由活体细胞样品的具体种类和用量来决定，优选 地，所述离心分离的次数为3次，转数为3000rpm;
对于纳米材料、颗粒和细胞内含物，需将样品溶解于液体矿物质培养基或纯水 中，以避免不同溶液的背景光谱对分选结果产生影响；
根据缓冲液pH值与缓冲液对离子用量的关系制成的表格计算出配制缓冲液所需 固态化学成分的量，再将称量后的固态化学成分溶解于纯水中，振荡至固态化学成分全 部溶解，再加入纯水进行定容，即可获得分选保护液；
12)注入目标细胞/颗粒溶液以及分选保护液；
将步骤(11)中获得的目标细胞/颗粒溶液和分选保护液分别加入至微流控器件 特定位置，在微流控制泵的驱动下分别以层流方式流经微流控器件内部目标细胞/颗粒 注入通道、第一分选保护液通道和第二分选保护液通道，所述目标细胞/颗粒溶液和分 选保护液的流速分别为O.lmm/s 100mm/s。
进一步所述步骤2、和步骤幻具体包括微流控器件内目标细胞/颗粒溶液和 分选保护液混合后，流经检测与分选区域中的拉曼光谱分析区域，在拉曼激光激发下， 产生拉曼信号，拉曼光谱仪接收拉曼信号，并根据所述拉曼信号生成相应的拉曼光谱信 号。
进一步，所述拉曼激光的扫描步长为0.1毫秒 10毫秒，拉曼信号的捕获频率 为 IOOHz 10000Hz。
进一步，所述步骤4)具体包括控制终端内的信息识别软件对获得的拉曼光谱信号的信息进行特异性识别，并根据识别结果生成且发送状态信号。
进一步，所述步骤幻具体包括场力控制器接收控制终端内信息识别软件生成 的状态信号，对场力发生器进行关闭或者开启的控制，场力发生器在关闭状态时，检测 与分选区域中的细胞分选区域无拉曼激发激光场力、磁场力或电场力，目标细胞/颗粒 运动状态不受影响，最终进入第一收集通道，场力发生器在开启状态时，检测与分选区 域中的细胞分选区域存在拉曼激发激光场力、磁场力或电场力，目标细胞/颗粒运动状 态受到影响，运动轨迹产生偏移，最终进入第二收集通道。
本发明的有益效果是本发明用于细胞和颗粒分离的分选仪可有效识别和分选 纳米-微米尺度的细胞、纳米材料、颗粒和细胞内含物，由于拉曼光谱具有快速、非侵 害性和高信息含量等特点，因此在同样的时间内，比荧光或放射性同位素标记等方法提 供更为丰富的细胞或颗粒的特征信息，适用于材料学、环境微生物学、医学、分子生物 学、生物工程学和生物能源开发等领域对细胞/颗粒样品的高效分析和分选。


图1为本发明实施例用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪的结构示意图2为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第一实施例的结构示意 图3为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第二实施例的结构示意 图4为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第三实施例的结构示意 图5为本发明实施例微流控器件的结构示意图6为本发明实施例用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪的拉曼光谱信号识 别图7为本发明实施例目标细胞/颗粒溶液以及分选保护液注入的结构图8为本发明实施例目标细胞/颗粒溶液和保护液混合的结构图9为本发明实施例混合的目标细胞/颗粒溶液和保护液在拉曼激光激发下产生 拉曼信号的结构图10为本发明实施例不同类型的目标细胞/颗粒分选的结构图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。
本发明目标检测物即目标细胞/颗粒，包括细胞、纳米材料、颗粒和细胞内含 物。所述细胞包括病毒、微生物细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞等；所述纳米材 料包括纳米金颗粒、纳米银颗粒和纳米磁性颗粒等；所述颗粒包括尺寸在纳米至微米尺 度的花粉、粉尘、土壤粒子、海盐粒子和煤尘粒子等；所述细胞内含物包括脱氧核糖核 酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、脂类、多糖和细胞器等。
图1为本发明实施例用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪的结构示意图。如图1所示，所述用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪包括拉曼光谱采集分析系统10、 微流控制系统11和细胞/颗粒分选系统12 ；所述微流控制系统11和拉曼光谱采集分析 系统10相连，用于使目标细胞/颗粒在波长为400纳米 800纳米的拉曼激发激光激发 下产生拉曼信号，以及对目标细胞/颗粒进行分选；所述拉曼光谱采集分析系统10和细 胞/颗粒分选系统12相连，用于接收目标细胞/颗粒的拉曼信号并产生目标细胞/颗粒 的拉曼光谱信号；所述细胞/颗粒分选系统12和微流控制系统11相连，用于根据接收的 拉曼光谱信号控制微流控制系统对目标细胞/颗粒进行分选。
所述拉曼光谱采集分析系统主要包括拉曼光谱仪，通过波长为400nm SOOnm 的拉曼激发激光的激发，获得目标细胞/颗粒的拉曼光谱。采用表面增强拉曼技术，可 以将拉曼光谱信号增强6个数量级，使其对纳米-微米级细胞/颗粒的有效响应时间缩短 至1毫秒之内，以实现快速高通量检测的目的。将拉曼光谱仪与共聚焦光子钳技术和落 射荧光技术相结合，能够在单细胞水平上鉴定和分离细胞，也可以对纳米尺度颗粒物进 行有效识别。
本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪的基本工作原理是通过拉曼光 谱特征对目标细胞/颗粒信息进行分析识别，计算机自动分析拉曼光谱学数据并控制细 胞分选切换装置，使用光学、磁场或电场技术手段对特定细胞/颗粒进行操控，通过微 流控器件实现细胞/颗粒分离至不同微流通道的目的。
本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪可以用于分选未经前处理或经过 前处理的细胞或者颗粒，细胞或者颗粒的前处理过程可以包括表面拉曼增强标记处理、 磁性纳米颗粒标记处理、稳定同位素标记处理和免疫标记处理等，对于不同的细胞或者 颗粒样品，或者同一样品的不同分选指标，可以对该系统做相应的设置，以达到最大化 分选通量等目的。
图2为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第一实施例的结构示意 图。如图2所示，在本实施例中，所述拉曼光谱采集分析系统20包括拉曼光谱仪201， 所述微流控制系统21包括载物台211、与载物台211相连的微流控器件212以及与微流控 器件212相连的微流控制泵213，所述细胞/颗粒分选系统22包括控制终端221、与控制 终端221相连的声光调制器222，以及与声光调制器222相连的光学场力发生器，所述光 学场力发生器包括红外激光2M和低孔径值凸透镜223，所述声光调制器222分别与红外 激光2 和低孔径值凸透镜223(数值孔径在0.18 0.23范围内)相连，所述低孔径值凸 透镜223和微流控器件212相连，所述微流控器件212和拉曼光谱仪201相连，所述拉曼 光谱仪201和控制终端221相连。
图3为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第二实施例的结构示意 图。如图3所示，在本实施例中，所述拉曼光谱采集分析系统30包括拉曼光谱仪301， 所述微流控制系统31包括载物台311、与载物台311相连的微流控器件312以及与微流 控器件312相连的微流控制泵313，所述细胞/颗粒分选系统32包括控制终端321、与 控制终端321相连的电磁铁控制器322，以及与电磁铁控制器322相连的磁场力发生器， 所述磁场力发生器为电磁铁323，所述电磁体控制器322和电磁铁323相连，所述电磁铁 323和微流控器件312相连，所述微流控器件312和拉曼光谱仪301相连，所述拉曼光谱 仪301和控制终端321相连。
图4为本发明用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪第三实施例的结构示意 图。如图4所示，在本实施例中，所述拉曼光谱采集分析系统40包括拉曼光谱仪401， 所述微流控制系统41包括载物台411、与载物台411相连的微流控器件412以及与微流 控器件412相连的微流控制泵413，所述细胞/颗粒分选系统42包括控制终端421、与控 制终端421相连的电场调制器422，以及与电场调制器422相连的电场力发生器，所述电 场力发生器为延迟脉冲单稳态触发器423，所述电场调制器422和延迟脉冲单稳态触发器 423相连，所述延迟脉冲单稳态触发器423和微流控器件412相连，所述微流控器件412 和拉曼光谱仪401相连，所述拉曼光谱仪401和控制终端421相连。
图5为本发明实施例微流控器件的结构示意图。如图5所示，所述微流控器件 包括注入通道、检测与分选区域和收集通道。所述检测与分选区域包括拉曼光谱分析区 域56和细胞分选区域57。所述注入通道包括目标细胞/颗粒通道50、第一分选保护液 通道51和第二分选保护液通道52，所述第一分选保护液通道51和第二分选保护液通道 52位于目标细胞/颗粒通道50的两侧并和目标细胞/颗粒通道50相连通；所述检测与 分选区域包括检测与分选通道53，所述检测与分选通道53和目标细胞/颗粒通道50、第 一分选保护液通道51以及第二分选保护液通道52相连通；所述收集通道包括第一收集通 道M和第二收集通道55，所述第一收集通道M和第二收集通道55均和检测与分选通道 53相连通。该图中目标细胞/颗粒包含两种不同类型的细胞/颗粒，分别用黑色椭圆和 白色椭圆表示，在通过拉曼激发激光对拉曼光谱分析区域56的目标细胞/颗粒进行激发 产生拉曼信号，以及细胞分选区域57对两种不同类型的细胞/颗粒进行分选，一种类型 的细胞/颗粒通过第一收集通道M进行采集，另一种类型的细胞/颗粒通过第二收集通 道55进行采集。
所述目标细胞/颗粒通道50的内径5μιη 300μιη，长度为Imm 50mm; 第一分选保护液通道51和第二分选保护液通道52的内径为10 μ m 300 μ m,长度为 Imm 50mm;检测与分选通道53的内径为10 μ m 400 μ m，长度为5mm 100mm ； 第一收集通道M和第二收集通道55的内径为5 μ m 300 μ m，长度为Imm 50mm。
下面以具体的两个实施例分别对用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪以及分 选方法做进一步详细的描述。
实施例1用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪的构建
1)拉曼光谱采集分析系统
本实例所构建的用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪，其拉曼光谱采集分析 系统中拉曼光谱仪使用共聚焦显微拉曼光谱仪(Princetonlnstrument，US),激发波长为 514.5nm (Coherent, Innova 90-5 Ar-ion)。纳米-微米尺度显微镜使用莱卡DM-IRB显微 镜，采用63倍物镜(Leica，HCXPL APO)。拉曼光谱信号采集与分析软件采用Labs pec 5.0。
2)微流控制系统
本实例所构建的用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪微流控制系统中，微流 控器件样品注入通道内径100 μ m，长度20mm;保护液通道内径100 μ m，长度20mm ； 检测与分选区域内径300 μ m，长度0mm;第一收集通道内径200 μ m，长度20mm ；第 二收集通道内径100 μ m，长度20mm。微流控制泵采用200 Series(Kd Scientific, US)，流速范围为O.l-lOOmm/s，保持样品流动保持层流状态。
3)细胞/颗粒分选系统
本实例所构建的用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪分选仪细胞/颗粒分选 系统中计算机软件采用Labspec 5.0。场力控制器由声光调制器和光学场力发生器构成， 其中声光调制器采用AOM ATD_274HD6(IntraAction，Bellwood, IL)，光学场力发生器 采用 1064nm 精确时间延迟 TTL 脉冲激光(LCS-DTL-322，Laser 2000 Ltd, US)。
实施例2用于细胞和颗粒分离的拉曼流式分选仪对同位素标记细胞的分选
(1)准备目标细胞/颗粒样品以及制备分选保护液
使用液体矿物质培养基作为细胞培养基，1升液体矿物质培养基含有2. Na2HPO4^ 2.5g KH2PO4^ 1.Og NH4Cl、(XlgMgSO4 · 7H20、10 μ L 饱禾口 CaCl2 溶液、 10 μ L 饱和 FeSO4 溶液和 ImL Bauchop & Elsden。其中，IL 的 Bauchop& Elsden solution 含有 10.75g MgS04、4.5g FeSO4 · 7H20、2.0g CaC03、1.44gZnS04 · 7H20、1.12g MnSO4 · 4H20、0.25g CuSO4 · 5H20、0.28g CoSO4 · 7H20、0.06g H3BO3 和 51.3mL 饱 和HCl溶液。
将100 μ L海水样品，加入到IOmL液体矿质培养基中，同时加入1.70mg碳13 标记的NaHCOdt为唯一碳源，其浓度为2mM。30°C条件下震荡培养14天，获得待分 选的细胞溶液。
^ 10.86105g Na2HPO4 · 2H20 和 6.08595g NaH2PO4 · 2H20 溶解于 IOOmL 纯水中，振荡至晶体全部溶解，加入纯水定容至1.0L，获得分选保护液。
(2)注入目标细胞/颗粒溶液以及分选保护液
分别将步骤(1)中获得的15 μ L样品溶液和150 μ L分选保护液加入至微流控器 件特定位置，在微流控制泵的驱动下分别以层流方式流经微流控器件内部样品注入通道 和保护液注入通道，流速分别为lmm/s，如图7所示。
(3)产生拉曼光谱
微流控器件内样品溶液和分选保护液混合后如图8所示，流经拉曼光谱分析区 域，受532nm波长拉曼激发激光照射，产生拉曼信号，如图8所示。该步骤中，拉曼激 发激光扫描步长为1ms，拉曼光谱信号捕获频率为1000Hz。
(4)信息识别不同类型的目标细胞/颗粒
信息识别软件对获得的拉曼信号信息自动运算分析，判断目标细胞类型。在细 胞溶液中，可以利用碳13标记的NaHCOdt为碳源生长的微生物细胞，由于其细胞内含 物含有碳13，因此其细胞拉曼光谱信号与不能利用碳13标记的NaHCO3作为碳源生长的 微生物细胞有所不同。如图6所示，黑色无标记曲线部分表示该段溶液中无微生物细胞 拉曼光谱信号，软件自动将该部分溶液标记为O状态； 标记曲线部分表示该段溶液中 有无碳13标记的微生物细胞拉曼光谱信号，软件自动将该部分溶液标记为O状态； 标 记曲线部分表示该段溶液中有碳13标记的微生物细胞拉曼光谱信号，软件自动将该部分 溶液标记为1状态。
(5)分选不同类型的目标细胞/颗粒
声光控制器接收信息识别软件产生的0/1标记信号。在O状态下，声光控制器 保持细胞/颗粒分选子系统处于关闭状态，1064nm精确时间延迟TTL脉冲激光场力发生器(DG535，Stanford Research System, Palo Alto, CA)无激光脉冲，细胞分选区域无红外激光场力，无碳13标记的微生物细胞运动状态不受影响，最终进入第一收集通道。在 1状态下，声光控制器保持细胞/颗粒分选子系统处于启动状态，1064nm精确时间延迟 TTL脉冲激光场力发生器产生，激光脉冲细胞分选区域存在红外激光场力，碳13标记的 微生物细胞运动状态受到影响，运动轨迹产生偏移，最终进入第二收集通道。该过程如 图10所示。
(6)回收分选后的目标细胞/颗粒
第一收集通道和第二收集通道中分别获得的无碳13标记的微生物和碳13标记 的微生物细胞，被收集在相应回收瓶内。其中碳13标记的微生物可以利用碳13标记的 NaHCOJt为碳源生长，可以对这些细胞进行进一步培养、物种分类学鉴定、宏基因组研 究和功能基因克隆等等分子生物学操作。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之 内。
权利要求
1.一种用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述分选仪包括拉曼光谱采集 分析系统、微流控制系统和细胞/颗粒分选系统；所述微流控制系统和拉曼光谱采集分 析系统相连，用于使目标细胞/颗粒在拉曼激光激发下产生拉曼信号，以及对目标细胞/ 颗粒进行分选；所述拉曼光谱采集分析系统和细胞/颗粒分选系统相连，用于接收目标 细胞/颗粒的拉曼信号并产生目标细胞/颗粒的拉曼光谱信号；所述细胞/颗粒分选系统 和微流控制系统相连，用于根据接收的拉曼光谱信号控制所述微流控制系统对目标细胞/ 颗粒进行分选。
2.根据权利要求1所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述拉曼光 谱采集分析系统包括拉曼光谱仪，所述微流控制系统包括载物台、微流控器件和微流控 制泵，所述细胞/颗粒分选系统包括控制终端、场力控制器和场力发生器；所述拉曼光 谱仪分别与微流控器件和控制终端相连；所述载物台和微流控器件相连，所述微流控器 件和微流控制泵相连，所述控制终端和场力控制器相连，所述场力控制器和场力发生器 相连，所述场力发生器和微流控器件相连；所述载物台用于向微流控器件输送目标细胞 /颗粒和保护液；所述微流控制泵用于调控所述载物台向所述微流控器件输送目标细胞/ 颗粒和保护液的速度；所述控制终端用于对拉曼光谱信号进行特异性识别同时生成并发 送状态信号；所述场力控制器用于根据接收的状态信号，生成控制信号，并将所述控制 信号发送给所述场力发生器；所述场力发生器用于根据接收到的控制信号，执行关闭或 开启操作。
3.根据权利要求2所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述微流控器 件包括注入通道、检测与分选区域和收集通道；所述注入通道和检测与分选区域相连， 用于将目标细胞/颗粒和保护液注入并进行混合；所述检测与分选区域和收集通道相 连；所述检测与分选区域包括拉曼光谱分析区域和细胞分选区域，所述拉曼光谱分析区 域用于使混合后的目标细胞/颗粒和保护液在拉曼激光激发下产生拉曼信号，所述细胞 分选区域用于对目标细胞/颗粒进行分选；所述收集通道用于将分选后的目标细胞/颗粒 进行收集。
4.根据权利要求3所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述保护液为 pH = 5 10的缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述注入通道 包括目标细胞/颗粒通道、第一分选保护液通道和第二分选保护液通道，所述第一分选 保护液通道和第二分选保护液通道位于目标细胞/颗粒通道的两侧并和目标细胞/颗粒通 道相连通；所述检测与分选区域包括检测与分选通道，所述检测与分选通道和目标细胞 /颗粒通道、第一分选保护液通道以及第二分选保护液通道相连通；所述收集通道包括 第一收集通道和第二收集通道，所述第一收集通道和第二收集通道均和检测与分选通道 相连通。
6.根据权利要求2所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述场力控制 器为声光调制器，所述场力发生器为光学场力发生器。
7.根据权利要求2所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述场力控制 器为电场调制器，所述场力发生器为电场力发生器。
8.根据权利要求2所述的用于细胞和颗粒分离的分选仪，其特征在于，所述场力控制器为电磁铁控制器，所述场力发生器为磁场力发生器。
9.一种用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所述分选方法包括1)将细胞/颗粒样品和分选保护液混合形成混合液；2)将所述混合液在拉曼激光激发下产生拉曼信号；3)根据所述拉曼信号生成相应的拉曼光谱信号；4)对所述拉曼光谱信号进行特异性识别，并根据识别结果生成且发送状态信号；5)接收所述状态信号，并根据所述状态信号生成且发送控制信号；6)根据接收到的控制信号控制不同类型的细胞/颗粒样品的运动轨迹，从而对不同 类型的细胞/颗粒样品进行分选。
10.根据权利要求9所述的用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括11)准备目标细胞/颗粒样品以及配制分选保护液；对于活体细胞样品，在经过细胞培养过程后，需经离心分离，最终转移至液体矿物 质培养基中，以避免不同培养基的背景光谱对分选结果产生影响；对于纳米材料、颗粒和细胞内含物，需将样品溶解于液体矿物质培养基或纯水中， 以避免不同溶液的背景光谱对分选结果产生影响；根据缓冲液pH值与缓冲液对离子用量的关系制成的表格计算出配制缓冲液所需固态 化学成分的量，再将称量后的固态化学成分溶解于纯水中，振荡至固态化学成分全部溶 解，再加入纯水进行定容，即可获得分选保护液；12)注入目标细胞/颗粒溶液以及分选保护液；将步骤(11)中获得的目标细胞/颗粒溶液和分选保护液分别加入至微流控器件特定 位置，在微流控制泵的驱动下分别以层流方式流经微流控器件内部目标细胞/颗粒注入 通道、第一分选保护液通道和第二分选保护液通道，所述目标细胞/颗粒溶液和分选保 护液的流速分别为0.1mm/s 100mm/s。
11.根据权利要求10所述的用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)具体包括微流控器件内目标细胞/颗粒溶液和分选保护液混合后，流经检 测与分选区域中的拉曼光谱分析区域，在拉曼激光激发下，产生拉曼信号，拉曼光谱仪 接收拉曼信号，并根据所述拉曼信号生成相应的拉曼光谱信号。
12.根据权利要求11所述的用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所述拉曼 激光的扫描步长为0.1毫秒 10毫秒，拉曼信号的捕获频率为IOOHz 10000Hz。
13.根据权利要求11或12所述的用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所 述步骤4)具体包括控制终端内的信息识别软件对获得的拉曼光谱信号的信息进行特异 性识别，并根据识别结果生成且发送状态信号。
14.根据权利要求13所述的用于细胞和颗粒分离的分选方法，其特征在于，所述步骤 5)具体包括场力控制器接收控制终端内信息识别软件生成的状态信号，对场力发生器 进行关闭或者开启的控制，场力发生器在关闭状态时，检测与分选区域中的细胞分选区 域无拉曼激发激光场力、磁场力或电场力，目标细胞/颗粒运动状态不受影响，最终进 入第一收集通道，场力发生器在开启状态时，检测与分选区域中的细胞分选区域存在拉 曼激发激光场力、磁场力或电场力，目标细胞/颗粒运动状态受到影响，运动轨迹产生偏移，最终进入第二收集通道。
全文摘要
本发明涉及一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法。所述分选仪包括拉曼光谱采集分析系统、微流控制系统和细胞/颗粒分选系统；所述微流控制系统和拉曼光谱采集分析系统相连，所述拉曼光谱采集分析系统和细胞/颗粒分选系统相连，所述细胞/颗粒分选系统和微流控制系统相连。本发明还提供了一种用于细胞和颗粒分离的分选方法。本发明分选仪可有效识别和分选纳米-微米尺度的细胞、纳米材料、颗粒和细胞内含物，由于拉曼光谱具有快速、非侵害性和高信息含量等特点，因此在同样的时间内，比荧光或放射性同位素标记等方法提供更为丰富的细胞或颗粒的特征信息。
文档编号G01N21/65GK102019277SQ201010526320
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者张大奕, 曾雨, 李梦秋, 黄巍 申请人:北京惟馨雨生物科技有限公司