专利名称：基于拉曼光谱的尿素同位素丰度的快速检测方法
基于拉曼光谱的尿素同位素丰度的快速检测方法技术领域
本发明属于信息检测技术领域，涉及一种15N双标记尿素同位素丰度的拉曼光谱快速检测方法，用于快速测量双标记尿素的15N同位素丰度。
背景技术：
氮是植物必需的营养元素，是作物施肥三要素之首，氮肥占我国化肥消费比重达 60%左右。目前我国占世界7%的耕地上消耗着全球35%的氮肥，氮肥的过量施用给我国的农业生产和生态环境带来了巨大危害。中国每年因不合理施肥造成近1000万吨的氮素流失，直接经济损失约300亿元。而且由于氮肥利用率低下，有60%左右进入环境。因而过量施氮已成为威胁中国长期粮食安全和环境安全的重大问题。减少氮肥施用量的关键是提高氮肥利用率，而15N同位素示踪(标记)法是目前唯一能直接反映作物对氮肥实际利用情况的方法。15N同位素示踪技术的关键是要对15N同位素丰度的动态变化进行跟踪和检测。但是目前15N同位素分析测量仪器昂贵、成本高、操作繁琐、耗时长、需要大量化学试剂，难以满足农业生产经济、高效的要求。
①传统的15N同位素分析方法简介目前，15N同位素丰度测量的方法有质谱法、15N发射光谱法、核磁共振法和中子活化分析等，其中应用较多的是质谱法。
质谱法是通过测量各种物质的原子或原子团的荷质比来确定被测原子或原子团的性质和质量，具有高灵敏度及精确度的特征，广泛用于同位素的实验室测量。但是这种方法所采用的仪器价格昂贵、系统庞大、操作复杂，样品制备繁琐，操作过程引入污染。且最终的结果只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态，这限制了质谱法在农业生产中的应用。
15N发射光谱法需要将样品转化成氮气(N2),然后用适当方法来激发氮分子发光， 得到氮的光谱。随着组成氮分子的氮原子质量数不同而使氮的光谱波长发生位移，利用这一现象来测定15N同位素丰度。与质谱法相比，15N发射光谱法不需要昂贵的仪器设备，操作相对简便，并能测定含氮量为微克级的样品。但是，有些元素的原子很难激发，而且有机物一般是大分子，组成复杂，激发后谱线杂乱难以分析，限制了 15N发射光谱法的应用。
核磁共振法是利用I-IO2兆赫的电磁波照射置于强磁场中的样品，样品中的某些原子核在特定的磁场强度下，与照射电磁波发生共振现象，产生强弱不同的吸收信号。以此来判明某些核素在分子中所处的位置及某些功能团上核素的相对数目。但是由于其造价非常昂贵，而且测定灵敏度较低，故极少用于15N同位素的肥料利用率研究。
中子活化分析是通过鉴别和测试样本因辐照感生的放射性核素的特征辐射，进行元素和核素分析的放射分析化学方法。该法的优点是灵敏度极高，准确度和精密度也很高， 可测定元素范围广；但同样存在仪器价格昂贵，分析周期较长，操作技术复杂的缺陷，在15N 同位素丰度的测量上鲜见报道。而且一般情况下，中子活化分析只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态。
②15N示踪尿素同位素快速、无损测量的必要性激光拉曼光谱是研究分子结构的重要工具，最适合研究同种原子的非极性键的振动， 所以N同位素分析具有拉曼活性，可以使用拉曼光谱获得拉曼谱图来进行研究分析。目前基于拉曼光谱技术的稳定同位素分析还处于初探阶段，大部分研究局限于光谱同位素效应的定性解析，少量的定量分析研究对象仅以金属化合物为主。而对于示踪肥料中15N示踪原子的拉曼光谱测量国内外还未见报道。然而，快速有效的检测示踪肥料中15N同位素丰度，对于研究肥料的有效性、肥料与作物间的关系、以及评价肥料对农业生态环境的影响有重要的意义。相对传统15N同位素丰度检测法的破坏性实验而言，拉曼光谱测量具有无损、 快速、痕量检测等优点，可以准确地对作物整个生长周期的氮吸收、利用的动态情况进行跟踪，并且可以全面反应肥料的吸收、利用、代谢规律，进而准确的评价肥料在作物生长过程中发挥的作用。同时，拉曼光谱技术能有效克服传统15N同位素分析法测量费用昂贵、分析测试耗时、采样数目偏少和检测周期长等缺陷。发明内容
本发明提出了 15N双标记尿素同位素丰度的拉曼光谱快速、无损检测方法，为快速有效地监测农业生产中尿素的吸收、利用情况以及动态变化规律提供理论依据，有望实现 15N双标记尿素同位素丰度的快速、低成本测量。
基于拉曼光谱的尿素同位素丰度的快速检测方法包括以下步骤步骤I.取1-10毫克待测15N双标记尿素直接放在载玻片中心，用盖玻片轻轻按压，使之表面平整，然后拿掉盖玻片，得到样本。
步骤2.将制备好的样本固定在显微拉曼光谱仪的显微镜镜头下方的载物台上， 调节显微镜的放大倍数，使样本能够在目镜视场内清晰成像，使用532nm半导体高功率激光器，激光功率为5mv，曝光时间为5s，曝光次数为3次，采集孔径为50 μ m,物镜为50倍， 在上述条件下采集样本的拉曼光谱，收集βδΟΟαιΓ1 34. 4cm1范围的拉曼光谱。
步骤3.基于样本在βδΟΟοπΓ1 34. 4CHT1范围的拉曼光谱，采用连续投影算法筛选出15N双标记尿素同位素丰度测量的指纹波段，分别为512cm—1，990cm—1，999cm—1，1700cm—1 和 3470CHT1，得到样本在波数分别在 512CHT1，990cm_1, 999cm_1, 1700cm-1 和 3470CHT1 处的拉曼光谱强度值，依次为A12、H、A-和為《ο ,利用这五个值计算同位素丰度Γ
权利要求
1.基于拉曼光谱的尿素同位素丰度的快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤 步骤I.取1-10毫克待测15N双标记尿素直接放在载玻片中心，用盖玻片轻轻按压，使之表面平整，然后拿掉盖玻片，得到样本； 步骤2.将制备好的样本固定在显微拉曼光谱仪的显微镜镜头下方的载物台上，调节显微镜的放大倍数，使样本能够在目镜视场内清晰成像，使用532nm半导体高功率激光器，激光功率为5mv，曝光时间为5s，曝光次数为3次，采集孔径为50 μ m,物镜为50倍，在上述条件下采集样本的拉曼光谱，收集βδΟΟαιΓ1 34. 4cm1范围的拉曼光谱； 步骤3.基于样本在3500CHT1 34. ^nT1范围的拉曼光谱，采用连续投影算法筛选出15N双标记尿素同位素丰度测量的指纹波段，分别为512cm—1，990cm—1，999cm—1，1700cm—1和3470cm \得到样本在波数分别在512cm \ 990cm \ 999cm \ 1700cm 1和3470cm 1处的拉曼光谱强度值，依次为馬12、、-^ido和，利用这五个值计算冋位素丰度I
全文摘要
本发明涉及一种基于拉曼光谱的尿素同位素丰度的快速检测方法。传统检测方法速度慢且操作复杂。本发明首先待测15N双标记尿素直接放在载玻片中心，用盖玻片轻轻按压，使之表面平整，得到样本。然后样本固定在显微拉曼光谱仪的显微镜镜头下方的载物台上，调节显微镜的放大倍数，使样本能够在目镜视场内清晰成像，使用激光器，收集3500cm-1～34.4cm-1范围的拉曼光谱。最后基于样本在3500cm-1～34.4cm-1范围的拉曼光谱，采用连续投影算法筛选出特定的指纹波段，得到在该波段处的拉曼光谱强度值，利用拉曼光谱强度值计算同位素丰度。本发明使用方便，可以快速、有效的测量植物15N示踪同位素丰度。
文档编号G01N21/65GK102928396SQ20121042251
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者李晓丽, 何勇, 罗榴彬 申请人:浙江大学