专利名称：一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法
技术领域：
本发明主要涉及一种细胞成像方法，特别提供了一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法。
背景技术：
细胞的荧光成像对于观察活细胞形态结构，监测细胞与外界分子相互作用，定量细胞内物质含量等方面的工作具有重要作用。
现有的细胞荧光成像方法主要有两大类一种采用以激光为激发光源的共聚焦扫描显微镜和全内反射显微镜进行操作。它们通常是直接利用激光器发射出的激光作为激发光源进行成像操作的。作为一种成熟的技术，以激光共聚焦扫描显微镜为核心设备进行细胞成像操作已经广泛的应用于生物学、医学等领域。在该技术中，被聚焦成衍射极限大小的激光光斑逐点扫描样品，激发出的荧光信号由点检测器收集，计算机重组后形成样品图像。但是该项技术存在造价高，难以动态实时监测等明显的不足。同时，采用全内反射显微镜作为核心设备进行细胞成像操作则是以高数值孔径的物镜为基础，激光在物镜表面发生全内反射，形成激发深度为几百个纳米的激发空间，从而可以实现对单个分子的成像，但是此项技术对细胞成像仅限于表面的几百纳米空间，给应用带来很大的局限性。
另一种是采用以汞灯为激发光源的荧光显微镜进行操作。选用荧光显微镜作为核心设备是一种非常普遍而常用的细胞荧光成像方法，但是由于汞灯谱线不单一，激发光源能量不够集中等因素，对于微弱信号的检测比较困难。

发明内容
本发明目的在于提供一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法。
本发明所述一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法，该方法以标记了染料的细胞为成像对象，细胞在激光照射下发出的荧光由显微镜物镜收集，经滤光片在CCD监测器上成像并得到细胞的荧光照片；其特征在于选用经过扩束后的激光作为细胞成像的激发光源。与汞灯相比较，激光具有单色性好、能量集中、成像清晰度高等优点；与单一的激光束直接作为激发光源相比较，扩束后的激光可以使检测和成像范围明显增大。
最终荧光成像照片中的细胞发光强度的确定方法是在荧光照片中，参照相对应的光学照片中的图像位置，每个细胞上取多个像素点的发光强度值，加和后作为荧光照片中该位置上细胞的发光强度；在每张荧光照片中取多个细胞计算平均发光强度作为细胞平均发光强度。
本发明所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法，其特征在于所述用于细胞成像的细胞浓度为104～106个/mL。浓度过低则视场内细胞量少，细胞抽样困难。浓度过高，易造成多个细胞重叠，不能反映单个细胞的荧光强度。
本发明所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于设备的光路部分依激光及成像荧光通过路径的先后顺序由激光器(1)、快门(2)、扩束镜(3)、反射镜(4)、棱镜(5)、显微镜物镜(6)、陷波滤光片(7)、带通滤光片(8)、CCD监测器(9)构成。
本发明所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于可以在激发光路上使用快门(2)控制激发时间，以方便在不同的具体情况下选用。
本发明所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于所述作为细胞成像激发光源的激光是经过扩束镜(3)扩束的，激光器(1)所发出的激光波长根据所用样品具体情况进行选择。激光功率密度为20mW/cm2～100mW/cm2。如果激光功率密度过低，细胞产生的荧光信号不能克服背景噪音，成像质量差；如果激光功率密度过高，易造成检测器饱和，直接影响到成像的质量。
本发明基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于所述经扩束后的激光通过棱镜(5)照射在滴于棱镜(5)靠近滤光片一侧表面的细胞样品上，预先标记好染料的细胞在激光照射下发出的荧光由显微镜物镜(6)收集，经陷波滤光片(7)和带通滤光片(8)后在CCD监测器(9)上成像。
本发明基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于所述光路部分可以通过调整反射镜(4)使激光光斑处于显微镜物镜(6)视场中心。
本发明基于激光诱导荧光的细胞成像方法，用于监测细胞与外界分子相互作用过程及定量细胞内物质含量。
本发明涉及一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法，提供了一种更方便地观察活细胞形态结构、监测细胞与外界分子相互作用以及定量细胞内物质含量的方法，本发明所用细胞成像方法造价低廉、检测精度和灵敏度较高、便于实现动态实时监测，而且在成像清晰度和成像范围之间取得了一种很好的处理效果。


图1光路示意图；图2细胞荧光照片；图3细胞光学照片；图4标记了染料的糖分子动态进入植物细胞的过程；图5相同孵育时间的S细胞的荧光强度与A细胞的荧光强度差对孵育时间的曲线。
具体实施例方式激光器所发出的激光波长根据所用样品选择，在以下两实施例中所用激光波长为488mm。用于细胞成像的细胞浓度约为105个/mL实施例1(染料流入细胞含量测定)传代培养的悬浮细胞转入离心管后，磷酸缓冲液洗涤两次，然后用加有Rho123(13.1pM)的磷酸缓冲液稀释离心沉淀的细胞。将细胞液置于37℃保温箱中孵育一定时间。离心后用含有转运蛋白抑制剂的磷酸缓冲液洗涤两次。使细胞浓度在105个/ml左右，作为用于荧光成像的样品。
参照细胞在光学照片中的位置，在荧光照片中每个细胞上取10个像素点的发光强度值，加和后作为该位置上细胞的发光强度。每张荧光照片中取10个以上的细胞计算平均发光强度。
选用敏感细胞(S，罗丹明转运蛋白低表达细胞株)和耐药细胞(A，罗丹明转运蛋白高表达细胞株)作为模式细胞，分别与不同浓度染料孵育一定时间后，离心，荧光成像。S细胞的荧光强度与A细胞的荧光强度差对染料浓度的曲线见图4。该曲线初步反映了细胞膜上的P-糖蛋白对底物Rho123的反应速度与底物浓度的关系，可以作为进一步计算反应动力学常数Km的基础。
实施例2(动态观察糖分子进入植物细胞的过程)取10uL培养的植物细胞液(细胞浓度在105个/ml左右，作为用于荧光成像的样品底物)滴于棱镜后，加1uL预先标记好染料的寡糖，仅在监测器曝光时间打开快门，每10秒钟记录一帧细胞荧光照片(见图4)。
图4中照片1，2为最初20秒的照片，植物细胞相对模糊。30秒后，细胞个体局部荧光强度增强。随着时间进一步增加，整个细胞全部发出荧光(见图4中的照片9)。这个过程表明了糖分子进入植物细胞的动态过程。
权利要求
1.一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法，该方法以标记了染料的细胞为成像对象，细胞在激光照射下发出的荧光由显微镜物镜收集，经滤光片在CCD监测器上成像并得到细胞的荧光照片；其特征在于选用经过扩束后的激光作为细胞成像的激发光源；最终荧光成像照片中的细胞发光强度的确定方法是在荧光照片中，参照相对应的光学照片中的图像位置，每个细胞上取多个像素点的发光强度值，加和后作为荧光照片中该位置上细胞的发光强度；在每张荧光照片中取多个细胞计算平均发光强度作为细胞平均发光强度。
2.按照权利要求1所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法，其特征在于所述用于细胞成像的细胞浓度为104～106个/mL。
3.一种用于权利要求1所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于设备的光路部分依激光及成像荧光通过路径的先后顺序由激光器(1)、快门(2)、扩束镜(3)、反射镜(4)、棱镜(5)、显微镜物镜(6)、陷波滤光片(7)、带通滤光片(8)、CCD监测器(9)构成。
4.按照权利要求3所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于所述作为细胞成像激发光源的激光是经过扩束镜(3)扩束的，激光器(1)所发出的激光功率密度为20mW/cm2～100mW/cm2。
5.按照权利要求3所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法专用设备，其特征在于所述经扩束后的激光通过棱镜(5)照射在滴于棱镜(5)靠近滤光片一侧表面的细胞样品上，预先标记好染料的细胞在激光照射下发出的荧光由显微镜物镜(6)收集，经陷波滤光片(7)和带通滤光片(8)后在CCD监测器(9)上成像。
6.按照权利要求3所述基于激光诱导荧光的细胞成像方法的专用设备，其特征在于所述光路部分可以通过调整反射镜(4)使激光光斑处于显微镜物镜(6)视场中心。
7.一种如权利要求1所述的基于激光诱导荧光的细胞成像方法，用于监测细胞与外界分子相互作用过程及定量细胞内物质含量。
全文摘要
本发明一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法，在激光照射下，标记染料的细胞发出荧光由显微镜物镜收集，经滤光片在CCD监测器上成像并得到细胞的荧光照片；其特征在于细胞成像的激发光源是经过扩束后的激光；在荧光照片中的发光强度值都是多个平均计算得到的结果。依激光及成像荧光通过路径的先后顺序，本发明对应专用设备的光路部分由激光器、快门、扩束镜、反射镜、棱镜、显微镜物镜、陷波滤光片、带通滤光片、CCD监测器构成。本发明提供了一种更方便地观察活细胞形态结构、监测细胞与外界分子相互作用以及定量细胞内物质含量的方法，本发明造价低廉、成像范围较大且成像清晰，检测精度和灵敏度较高、便于实现动态实时监测。
文档编号G01N21/64GK1712939SQ20041002079
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月22日 优先权日2004年6月22日
发明者盖宏伟, 王玉林, 赵小明, 马银法, 林炳承 申请人:中国科学院大连化学物理研究所