专利名称：超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除 剂的方法，具体涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法。
背景技术：
随着自由基医学的发展，人们认识到多种疾病与自由基有关。机体在代谢过程中 产生超氧阴离子自由基，过量的超氧阴离子自由基如不及时清除，在体内积累会产生细胞 毒性，破坏生物膜的结构和功能，引发多种疾病。因此，抗氧化药物在抗衰老和防治多种相 关疾病中具有重要的作用。天然药物中含有多种不同的抗氧化活性成分，越来越受到国内 外医药工作者的广泛关注。建立快速，可靠的超氧阴离子清除剂筛选方法能够为筛选抗衰 老药物奠定基础。现有的筛选超氧阴离子清除剂以及检测、定量超氧阴离子的方法主要有电子自 选共振法(YASUKO NODA, TAKAO KANEYUKI, AKITANEMORI, AND LESTER PACKER, J. Agric. Food Chem. 50(2002)，166-171)、化学发光法(hahanara Banu, Gillian Μ. Greenway, R-Alan Wheatley，Analytica Chimica Acta 541 (2005) 91-97)、紫外检测法(Bayer W F，FridovichI, 161 (1987) 559-566)，这些方法方便快捷，能够在一定程度上满足筛选要 求，但是光谱法筛选中容易产生假阳性和假阴性结果，而电子自旋共振技术在检测超氧 阴离子时由于超氧阴离子寿命短致使检测比较困难。质谱针对化合物质量电荷比进行检 测，精确度高，特异性好，同时结合超高液相色谱，能够对待检测物进行精确的定量(Ying Wang, Yamin Yao, Rui An, Lisha You, Xinhong Wang, Journal of Chromatography B, 877(2009)1820-1826)。

发明内容
本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法。 本发明可用于分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子体外清除率以及检测、定量超氧阴 离子的超高效液相色谱和质谱联用方法，具体涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴 离子清除剂的方法。超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法，包括以下内容以黄 嘌呤氧化酶-黄嘌呤酶促反应体系作为超氧阴离子产生体系，2-(4-碘苯)-3-(4-硝基 苯)-5-O，4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐为超氧阴离子捕集剂，用超高效液相色谱和质谱 联用对捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐进行定量， 通过计算捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的 变化计算出清除剂对超氧阴离子的清除率。本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法，包括以 下步骤所述的超高效液相色谱是指与高效液相色谱相比具有超高分离度、超高速度和超高灵敏度；所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物或单体；所述的超氧阴离子清除剂优 选天然产物提取物甘草水提物、单体」L茶素、染料木苷或小檗碱；(1)超氧阴离子产生体系缓冲液的配制酶促反应是生物体内产生超氧阴离子的主要来源之一，本发明所用的超氧阴离子 产生体系是黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤酶促反应体系，黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤产生超氧 阴离子；超氧阴离子产生体系缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升 盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，PH值为8. 9 ；(2)标准品的配制用水将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、3微摩尔/升、5微摩尔/升、7微 摩尔/升或10微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛 磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲月替染料；(3)对照品、空白样品和样品的制备对照品的制备反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2-(4-碘 苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微 升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供 超高效液相色谱和质谱联用测定；空白样品的制备总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤，加入终浓度25微 摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，加入800 微升的甲醇，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高 效液相色谱和质谱联用测定；样品的制备反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的超氧阴离子清除剂，终浓度100微摩 尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1 微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测对标准品检测采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤O)的 系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱联用检测，从总离子流图中提取2-(4-碘 苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图， 分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O， 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品 浓度为1微摩尔/升至10微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到 2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的线性方程y = ax+b 式中，y为所述的标准品2- (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；χ为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、 b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2 ；①超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪Waters ACQUITY ；色谱柱=WatersACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)；流动相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脱程序0 1分钟，20% A 60% A ;1 2分钟，60% A 100% A ;2 3分钟，100% A 20% A ;3 5分钟，20% A ；所指的百分比均为体积百分比；流速0. 2毫升/分钟；进样量5微升；②质谱条件质谱仪=Waters Xevo TQ ；离子源电喷雾(ESI)电离源负离子模式；毛细管电压2000伏特；去溶剂气氮气温度350摄氏度；去溶剂气氮气流速800升/小时；锥孔气氮气流速50升/小时；碰撞气氩气流速0. 15升/小时；第一个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为15. 0 ；离子能量为0. 5 ；第二个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为13. 5 ；离子能量为0. 5 ；以上所述质谱条件在检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- ，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；锥孔电压在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠 盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺 基苯)-2H-四氮唑钠盐时锥孔电压是20伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是 30伏特；碎裂能量和选择的碎片离子在检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯-5-(2，4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝 基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐时碎裂能量是20，碎片离子是332. 83 ；检测内 标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30，碎片离子是124. 08 ；对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检 测；(5)超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率超氧阴离子清除剂清除超氧阴离子从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基 苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂 2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐剩余量增加，还原产物水 溶性甲月替染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率可以通过捕集剂 2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量或产物水溶性甲月 替染料含量的变化进行评价；
本发明是利用 捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基苯)_2H_四氮 唑钠盐含量的变化进行计算的；分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照 品、空白样品和样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐 含量浓度，超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算I样品=(C样品-C对照)/(C空白-C对照)X100%式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；C#s为根据线性方程求得的样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升；(^砠为根据线性方程求得的对照品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺 基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的浓度，量纲为微摩尔/升；Cfie为根据线性方程求得的空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯-5-(2，4-二 磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升。有益效果本发明提供了超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物或单体。本发明用超高效液相色谱和质谱 联用的方法，用于分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子体外清除率以及检测、定量超 氧阴离子。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到超氧阴离子清除剂筛选中，样 品检测快速、准确，线性方程相关系数高于0. 998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精 确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，同时也克服了电子自旋共 振技术在检测超氧阴离子时由于超氧阴离子寿命短而遇到检测困难的问题，可用于超氧阴 离子清除剂筛选以及超氧阴离子的检测、定量；所述的超氧阴离子清除剂是儿茶素，得到20微摩尔/升儿茶素对超氧阴离子的清 除率I为67%。所述的超氧阴离子清除剂是染料木苷，得到20微摩尔/升染料木苷对超氧阴离子 的清除率I为48%。所述的超氧阴离子清除剂是小檗碱，得到20微摩尔/升小檗碱对超氧阴离子的清 除率I为34%。所述的超氧阴离子清除剂是甘草水提物，得到0. 1毫克/毫升甘草水提物对超氧 阴离子的清除率I为59%。


图1为实施例1中5微摩尔/升的标准品2- (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)_5_ (2，4_ 二 磺基苯)-2H-四氮唑钠盐(峰1)和1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠(峰2)的多反 应检测负离子模式的总离子流色谱图，信号强度为2. 56X 105。图2为实施例1中5微摩尔/升的标准品2-(4-碘苯)_3_(4_硝基苯)_5_(2， 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为 母离子627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为2. 53X 105。图3为实施例1中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离 子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度为1. 65X 105。 图4为实施例1中不同浓度2-(4_碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐标准品的标准曲线及线性公式。图5为实施例1中对照品中2-(4_碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子 627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为7. 99X 104。图6为实施例1中对照品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测 负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度 为 1. 53X 105。图7为实施例1中空白样品中2-(4_碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子 627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为2. 60 X IO50图8为实施例1中空白样品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检 测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强 度为 1. 68X 105。图9为实施例1中样品中2- (4-碘苯)-3- (4_硝基苯)_5_ (2，4_ 二磺基苯)_2H_四 氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子627. 81和碎 片离子332. 83，信号强度为1. IOXlO50图10为实施例1中样品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测 负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度为 1. 50X 105。图11为实施例2中样品中2-(4_碘苯)-3_(4_硝基苯)-5_(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子 627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为1. 33X 105。图12为实施例2中样品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测 负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度 为 1. 56X 105。图13为实施例3中样品中2-(4_碘苯)-3_(4_硝基苯)-5_(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子 627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为1. 80X 105。图14为实施例3中样品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测 负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度 为 1. 62X 105。图15为实施例4中样品中2-(4_碘苯)_3_(4_硝基苯)_5_(2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子 627. 81和碎片离子332. 83，信号强度为1. 21 X IO50图16为实施例4中样品中1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测 负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498. 08和碎片离子124. 08，信号强度 为 1. 57X 105。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例来描述发明。另外，实施例中所使用的材料除有特别说 明外，均可通过商业途径从市场上购买。实施例1本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法，其包括 以下步骤所述的超高效液相色谱是指与高效液相色谱相比具有超高分离度、超高速度和 超高灵敏度；所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物或单体；本实施例所述的超氧阴离子 清除剂为单体儿茶素；(1)超氧阴离子产生体系缓冲液的配制酶促反应是生物体内产生超氧阴离子的主要来源之一，本发明所用的超氧阴离子 产生体系是黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤酶促反应体系，黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤产生超氧 阴离子；超氧阴离子产生体系缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升 盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8. 9 ；(2)标准品的配制用水将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、3微摩尔/升、5微摩尔/升、7微 摩尔/升或10微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛 磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲月替染料；(3)对照品、空白样品和样品的制备对照品的配制反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2-(4-碘 苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微 升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供 超高效液相色谱和质谱联用测定；空白样品的配制总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤，加入终浓度25微 摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，加入800 微升的甲醇，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高 效液相色谱和质谱联用测定；样品的配制反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的儿茶素，终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤， 终浓度25微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠 盐，37°C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标 牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测对标准品检测采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱联用检测，从总离子流图中提取2-(4_碘 苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图， 分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以2-(4-碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2， 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品 浓度为1微摩尔/升至10微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到 2-(4-碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐的线性方程y = ax+b式中，y为所述的标准品2- (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基苯)_2H_四 氮唑钠盐与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；χ为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、 b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2 ；①超高效液相色谱的检测条件

超高效液相色谱仪Waters ACQUITY ；色谱柱=WatersACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)；流动相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脱程序0 1分钟，20% A 60% A ;1 2分钟，60% A 100% A ;2 3分钟，100% A 20% A ;3 5分钟，20% A ；所指的百分比均为体积百分比；流速0· 2毫升/分钟；进样量5微升；②质谱条件质谱仪=Waters Xevo TQ ；离子源电喷雾(ESI)电离源负离子模式；毛细管电压2000伏特；去溶剂气体氮气温度350摄氏度；去溶剂气氮气流速800升/小时；锥孔气氮气流速50升/小时；碰撞气氩气流速0. 15升/小时；第一个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为15. 0 ；离子能量为0. 5 ；第二个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为13. 5 ；离子能量为0. 5 ；以上所述质谱条件在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2，4_ 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；锥孔电压在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2，4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠 盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的检测2- (4-碘苯-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐时锥孔电压是20伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30 伏特；碎裂能量和选择的碎片离子在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝 基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐时碎裂能量是20，碎片离子是332. 83 ；检测内 标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30，碎片离子是124. 08 ；对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；(5)超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率超氧阴离子清除剂天然产物提取物或单体清除超氧阴离子从而导致与2-(4_碘 苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致 使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐剩余量增加， 还原产物水溶性甲月替染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率可以 通过捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐含量或产 物水溶性甲月替染料含量的变化进行评价；本发明是利用捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基 苯)-5-(2，4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的变化进行计算的；分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照 品、空白样品和样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐 含量浓度，超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算I样品=(C样品_(对照)/((空白-(对照)\100%
式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；C#s为根据线性方程求得的样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯-5-(2，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升；Cwm为根据线性方程求得的对照品中2-(4_碘苯)-3-(4_硝基苯_5_(2，4_ 二磺 基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的浓度，量纲为微摩尔/升；Cse为根据线性方程求得的空白样品中2-(4_碘苯)-3-(4_硝基苯)-5-(2，4_ 二 磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升。经计算得到20摩尔/升儿茶素标准品对超氧阴离子的清除率I为67%。结果参 见图1到图10。实施例2本实施例所述的超氧阴离子清除剂为染料木苷；所述的样品如下反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶， 在37°C孵育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的染料木苷，终浓度100微摩尔/升的黄 嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮 唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的 内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；其余的同实施例1 ；按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔/升染料木苷标准品对超氧 阴离子的清除率I为48%。图11和图12为实施例2中样品的提取色谱图。实施例3本实施例所述的超氧阴离子清除剂为小檗碱；所述的样品如下反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶， 在37°C孵育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的小檗碱，终浓度100微摩尔/升的黄嘌 呤，终浓度25微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑 钠盐，370C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内 标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1 ；按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔/升小檗碱标准品对超氧阴 离子的清除率I为34%。图13和图14为实施例3中样品的提取色谱图。

实施例4本实施例所述的超氧阴离子清除剂为甘草水提物；所述的样品如下反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶， 在37°C孵育30分钟，加入终浓度为0. 1毫克/毫升的甘草水提物，终浓度100微摩尔/升的 黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四 氮唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升 的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；其余的同实施例1 ；按照实施例1的检测步骤检测并计算得到0. 1毫克/毫升的甘草水提物对超氧阴 离子的清除率I为59%。图15和图16为实施例4中样品的提取色谱图。
权利要求
1.超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，包括以下 步骤所述的超高效液相色谱是指与高效液相色谱相比具有超高分离度、超高速度和超高 灵敏度；所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物或单体；(1)超氧阴离子产生体系缓冲液的配制所用的超氧阴离子产生体系是黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤酶促反应体系，黄嘌呤氧化酶催 化底物黄嘌呤产生超氧阴离子；超氧阴离子产生体系缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升盐酸， 1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8. 9 ；(2)标准品的配制用水将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、3微摩尔/升、5微摩尔/升、7微摩尔/ 升或10微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛磺熊去氧 胆酸钠作为内标；所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- ，4-二磺基苯)-2H-四 氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲月替染料；(3)对照品、空白样品和样品的制备对照品的制备反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37°C 孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2-(4-碘 苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微 升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供 超高效液相色谱和质谱联用测定；空白样品的制备总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤，加入终浓度25微摩尔 /升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，加入800微升的 甲醇，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相 色谱和质谱联用测定；样品的制备反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37°C孵 育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的超氧阴离子清除剂，终浓度100微摩尔/升的黄 嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮 唑钠盐，37°C反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的 内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测对标准品检测采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤O)的系列标准 品溶液进行超高效液相色谱和质谱联用检测，从总离子流图中提取2-(4-碘苯)-3-(4-硝 基苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求 峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1 微摩尔/升至10微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到2-(4-碘 苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的线性方程y = ax+b式中，y为所述的标准品2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑 钠盐与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；χ为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为 软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2 ；①超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪Waters ACQUITY ；色谱柱:ffaters ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)； 流动相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脱程序0 1分钟，20% A 60% A ;1 2分钟，60% A 100% A ;2 3分 钟，100% A 20% A ;3 5分钟，20% A ；所指的百分比均为体积百分比； 流速0. 2毫升/分钟； 进样量5微升；②质谱条件质谱仪Waters Xevo TQ ；离子源电喷雾(ESI)电离源负离子模式；毛细管电压2000伏特；去溶剂气氮气温度350摄氏度；去溶剂气氮气流速800升/小时；锥孔气氮气流速50升/小时；碰撞气氩气流速0. 15升/小时；第一个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为15. 0 ；离子能量为0. 5 ； 第二个四极杆的低端分辨率为3. 0 ；高端分辨率为13. 5 ；离子能量为0. 5 ； 以上所述质谱条件在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮 唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；锥孔电压在检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐 和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的检测2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2，4- 二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐时锥孔电压是20伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30 伏特；碎裂能量和选择的碎片离子在检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- ，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的检测2-(4-碘苯)-3-(4-硝 基苯)-5-O，4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐时碎裂能量是20，碎片离子是332. 83 ；检测内 标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30，碎片离子是124. 08 ；对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测； (5)超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率可以通过捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基 苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量或产物水溶性甲月替染料含量的变化进行计 算评价；分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空 白样品和样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓 度，超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算ι样品=(C样品-C对照)/(C空白-C对照)X 100%式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；c#s为根据线性方程求得的样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升；Cwm为根据线性方程求得的对照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐含量的浓度，量纲为微摩尔/升；Cse为根据线性方程求得的空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-O，4-二磺基 苯)-2H-四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升。
2.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物甘草水提物、单体儿茶素、染 料木苷或小檗碱。
3.如权利要求2所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物甘草水提物。
4.如权利要求2所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是单体儿茶素。
5.如权利要求2所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是染料木苷。
6.如权利要求2所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方 法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是小檗碱。
全文摘要
本发明提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法。通过检测与超氧阴离子作用前与作用后捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的变化，分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子清除率以及检测、定量超氧阴离子含量。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到超氧阴离子清除剂筛选中，样品用量少、检测快速准确，线性方程相关系数达到0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，克服了电子自旋共振技术由于超氧阴离子寿命短而检测困难的问题，用于超氧阴离子清除剂筛选及超氧阴离子的检测、定量。
文档编号G01N30/02GK102128884SQ20101057757
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者刘志强, 刘淑莹, 刘舒, 宋凤瑞, 邢俊鹏, 郑重 申请人:中国科学院长春应用化学研究所