专利名称：一种紫肉甘薯红色素有效组分的分离及检测方法
技术领域：
本发明属于医药保健领域，具体而言涉及到从紫肉甘薯总红色素中制备得到抗氧 化活性强、纯度高的组分及其在药品、保健品和食品添加剂中的应用。
背景技术：
目前应用于食品工业中的食用着色添加剂可分为人工色素和天然色素两大类。虽 然人工色素色彩多样、着色强、着色牢固、性稳价廉，但合成色素均只能着色而无营养价值， 有的对人体有害甚至存在潜在的致癌作用，因此限制了人工色素的使用种类和范围。据报 道，世界各国二十世纪五十年代有100多种人工合成色素，而截止到2008年美国只允许使 用9种、日本只允许使用11种、我国只允许使用9种，人工合成色素由于其固有的毒副作用 被逐步被淘汰。与此相反，天然色素因其具有使用安全，无毒副作用的优点而得到越来越 广泛的关注。在当今国际市场，天然色素被使用的年增长率都是在百分之十以上。虽然当 下还处于合成和天然两色素共存的局面，但后者代替前者成为食品着色剂新宠将是必然趋 势。而具有具着色和保健双重功能的天然色素得到逐渐认可和广泛推广。紫肉甘薯红色素是一种相对稳定，具有很强生物活性的健康色素，研究发现紫肉 甘薯里由于含有红色素而使其具有很强的抗炎症、抗突变、抗病毒、抗癌、降糖、保肝护肝、 预防和治疗心脑血管疾病等生物活性，而这些药理活性很多都是与其抗氧化活性相关的。 而组分纯度相对较高，结构清楚，生理活性效果显著的组分可望被开发成为新型的药品或 者保健品。红色素是自然界中最重要的一种水溶性色素之一，分布于27科72属植物中，尤以 葡萄皮、黑醋栗、草莓、树莓和越橘最为丰富。但是这些原料产量都很低。而甘薯作为是世 界十大粮食作物之一，其种植和产量都很大，紫肉甘薯也属于甘薯品种之一，其种植和管理 技术与普通甘薯无异，产量也与一般甘薯相当，所以紫肉甘薯作为一种红色素的原料来源 具有不可估量的广阔前景。我国对紫肉甘薯的种植有得天独厚的资源条件，一方面是具有 悠久的甘薯种植历史与成熟的管理技术；另一方面是拥有辽阔的国土面积和适宜的气候条 件。因此，建立一种对紫肉甘薯红色的抗氧化活性组分分离方法对紫甘薯及紫肉甘薯红色 素的开发和产业化有着很重要的指导意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种紫肉甘薯红色素抗氧化活性组分的分离、检测方 法。通过一次过反相硅胶柱，利用甲醇浓度从20%至40%的梯度洗脱而得到相对纯度在 40% -99. 8%纯度的11个组分。一种紫肉甘薯红色素抗氧化组分的分离、检测方法，所述方法是通过一次过反相 硅胶柱，利用甲醇浓度从20%至40%的梯度洗脱而得到相对纯度在40% -99. 8%纯度的11 个组分；所述反相硅胶是指在正相硅胶母核上接上8碳、18碳等脂肪酸链的硅胶，或以0DS、 RP-冠名的硅胶材料；所述方法的具体步骤如下
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(1)反相硅胶常规柱填装称取反相硅胶溶解于纯甲醇中，缓慢倒入玻璃层析柱 柱(径高比1 8-1 15)中，以层析柱阀门控制每分钟Iml的流速，流出甲醇；让硅胶均 勻的沉积填装入柱后，待液面高出硅胶面4cm左右时，关掉阀门，加压，让硅胶柱床平整，踏 实，硅胶柱高度控制在15cm，这是分辨率和高效率的最佳平衡点；(2)反相硅胶柱流动相平衡用3倍柱体积含20%甲醇和3%甲酸水溶液，以 1. 5-2. 5ml/min流速平衡硅胶柱；(3)分离工艺称取适量(装柱硅胶量的1/10-1/20)的紫肉甘薯总红色素于含 20%甲醇和3%盐酸的溶液中充分溶解后，缓慢加入平衡好的硅胶柱；然后甲醇从20%到 40%按一个百分点一个柱体积浓度继增冲洗硅胶层析柱，流速控制在2. Oml/min，紫肉甘薯 红色素在反相硅胶柱上有很明显的11个色素带呈现，收集时根据色带进行收集，得到11个 组分。本发明中上样的甲醇浓度和平衡柱子的浓度都是20%甲醇，提高了分离效率和缩 短了分离时间，是整个分离效率提高的基础。 (4)利用HPLC对11个组分进行纯度测试利用YMC反相硅胶柱，以甲醇-水为流 动相梯度洗脱，520nm下检测，以色谱图上峰个数和峰面积及百分比进行纯度计算，11个组 分的纯度在40%-99.8% .范围内。本发明引入了高效液相法的在520nm下峰个数和峰面 积对分离所得组分纯度检测，这是根据紫甘薯红色素的特征紫外吸收下进行的，实验数据 能能准确反映了紫甘薯红色素的含量和纯度。(5)抗氧化活性测试先以还原力为测试对象间接对11组分的总抗氧化能力进行 整体评估，然后选用以N为中心的DPPH自由基和以O为中心的羟基自由基来考察对自由基 的抑制能力，选用亚油酸来评价11组分的对脂质过氧化能力的评价。本步骤中体外抗氧化 能力测试所选用的4个体系，包括总还原能力、自由基清除和脂质过氧化抑制，基本上能概 括紫肉甘薯抗氧化活性的整体轮廓。本发明的另一个目的是提供该紫肉甘薯有效组分的抗氧化能力在药品、保健品和 食品添加剂中的应用。本发明中紫肉甘薯指属于甘薯种(Ipomoea batatas Lam)，是指地下块茎为紫色、 紫红色、红色的甘薯，或英文名以 purple sweet potato, purple-fresh sweet potato, purple-fresh potato的甘薯，或冠以黑甘薯、黑薯、朱薯、紫甘薯、紫心甘薯、紫肉甘薯、紫 薯之名的甘薯。本发明中的抗氧化体系以总还原能力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能 力和抗亚油酸脂质过氧化等四个体系的选择也在是发明的内容之一，这四个体系能比较综 合整体上反映抗氧化能力的特点。本发明中的抗氧化组分，指紫肉甘薯中经过反相硅胶分离得到的具有一定抗氧化 能力的混合物或单体化合物。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药品或食品 的质量控制。


图1-图11分别是组分1-组分11的分析色谱图
具体实施例方式实施例1(1)反相硅胶常规柱填装称取50g粒径为10_15um反相硅胶于50ml分析纯甲醇 中，充分混勻后，缓慢倒入径高比1 8-1 15 (如直径为2. 5cm长度20cm)的层析柱中， 以层析柱阀门控制每分钟Iml的流速，流出甲醇。用橡皮管敲打层析柱，让硅胶均勻的沉积 填装入柱后，待液面高出硅胶面4cm左右时，关掉阀门，用小型空气泵加压，继续敲打硅胶 层析柱，让硅胶柱床平整、踏实。硅胶柱高度控制在15cm。(2)反相硅胶柱流动相平衡用3倍柱体积含20%甲醇和3%甲酸水溶液，以 1. 5-2. 5ml/min流的速平衡硅胶柱。(3)分离工艺称取0. 5g紫肉甘薯总红色素粉末于含20%甲醇和3%甲酸的溶液 中，待充分溶解后，缓慢加入平衡好的硅胶柱。以甲醇-水洗脱，甲醇从20%到40%按一个 百分点一个柱体积浓度继增冲洗硅胶层析柱，流速控制在2. Oml/min左右，分离到11个组 分。(4)利用高效液相色谱法对11个组分的进行纯度测试。柱子选用0DS-C18，以甲 醇-水为流动相梯度洗脱，520nm下检测。以色谱图上峰个数和峰面积及百分比进行纯度计 算。结果见附图1-图11。(5)抗氧化活性测试总抗氧化能力的测定分别取0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、1. Oml的紫肉甘薯的11个部分，并用缓冲液稀 释至 2ml，配制浓度分别为 0. 01mg/ml,0. 04mg/ml、0. 07mg/ml、0. lmg/ml、0. 2mg/ml5 个浓度 梯度的维生素C溶液做标准对照品，样品溶液为空白对照。分别向上述样品中加pH 6.6的 磷酸盐缓冲液2. 5ml和1 %铁氰化钾溶液2. 5ml，混勻后于50°C放置20min后取2. 5ml加入 10%三氯乙酸溶液2. 5ml混合，再加入2. 5ml蒸馏水和0. 氯化铁溶液各2. 5ml混勻，静 置lOmin，在700nm处测定吸光度(A)，以溶剂代替试样作为空白对照吸光度AO。则总抗氧 化能力可以用AA来表示(ΔΑ = A-A0)。重复3次。DPPH体系下清除自由基试验在比色皿中加入2ml 1. 62X10_4mol/l的DPPH乙醇(95%体积分数)溶液，加 入用缓冲液稀释至2ml的样品液，反应30min后测定517nm处的吸光度值Ai。精确吸取 1. 08X10-4mol/L的DPPH ·溶液2ml与2ml无水乙醇混合均勻后，以相对应的溶剂为对照， 用分光光度计测定上述溶液在517nm处的吸光度值(AO)，重复3次，按下式计算清除率SR(% ) = [1-Ai/AO] X 100%其中Ai为甘薯色素组分、维生素C与等体积DPPH 溶液混合后在波长517nm处的 吸光值，AO为DPPH ·溶液与等体积溶剂混合后在波长517nm处的吸光度值。抗脂质亚油酸体系试验分别吸取0. 5ml紫肉甘薯的11个部分，并用缓冲液稀释至1ml，加入Iml含2. 51% (ν/ν)亚油酸的无水乙醇溶液，2ml 0.05M pH7. O的磷酸盐缓冲溶液，Iml蒸馏水后混勻， 密封于40°C恒温避光反应，空白对照以乙醇代替氧化剂。过氧化值的测定用硫氰酸铁 法取0. Iml亚油酸乳化液，依次加入4. 7ml75%的乙醇和0. Iml30 %的硫氰酸氨，再加入
50. ImlO. 02M溶解于3. 5%盐酸的氯化亚铁，快速混勻，反应3分钟后测定500nm吸光度值， 以A500nm表示亚油酸氧化程度，零时刻测定，以后每隔24h时间测定1次，连续测定7天，
重复3次。清除羟基自由基体系试验依次加入1. OmlO. 75mmol *L-1邻二氮菲无水乙醇溶液、2. Oml pH 7. 4的PBS缓冲 溶液和1. Oml双蒸水，充分混合后，加入1. OmlO. 75mmol -L-lFeS04溶液，边加边摇勻后，加 入1.0ml 0.032%H202，置于37°C水浴反应60min，以1 2 (体积比)的缓冲溶液和双蒸水 作参比液，在536nm测其吸光度值A损。按上述步骤，用1. Oml双蒸水代替1. Oml 0. 032% H202，在536nm测其吸光度A未；用样品(均用蒸馏水稀释至0. lmg/ml)代替1. Oml (粗提 物)双蒸水，以1 2 3体积的样品、缓冲溶液、双蒸水作参比，在536nm处测其吸光度A 样。按下式计算清除率。清除率=[(A样-A 损)/ (A 未-A 损)]X 100 %式中A样、A损和A未分别为加入样品、不加样品及不加样品和H2O2体系的吸光 度值。实验结论结果显示这11个组分均表现出非常强的亚油酸脂质过氧化能力和羟基自由基抑 制能力，对DPPH自由基抑制和总还原能力也很强。11个组分高效液相色谱法纯度分离结果 如下表1。在HPLC图谱中以530nm处出现的峰个数确定化合物个数，以峰面积确定含量， 以最大峰面积占该组分总峰面积百分比表示该组分主成分纯度。下表可以说明组分1主 成分纯度85 %，组分2主成分纯度99. 8 %，组分3主成分纯度99. 6 %，组分4主成分纯度 92% ；组分5主成分纯度为98. 7% ；组分6有八个峰，主成分纯度42% ；组分7含有三种 成分，主成分纯度94% ；组分8有九种主要成分，主成分纯度40%左右；组分9主成分纯度 80% ；组分10主成分纯度88% ；组分11主成分纯度纯度为85%以上。即总抗氧化力较好的是组分9、组分11、组分10、组分6、组分2，其中组分9、组分 11高于维生素C，清除DPPH活性较高的组分为组分8、组分7、组分9、组分11、组分10，清 除羟基自由基活性较高的组分为组分2、组分9、组分3、组分4、组分10、组分7，且11个组 分对亚油酸过氧化均有较好的抑制。综合分析，组分9、组分10、组分7、组分2活性相对较 闻。表 权利要求
一种紫肉甘薯红色素有效组分的分离及检测方法，所述方法是通过一次过反相硅胶柱，利用甲醇浓度从20％至40％的梯度洗脱而得到相对纯度在40％ 99.8％纯度的11个组分；所述反相硅胶是指在正相硅胶母核上接上8碳、18碳等脂肪酸链的硅胶，或以ODS、RP 冠名的硅胶材料；所述方法的具体步骤如下(1)反相硅胶柱填装称取反相硅胶溶解于纯甲醇中，缓慢倒入径高比1∶8 1∶15的玻璃层析柱中，以层析柱阀门控制每分钟1ml的流速，流出甲醇；让硅胶均匀的沉积填装入柱后，待液面高出硅胶面4cm左右时，关掉阀门，加压，让硅胶柱床平整、踏实，硅胶柱高度控制在15cm；(2)反相硅胶柱流动相平衡用3倍柱体积含20％甲醇和3％甲酸水溶液，以1.5 2.5ml/min流速平衡硅胶柱；(3)分离工艺称取装柱硅胶量的1/10 1/20的紫肉甘薯总红色素于含20％甲醇的3％盐酸 水溶液中充分溶解后，缓慢加入平衡好的硅胶柱；然后甲醇从20％到40％按一个百分点一个柱体积浓度继增冲洗硅胶层析柱，流速控制在2.0ml/min，紫肉甘薯红色素在反相硅胶柱上有很明显的11个色素带呈现，收集时根据色带进行收集，得到11个组分；(4)利用HPLC对11个组分进行纯度测试利用YMC反相硅胶柱，以甲醇 水为流动相梯度洗脱，520nm下检测，以色谱图上峰个数和峰面积及百分比进行纯度计算，11个组分的纯度在40％ 99.8％.范围内；(5)抗氧化活性测试先以还原力为测试对象间接对11组分的总抗氧化能力进行整体评估，然后选用以N为中心的DPPH自由基和以氧(O)为中心的羟基自由基来考察对自由基的抑制能力，选用亚油酸来评价11组分的对脂质过氧化能力的评价。
全文摘要
本发明提供了一种紫肉甘薯红色素有效组分的分离及检测方法，通过反相硅胶逐层析分离、洗脱和浓缩干燥，将紫肉甘薯总红色素分离为11个纯度很高的主组分或单体。对这11个组分进行HPLC分析，计算组分纯度，利用体外抗氧化实验测试组分抗氧化活性。根据HPLC法对组分纯度分析，组分中主要化合物的纯度在40-99.9％之间，体外抗氧化活性能力测试利用总还原能力、DPPH自由基抑制、羟基自由基抑制和亚油酸脂质过氧化抑制能力等四个体系进行评价，本发明提供的紫肉甘薯红色素有效组分可在制备抗氧化药品、保健品及作为天然食品添加剂应用。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药品或食品的质量控制。
文档编号G01N30/89GK101923082SQ20101022663
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者付玉凡, 廖志华, 谌金吾, 陈敏, 魏文丽 申请人:西南大学